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Um estudo sobre a morfometria intestinal em frangos de corte, com foco na avaliação da altura e largura de vilos e criptas, contagem de células caliciformes e outras variáveis morfométricas. Os autores analisam a influência de diferentes fontes de fósforo na dieta dos frangos e sua relação com a morfologia intestinal. O estudo inclui a descrição de métodos de coleta e medição, análise estatística e discussão de resultados.
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
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Autora: Marta Silvia Gava Dissertação aprovada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinária, na especialidade de Sanidade Avícola. Orientador: Prof. Dr. Carlos Tadeu Pippi Salle Co-Orientador: Dr. Lucas Brunelli de Moraes
Marta Silvia Gava Autora: Marta Silvia Gava Dissertação aprovada como requisito parcial para obter o título de Mestre em Ciências Veterinária, na especialidade de Sanidade Avícola. Orientador: Prof. Dr. Carlos Tadeu Pippi Salle Co-Orientador: Dr. Lucas Brunelli de Moraes
Aprovada em 26 abril de 2012. APROVADA POR: Dr. Carlos Tadeu Pippi Salle Orientador e Presidente da Comissão Dr. Hamilton Luiz de Souza Moraes Membro da Comissão Dr. Sérgio José de Oliveira Membro da Comissão Dr. Luiz César Bello Fallavena Membro da Comissão
Em primeiro lugar agradeço a Deus pela existência! A minha família, que é tudo o que tenho de melhor! A Nação brasileira, por poder estudar na UFRGS e ser beneficiada com bolsa de estudos do Programa de pós-graduação. Aos familiares, amigos, colegas e professores que sempre me incentivaram em fazer o mestrado! Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Tadeu Pippi Salle, pela oportunidade da realização deste mestrado e toda sua dedicação e confiança, em mim depositadas! Ao meu co-orientador, Dr. Lucas Brunelli de Moraes, o qual me auxiliou desde o principio deste mestrado com seus conhecimentos e principalmente no trabalho com imagens fotográficas. Aos funcionários do CDPA, colegas, ex-colegas e amigos, em especial aos que me auxiliaram na execução do projeto e dissertação. Aos membros da banca examinadora, por disporem de seu tempo em função da avaliação da dissertação e defesa. A você, que está lendo esta e talvez eu não tenha citado! Mas teve sua participação de alguma forma! Meu muito obrigado a todos!
Brazilian poultry is one of the most technologically advanced industries in this country, with efficient production demanding maximum performance to the bird. Thus, there is a constant search by maintaining good health status of the birds, and the digestive diseases play a representative role. With the growing concern to the intestinal health of birds, several studies have been conducted involving the morphometry analysis of the intestine. This paper presents four different experiments. The first one evaluated three intestinal portions (duodenum, jejunum and ileum) of 15 birds, 13 days of age, in order to know how was the best cut in the intestine to obtain the highest number of viable villi for measurement. The intestines were collected both open and closed. The samples were cut in cross, lengthwise and hemicylinder sections; whereas in the open samples were only made cross sections. All samples were dried, impregnated in paraffin and evaluated the following items: number of observable fields and villi that were feasible to perform measurements. Experiment 2 was conducted with 40 birds, 42 days old, from these animals were collected jejunum portions. The intestinal lumen was washed with 10% buffered formalin and fixed in the same way as in the first experiment. After the lengthwise-curved section, histological slides were prepared and counted the number of goblet cells and measured various structures as height and width of villus, enterocyte and its core, microvilli height, crypt diameter and wall thickness. In Experiment 3 were used 20 birds (42 days old) to evaluate the effect of the time postmortem over intestinal morphology. The intestines sections were studied immediately after birds sacrifice (T1), 10, 20, 30 and 60 minutes after death. In Experiment 4 was included the application of the values of variables obtained in Experiment 2 in the formula suggested by Kisielinski et al (2002), to determine the intestinal absorption capacity, but it had just illustrative character. The result analysis of experiments 1 to 3 showed that jejunum is the intestinal portion with better results for morphometric analysis, especially when the intestine is collected closed and the cuts are done as lengthwise-curve sections. The morphometric analysis showed a huge variability; therefore it was decided to suggest relative values rather than absolute values for future studies. It was also observed that only the samples collected in less than 10 minutes postmortem are viable for the morphometric study, following the demanding protocol established in this study. Finally, we can say that the intestinal morphometric study requires a lot of care, both for obtaining the samples, and for the analysis of the measured variables.
Tabela 1 – Formas de coleta das amostras de intestino e a nomenclatura para as distintas formas de clivagem dos órgãos.............................................. 21 Tabela 2 – Grupos experimentais e os tempos de coleta após a morte dos animais................................................................................................. 33 Tabela 3 – Valores médios das contagens do número de campos de observação das amostras de intestino de frangos de corte com 13 dias de idade... 36 Tabela 4– Valores médios do número de vilos viáveis para medição das amostras de intestino de frangos de corte com 13 dias de idade.......... 37 Tabela 5 – Relação da largura de cripta pela altura do vilo................................. 38 Tabela 6 – Relação da altura do vilo pela largura do vilo..................................... 39 Tabela 7 – Relação da altura do enterócito pela largura do vilo........................... 40 Tabela 8 – Relação da altura de microvilo pela altura do enterócito..................... 41
2.1 Anatomia e fisiologia do trato digestório O sistema digestório dos animais possui quatro funções básicas, são elas a apreensão, a digestão, a absorção e a eliminação do alimento (KAY, 1998). O sistema digestório das aves divide-se em cavidade oral, esôfago, papo, proventrículo, moela, intestino delgado, cecos, cólon e cloaca. (ITO et al., 2009). A cavidade oral consiste de bico que surge no oitavo dia de incubação em formato de uma saliência córnea conhecida por diamante, língua, glândulas salivares e faringe. Sua função está relacionada à apreensão, escolha e ingestão do alimento (BOLELI et al ., 2008). O esôfago é um tubo relativamente longo, ele fica localizado entre a região orofaríngea e o estômago glandular. A parede ventro-lateral direita do esôfago apresenta um divertículo sacular, denominado de papo ou inglúvio, onde o mesmo tem a função primariamente de armazenar o alimento, em situações de escassez, o que não ocorre com aves que são alimentadas ad libitum (BOLELI et al ., 2008), e responde pela condução do alimento da faringe até o pro ventrículo. Para absorver e incorporar o alimento ao organismo, o mesmo deve ser quebrado em subunidades menores. Nas aves o início da digestão ocorre no estômago, que é dividido em duas partes distintas: O proventrículo (estômago glandular) e moela ou ventrículo (estômago muscular ou mecânico). O Pro ventrículo realiza secreção de enzimas e ácidos, esta secreção tem sua liberação estimulada pela presença de alimentos. Do proventrículo o alimento é impulsionado para a moela, cujas contrações rítmicas e fortes, são as responsáveis pela trituração do alimento ingerido (BOLELI et al ., 2008). O intestino delgado é porção mais longa do sistema digestório, sendo responsável pela digestão final do alimento e absorção dos nutrientes. A princípio considera-se o intestino delgado dividido em três regiões distintas (duodeno, jejuno e íleo) e que possuem estruturas histológicas características (BOLELI et al ., 2008; PIRLOT, 1976; MCLELLAND, 1975). O duodeno consiste de uma alça intestinal localizada logo após o ventrículo, sendo a mesma constituída de porção proximal descendente e uma porção distal ascendente. Sua região é facilmente distinguível pela posição do pâncreas entre as duas
porções da alça e também pelo seu maior diâmetro. A porção ascendente é onde ocorre abertura dos ductos biliares e pancreáticos, que conduzem os sucos biliar e pancreático para o interior da região do intestino delgado (BOLELI et al ., 2008; MCLELLAND, 1975). O jejuno é a região mais longa do intestino delgado (BOLELI et al. 200 8 ) disposto em várias alças espiraladas. No desenvolvimento in ovo, ele está ligado ao saco do vitelo, o qual possui nutrientes para o desenvolvimento da mucosa intestinal. Na eclosão, o intestino continua ligado ao anexo embrionário. A absorção do vitelo termina por volta de 6 a 7 dias pós-eclosão, em galinhas e frangos. Após reabsorção total do saco de vitelo, resta um divertículo curto e cego remanescente do pedículo do saco do vitelo chamado de divertículo de Meckel, que permanece ligado ao jejuno, sendo esse divertículo um divisor do jejuno em duas porções, proximal e distal, sendo a primeira bem maior que a segunda (BOLELI et al ., 2008; MCLELLAND, 1975). O divertículo de Meckel é frequentemente usado como divisor entre jejuno e íleo (Duke et al., 2006), no entanto, no presente trabalho foi adotado como esta estrutura sendo o divisor das porções do jejuno (MCLELLAND, 1975). O íleo é contínuo ao jejuno, sendo delimitado anteriormente pela posição paralela ao ápice do ceco e posteriormente pelo ponto de ligação íleo-cecal ao intestino, onde se situam os cecos direito e esquerdo, estendendo-se esses na maior parte de comprimento do íleo (BOLELI et al ., 2008; MCLELLAND, 1975). As glândulas anexas (fígado e pâncreas) facilitam ao intestino delgado as principais etapas químicas da digestão e absorção dos nutrientes. O fígado realiza estocagem de carboidratos, gorduras e vitaminas. Ele realiza a secreção de bile, que é conduzido pelo ducto hepato-entérico diretamente para o duodeno. O conteúdo biliar emulsifica as gorduras presente no intestino delgado, formando complexos hidrossolúveis, facilitando absorção lipídica e ação das enzimas do pâncreas. O pâncreas possui funções endócrinas que atua no controle de carboidratos e função exócrinas atuando na síntese de sais e enzimas digestivas (BOLELI et al ., 2008). O intestino grosso nas galinhas é composto de um par de cecos, cólon (reto), e é contíguo a cloaca ( BOLELI et al., 2008; MCLELLAND, 1975). Os Cecos cólicos são estruturas pares em frango de corte e possuem formato sacular, dispostos paralelamente ao íleo, seu ponto de inserção determina o final do intestino delgado e o início do grosso (DUKE et al ., 2006; MCLELLAND, 1975). Este é responsável pela digestão microbiana
musculares que compõe o intestino são: a camada circular (externa) e a longitudinal (interna) da muscular externa. Entre as duas há uma discreta camada de fibras elásticas, muitos vasos sanguíneos e plexos nervosos. A camada longitudinal as fibras envolve todo o intestino, exceto o ceco. Por último há a serosa ou membrana serosa caracterizada por um epitélio composto de células lisas e finas sobre uma fina camada de tecido conjuntivo frouxo que possui umas poucas e pequenas fibras elásticas. Nesta região os vasos sanguíneos e nervos se encontram e associam com a camada do mesentério. (HODGES, 1974; BOLELI, 2008). A mucosa do intestino é formada por uma camada de epitélio simples colunar (JUNIOR & BACHA, 2003 e HODGES, 1974), formada por um grande número de vilos, os quais além de variar o número, tamanho e forma de acordo com a região, e diminuindo de tamanho alargando-se gradualmente em direção aos cecos (JUNIOR & BACHA, 2003). A mucosa do intestino forma projeções ou protuberâncias de acordo com a região do intestino (HODGES, 1974). Os vilos são protuberâncias da lâmina própria no lúmen intestinal que servem para ampliar a digestão e área de absorção (YAMAUCHI, 2002). A mucosa do intestino delgado torna-se mais delgada no sentido do duodeno para o íleo, assim as vilosidades se tornam mais curtas e a profundidade das criptas diminui. As vilosidades possuem forma elipsóide, sendo cobertas por enterócitos com microvilos e células caliciformes (DUKES, 2006). As criptas intestinais, que são ductos levemente tortuosos e claustros, elas se abrem entre a base do vilo e a muscular da mucosa ( HODGES, 1974, JUNIOR & BACHA, 2003 ). As criptas intestinais são definidas claramente dias após a incubação incrementando o número de células e o tamanho das criptas (GEYRA et al , 2001; UNI et al 2000). As criptas do duodeno em aves jovens consistem de uma invaginação tubular aproximadamente com 260μm de comprimento e 60μm de diâmetro, sendo possível dividir as criptas em três áreas, sendo elas metade basal; meio da cripta este onde ocorre um desenvolvimento regulamente rápido do epitélio no local e por último a zona de diferenciação qual consiste da abertura da cripta na região basal da área do vilo, esta zona de diferenciação de células intestinais inicia um processo de diferenciação e maturação de células , sendo este um processo gradual ( HODGES,
Durante o desenvolvimento embrionário o epitélio intestinal forma invaginações e também se diferencia para formar vilos e criptas e depois ocorre a proliferação celular nos compartimentos nas criptas, envolvendo componentes na metade proximal do vilo bem diferenciados da metade distal do vilo, devido à diferenciação celular (GORDON et al 2008; SCOVILLE et al , 2008). Durante a incubação a cripta possui poucas células, e a invaginação não é completa, no entanto rápidas mudanças ocorrem após o nascimento, após 48 horas a invaginação se completa em todo o seguimento do intestinal delgado (GEYRA, 2001). O intestino delgado é a porção mais longa do sistema digestório, sendo responsável pela digestão final do alimento e absorção dos nutrientes. A mucosa intestinal apresenta os vilos que são constituídos por três tipos de células distintas: os enterócitos , as células caliciformes e as células enteroendócrinas (HODGES, 1975). A proliferação dos enterócitos no jejuno das aves também ocorre ao longo do vilos, diferente dos mamíferos que a mesma ocorre somente nas criptas (DIBNER, 2004). As células das criptas sofrem uma série de divisões mitóticas e vão migrando para o vilo e então diferenciam-se em 3 tipos de células com funções diferentes, onde temos os enterócitos que estão envolvidos com o estágio final da digestão de nutrientes, transporte absorção e regulação imune, já o outro tipo de células, as células caliciformes , secretam uma camada de muco protetora (POTTEN et al .,1990; SCOVILLE et al ., 1995) O terceiro tipo de célula é enteroendócrina que libera os hormônios da digestão (FASINA, 2010). Nas aves as células sofrem diferenciação enquanto vão migrando em direção ao ápice do vilo, e tornando-se células completamente funcionais em enterócitos ou células caliciformes ou enteroendócrinas, as mudanças que ocorrem são funcionais e estruturais, tendo os enterócitos uma vida em torno de dois dias, e trata-se do tecido de maior taxa de renovação celular. Esta diferenciação dos três tipos celulares pode dar origem a células responsáveis pela absorção, células produtoras de muco ou as células endócrinas. Isto depende da necessidade do intestino para desempenhar suas funções naquele momento (BOLELI et al , 200 8 ). Enterócitos são as células responsáveis pela digestão final do alimento e pelo transporte dos nutrientes a partir do lúmen. Estes nutrientes são captados pelos microvilos, os quais formam uma borda estriada e que pode alcançar 0,7μm de altura na região das criptas e 0,3μm na região dos vilos (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999; HODGES, 1974; DIBNER, 2004). Os enterócitos
microvilos aumentam a capacidade de absorção intestinal em torno de 14 a 40 vezes. As proteínas do esqueleto celular do bordo em escova estão posicionadas na parte apical das células epiteliais. Esta membrana apical contém enzimas que hidrolisam os dissacarídeos e dipeptídeos em monossacarídeos e aminoácido que são por sua vez absorvidos facilmente (JUNQUERIA & CARNEIRO, 1999). Os enterócitos apresentam um processo de maturação que ocorre durante o processo de migração das criptas para o ápice do vilo. Esta maturação depende da síntese de proteínas estruturais, as quais são codificadas pelo genoma das células intestinais. A dinâmica celular é um ponto chave na diferenciação e no número de células absortivas – “fenótipo madura” – dos vilos (THOMSON et al., 1996). A unidade funcional básica do intestino é a “cripta-vilo”, sendo que os enterócitos se proliferam na cripta e migram em direção ao ápice dos vilos onde sofrem processo de extrusão no final da sua vida útil. Cada vilo é suprido de células, geralmente, por três criptas, esse número é variável em cada espécie animal. A taxa de reprodução das células na cripta e a proporção de migração desses enterócitos são alteradas em vários estados fisiológicos ou patológicos (BOLELI et al, 2008). A migração de novas células ocorre simultaneamente com a continuidade das suas perdas ou extrusão das células mais velhas da região do topo do vilo, a substituição ocorre através da divisão mitótica das células das criptas em tempo normal de disposição das mesmas células, porém de acordo com UNI et al (1998) em animais jovens é mais rápido de que em animais velhos, variando esta reposição em 72 h até 4 dias de idade e 96 h em aves mais velhas Com o objetivo de avaliar a mensuração da altura das vilosidades e a profundidade de criptas intestinais em frango de corte, submetidos à dieta de engorda e abate, além de suplementados com diferentes fontes alternativas de fósforo, ALVARENGA et al (2004) coletaram anéis de 0,5cm de comprimento de cada um dos segmentos do intestino delgado de aves. Esses anéis foram fixados em formol a 10% por 48 horas. Após a fixação, os intestinos foram incluídos em parafina, sendo cinco cortes de cada fragmento (7μm) obtidos e corados com hematoxilina e eosina. Em cada corte histológico foram mensuradas as alturas de cinco vilosidades e a profundidade de cinco criptas intestinais.
Okamoto et al (2009) estudaram as alterações histopatológicas na mucosa intestinal de pintos, causada por Salmonella Enteritidis, logo após o tratamento com Lactobacillus. Os pesquisadores obtiveram amostras de 1cm de comprimento da porção proximal do duodeno, sendo estas coletadas abertas pela margem mesentérica e depois estendidas pela túnica serosa e fixadas em solução de Bouin (durante 1 8 horas). Os materiais foram recortados, lavados com álcool etílico 70% e sofreram processamento histológico para inclusão em parafina. Seis lâminas foram confeccionadas a partir de cortes semi-seriados de 5μm de espessura, com um intervalo de seis cortes entre os selecionados. Os materiais foram corados segundo a técnica de hematoxilina e eosina, procederam-se cinco medidas de comprimento das vilosidades de cada corte, totalizando trinta medidas por ave. Em trabalho semelhante, com o objetivo de analisar os efeitos da toxoloplasmose sobre a morfometria da parede intestinal e a dinâmica de mucinas secretadas no íleo de frangos, Shiraishi et al (2009) utilizaram 16 frangos de corte, dos quais foram coletadas amostras de íleo. Os intestinos foram lavados com solução de NaCl 0,9% e fixados em solução de Bouin. As amostras foram desidratadas e incluídas em parafina, obtendo-se cortes de 4μm de espessura e corados com hematoxilina e eosina. Foram utilizadas imagens de 10x para medir a espessura total de parede intestinal, com objetiva de 20x mediu-se a espessura da túnica muscular e túnica mucosa e, por fim, com o aumento de 40x mediu-se a espessura da muscular da mucosa. No total foram realizadas 80 medidas de cada estrutura, distribuídas uniformemente em toda circunferência intestinal das amostras. Nos trabalhos supracitados os autores não informam o tempo decorrido para coleta dos intestinos, assim como não descrevem os critérios para a medição das alturas dos vilos e da profundidade das criptas. Estes parâmetros podem ser importantes para uma ideal observação e medição das estruturas intestinas. Maiores detalhes metodológicos foram descritos por Fukauama et al (2005), os quais avaliaram os efeitos da inclusão de extrato de orégano como aditivo promotor de crescimento nas rações sobre o desempenho de frango de corte, as característica anátomo-fisiológica do trato gastrointestinal (altura de vilosidade, profundidade de cripta e suas relações). Os pesquisadores trabalharam com 1440 frangos de corte e coletaram segmentos de intestino com aproximadamente 1,5cm de comprimento. As amostras foram cuidadosamente coletadas e lavadas imediatamente em água destilada,
