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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
ANÁLISE DE RESÍDUOS DE SULFONAMIDAS EM ALIMENTOS POR
ELETROFORESE CAPILAR E ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Rodrigo Hoff
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFRGS como um dos requisitos para a obtenção do título de Mestre.
Orientador: Tarso Benigno Ledur Kist
Porto Alegre, agosto de 2008.
A parte experimental deste trabalho foi desenvolvida em duas etapas. A primeira delas, envolvendo eletroforese capilar, foi executada no Laboratório de Desenvolvimento de Métodos, do Departamento de Biofísica, Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
A fase de desenvolvimento de métodos extrativos e análises por espectrometria de massas foi realizada no Laboratório Nacional Agropecuário de Porto Alegre – LANAGRO/RS, órgão do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
O mestrando conciliou o desenvolvimento deste trabalho com suas atividades como analista e, desde novembro de 2007, como responsável técnico pelo Laboratório de Análise de Resíduos de Pesticidas e Medicamentos – LRPM – do LANAGRO/RS.
As amostras utilizadas neste trabalho foram obtidas a partir de coletas realizadas pelo Serviço de Inspeção Federal do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, dentro das atividades rotineiras do Plano Nacional de Controle de Resíduos.
Agradecimentos
Ao orientador e amigo Dr. Tarso B. L. Kist.
À Comissão de acompanhamento Dr. Carlos Termignoni e Dr. Giancarlo Pasquali.
Aos colegas do Laboratório de Métodos, em especial a Gabriel Rübensam, Ana Paula Vieira e Paulo Trenhago.
Aos colegas do LANAGRO/RS, em especial a Luciane Hauschild, Beatris Kuchenbecker, Fabiano Barreto, Cristina Ribeiro, Adir Velho Martins, Soraya Marredo, Carlos Eugênio Soto Vidal, Elton Massarolo, Suzana Fonseca e Jessica Melo.
À Coordenação e Administração do LANAGRO/RS, em especial a João Mathias Becker, Aguinaldo Parussolo e João Vianna de Freitas.
Índice Remissivo
6. Capítulo I – Abordagem racional para estabelecimento de prioridades no
- Índice de figuras.................................................................................página
- Índice de tabelas.................................................................................página
- Lista de abreviaturas e símbolos......................................................página
- Resumo................................................................................................página
- Introdução geral..................................................................................página
- 5.1. Histórico..........................................................................................página
- 5.2. Mecanismo de ação........................................................................página
- 5.3. Mecanismo de resistência bacteriana às sulfonamidas..................página
- 5.4. Propriedades físico-químicas das sulfonamidas.............................página
- 5.5. Propriedades farmacológicas da sulfonamidas...............................página
- 5.5.1. Sulfonamidas usadas como anti-sépticos.............................página
- 5.5.2. Sulfonamidas utilizadas em infecções urinárias....................página
- 5.5.3. Sulfonamidas de uso oftálmico..............................................página
- 5.5.4. Sulfonamidas em associação................................................página
- fármacos...................................................................................página 5.5.5. Sulfonamidas em associação com outras classes de
- 5.5.6. Sulfonamidas para infecções gastrintestinais.......................página
- 5.5.7. Uso de sulfas como outras classes farmacológicas..............página
- 5.5.8. Espectro de ação das sulfonamidas......................................página
- 5.5.9. Aspectos farmacocinéticos das sulfonamidas.......................página
- 5.6. Uso das sulfonamidas na produção animal....................................página
- 5.6.1. Avicultura...............................................................................página
- 5.6.2. Suinocultura...........................................................................página
- 5.6.3. Bovinocultura.........................................................................página
- 5.7. Ações regulatórias...........................................................................página
- 5.8. Objetivos.........................................................................................página
- ambiente..............................................................................................página monitoramento de resíduos de sulfonamidas em alimentos e no
1. Índice de figuras
Figura 1. Estrutura química de princípios ativos derivados da sulfanilamida. Figura 2. Rotas metabólicas onde ocorre a ação interferente das sulfonamidas na célula humana. Figura 3. Comportamento anfotérico das sulfonamidas. Figura 4. Principais mecanismos enzimáticos de metabolização das sulfas.
2. Índice de Tabelas
Tabela 1. Produtos metabólicos gerados na excreção de algumas sulfonamidas. Tabela 2. Classificação das sulfonamidas baseada na concentração plasmática obtida após administração oral de uma dose terapêutica em não-ruminantes.
4. Resumo
O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento e validação de um método analítico preciso, rápido, simples e de baixo custo para o monitoramento de resíduos de sulfonamidas em alimentos, que fosse capaz de ser aplicado a um grande número de amostras de distintas matrizes e que fornecesse dados quantitativos e confirmatórios da possível presença desta classe de fármacos em alimentos. O trabalho foi realizado em quatro fases distintas. A fase I consistiu na tabulação e estudo de todas as apresentações de sulfonamidas disponíveis no mercado de produtos de uso veterinário no Brasil. Da análise farmacológica e farmacotécnica deste universo, delineou-se uma abordagem para prioritização para sulfas que podem, potencialmente, permanecerem como resíduos em alimentos destinados ao consumo humano. Na fase II, desenvolveu-se um protocolo de extração, purificação e concentração de sulfonamidas a partir de matrizes de origem animal – carne, pescado e leite. Distintas abordagens analíticas foram testadas e comparadas quanto à rapidez, recuperação de analito, repetibilidade e custo. A fase III tratou do desenvolvimento de um método de análise por eletroforese capilar com detecção por fluorescência induzida a laser para análise qualitativa e quantitativa de sulfonamidas. Na fase IV, desenvolveu-se um método confirmatório para a presença de sulfas em alimentos utilizando a espectrometria de massas acoplada à cromatografia líquida. O método confirmatório foi validado de acordo com a
Diretiva da Comunidade Européia EC/657/2002, que estabelece os critérios mínimos de desempenho para métodos de análise de resíduos de drogas veterinárias em alimentos. Amostras de alimentos de origem animal contendo níveis de sulfonamidas acima de 10 ng g-1^ puderam ser analisadas, quantificadas e confirmadas através da aplicação do método desenvolvido.
5. INTRODUCÃO GERAL
Sulfonamidas são uma classe de agentes antimicrobianos que apresentam um considerável uso na medicina humana e veterinária. As sulfonamidas, ou simplesmente sulfas, foram os primeiros agentes a serem utilizados para o tratamento de infecções bacterianas (Lofflin, 2005). Durante a década de 1940 as sulfas foram consideradas fármacos de escolha para o tratamento de infecções bacterianas em humanos. Hoje, seu uso é limitado ao tratamento de doenças muito específicas na medicina humana, como infecções do trato urinário. Não obstante, as sulfas ainda são bastante utilizadas na medicina veterinária. Quando que usadas de forma equivocada, a presença destas sulfas na forma de resíduos em produtos de origem animal apresentam um potencial toxicológico relevante, capaz de desencadear reações alérgicas (Blanchflower and Rice, 1988). Além disto, muitas pessoas apresentam hipersensibilidade a resíduos de fármacos e níveis sub-terapêuticos de substâncias com ação bactericida e/ou bacteriostática podem propiciar e acelerar processos de pressão seletiva, desencadeando o surgimento de resistência bacteriana (Kemper, 2008; Passantino, 2007). Além disto, estudos de pesquisadores do NCTR - National Center for Toxicological Research – indicam que a sulfametazina pode apresentar atividade carcinogênica sobre a glândula tireóide (Fullerton et al., 1987; Littlefield et al., 1989; Littlefield et al., 1990).
5.1 Histórico
As sulfas foram sintetizadas pela primeira vez em 1908 por Gelmo et al. (Drews, 2000) como produto da busca por novos azocorantes. Seguindo a linha deste trabalho, Hoerlein et al. (Rubin, 2007) descobriram que corantes contendo o grupamento sulfanil apresentavam afinidade por proteínas da seda e da lã. Tal achado levou a descoberta por Eisenberg, em 1913, de que a crisolidina, um dos azocorantes estudados, possuía pronunciada ação bactericida (Iyer, 2008). Entretanto, somente em 1932 as propriedades terapêuticas das sulfas foram determinadas: Dogmagk et al. (DOMAGK, 1965) ao triar vários corantes, encontraram uma considerável atividade antibacteriana in vitro no Prontisil, ((p- [2,4-diaminofenil) azo]sulfanilamida). Logo em seguida, descobriu-se que tal atividade se devia a liberação, in vivo , da sulfanilamida, sendo esta portanto a fração ativa da molécula do Prontisil (Iyer, 2008). O trabalho de Dogmagk levou a uma intensa atividade de pesquisa com a sulfanilamida e diversas sulfas foram sintetizadas a partir dela nos anos 1930. Um grande número destes novos compostos demonstrou possuir atividade antibacteriana contra uma variedade de streptococci e pneumonococci. Várias sulfapirimidinas introduzidas a partir de 1941 (Miert, 1994) aliavam uma potente atividade antibacteriana com toxicidade inferior às sulfas sintetizadas previamente. A partir deste ponto, muitas novas sulfas foram sintetizadas. Atualmente, cerca de 5000 diferentes compostos desta classe são conhecidos (Connor, 1998; Struller, 1968), mas somente pouco mais de 30 tem efetivo emprego, seja na medicina humana como nas ciências veterinárias. A partir do núcleo químico formado pelos grupamentos anilina e ácido
biossíntese do AFH2 e devem obter o mesmo na forma de folato através de fontes exógenas componentes da dieta alimentar. O folato obtido pela ingesta atravessa a membrana celular por um mecanismo de transporte ativo e é convertido em FAH2 no meio intracelular (Connor, 1998). As bactérias, no entanto, não tem meios de obter este FAH2 pré-formado e necessitam sintetizar este componente através de uma reação que envolve PABA, 2-amino-4-hidroxi-6-hidroxilmetil dihidropteridina difosfato e ácido glutâmico. As sulfonamidas são análogos do PABA e, portanto, exercem seu efeito através do papel de antimetabólito. As sulfas interferem no crescimento bacteriano por afetar a produção de AFH2 de duas maneiras: inibição enzimática e por formação de pseudo-metabólito, sendo a inibição enzimática o principal modo de ação. A Figura 2 mostra as rotas de produção de AFH2. As sulfas interferem na rota metabólica no momento da conjugação via ação enzimática do PABA ou ácido para-aminobenzoilglutâmico (PABG) com 2-amino-4-hidroxil-6-hidroximetil dihidropteridina difosfato (AHHDD) ambas necessárias à produção de FAH2. A ação antimetabólica também se origina da condensação das sulfonamidas com o AHHDD. O produto desta condensação não consegue participar da biossíntese necessária para a produção de FAH2, o que resulta em atividade bacteriostática. Um aspecto adicional importante do mecanismo de ação da classe das sulfas é que elas não são agentes bactericidas. Pela interferência na produção normal de FAH2, a reprodução bacteriana é encerrada e tem fim a multiplicação do microorganismo dentro do hospedeiro, mecanismo denominado como bacteriostático a partir do conhecimento do mecanismo de ação das sulfas (Bernstein and Lorincz, 1981).
Figura 2. Rotas metabólicas onde ocorre a ação interferente das sulfonamidas na célula humana
De modo geral, pode-se considerar, para bactérias sensíveis às sulfas sistêmicas de rápida ação, uma Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 8 a 32 μg
mL-1, sendo que bactérias com CIM igual ou acima de 64 a 128 μg mL-1^ são consideradas resistentes (Korolkovas and França, 2002). Geralmente a resistência a uma determinada sulfa implica em resistência cruzada a todos os compostos do grupo. As medidas recomendadas para evitar o surgimento desta resistência consistem basicamente em abolir o uso indiscriminado das sulfas, iniciar a terapia precocemente na evolução de infecções agudas e estabelecer e manter concentrações eficazes de droga nos tecidos do animal em tratamento (Booth and McDonald, 1992). Recentemente, vem sendo sugerido que a manutenção da homeostase entre a microbiota comensal e o hospedeiro tem um importante papel na resposta imune deste último (Kitano and Oda, 2006). Embora as ferramentas disponíveis para a verificação destes apontamentos, como os recentes desenvolvimentos em metagenoma (ou ecologia de sistemas), estejam ainda muito prematuras, especula-se que o impacto da presença de resíduos de substância com ação bactericida e bacteriostática poderia causar ação impactante sobre a microbiota humana normal e este desequilíbrio não desejado e inconsciente poderia ser motivo causal de alergias leves até desordens imunológicas de diversas classes (Venter et al., 2004).
5.4 Propriedades físico-químicas das sulfonamidas
Sulfas, como resultado das propriedades indutivas do grupamento SO 2 , são compostos que exibem comportamento anfotérico, por possuírem grupamentos químicos com caratér ácido e básico, o que permite que em determinadas faixas de pH estas moléculas se comportem como zwitteríons (Figura 3), ou seja, capazes de manter carga formal positiva e negativa. É bem estabelecido que este comportamento desempenha um importante papel na atividade antibacteriana das sulfas. Trabalhos de Korolkovas, bem como de Struller, determinam que a relação entre a constante de dissociação ácida e a atividade bacteriostática descreve um arco parabólico apresenta um máximo entre pKa 6 e 7,5 (Korolkovas and Tamashiro, 1973, 1974a, b). Estes autores concluem que a forma iônica do fármaco é mais ativa do que forma neutra, mas que sulfas demasiadamente ácidas sofrem diminuição da atividade pelo fato do grupo SO 2 ser menos eletronegativo do que nas sulfas moderadamente ácidas (Struller, 1968).
Figura 3. Comportamento anfotérico das sulfonamidas
Forma catiônica Forma neutra Forma aniônica
