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Um estudo sobre a resposta ovariana do peccari-collare (pecari tajacu) sob dois protocolos hormonais diferentes: swine dose (sd) e allometric dose (ad). O documento aborda a análise do desenvolvimento folicular e a expressão de receptores de fshr e lhcgr, além de tgfβr-1, alk-5, bmpr1a e bmpr2 em folículos, cortex e corpus hemorrhagicum. O documento também discute a flexibilidade do peccari-collare em relação aos habitats e sua distribuição geográfica.
Tipologia: Notas de estudo
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EXPRESSÃO GÊNICA OVARIANA EM CATETO ( Pecari tajacu Linnaeus, 1758) APÓS TRATAMENTO HORMONAL COM GONADOTROFINAS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do titulo de mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientador: Profa. Dra. Luciana Magalhães Melo
A Deus, ao meu marido, Adailton, aos meus pais, Acácia e José e aos meus irmãos, Fábio e Leonardo.
George por alegrarem nossa família. À minha família em geral, cada um com sua contribuição na minha vida. Às minhas amigas/irmãs Aline Saraiva e Alauana Roriz, pela ternura e apoio. Aos meus amigos de graduação Alison Rebouças, Katharine Gurgel e Thaís Lima por sempre fortalecerem nossa amizade. À minha amiga Andréa Mesquita, coordenadora do Projeto Casa Verde, por me introduzir na causa animal e colaborar com meu crescimento espiritual. Aos animais experimentais que tornaram possível a realização do presente trabalho. Aos integrantes do LFCR, por suas diversas contribuições. Agradeço aos colegas de laboratório Thaís Souza, Lívia Magalhães, Iana Sales, Fabiana Brandão, Samara Souza, Camila Muniz, Jeferson Freitas, Eduarda Temporal, Yara Diógenes, Beatriz Mano, Mirelly Alves, João Victor Albuquerque, Aniele Bezerra, Maurício Vieira, Antônio Carlos Monreal, Dowglish Chaves, Thiago Damasceno e Jenin Cortez, pelo companheirismo, bons momentos e apoio nas horas difíceis.
Dentre as espécies de animais silvestres na América Latina, o cateto ( Pecari tajacu , Linnaeus 1758) vem despertando interesse comercial. Consequentemente, a caça indiscriminada associada à destruição de habitats, resulta numa diminuição do número de indivíduos de vida livre. Assim, o uso de biotécnicas reprodutivas pode gerar melhorias na manutenção dessa espécie em cativeiro e aumentarar sua produtividade, reduzindo sua caça e destruição de seus habitats. O presente estudo objetivou aplicar tratamentos hormonais de sincronização de estro em fêmeas de cateto adaptados de espécies domésticas. Assim, fêmeas foram estimuladas com dois protocolos hormonais de associação de gonadotrofinas, Dose Suína (SD) e Dose Alométrica (AD), e os tratamentos foram comparados quanto ao desenvolvimento folicular ovariano e à expressão gênica dos receptores para gonadotrofinas (FSHR e LHCGR) e dos genes que codificam o receptor de fator de crescimento transformador beta-1 ( TGFβR-1 ou ALK-5), receptor de proteína morfogênica óssea tipo 1A ( BMPR1A ou ALK-3 ), receptor de proteína morfogênica óssea tipo 2 ( BMPR2 ), além dos genes de referência gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ( GAPDH ), histona 2A ( H2A ) e a proteína de transcrição ubiquitinamente expressa ( UXT). A resposta ovariana foi analisada quanto ao número de folículos antrais totais e classificados em três categorias quanto ao tamanho: P (<3mm), M (3-5mm) e G (>5mm). A taxa de ovulação foi registrada pelo número de corpos hemorrágicos (CH). A população pré-antral foi representada por fragmentos de córtex ovariano. A expressão dos referidos genes foi analizada por qPCR nos folículos antrais P, M, e G, em córtex e em CH. A quantidade de folículos P, M ou G foi semelhante (P>0,05) entre SD e AD. Entretanto, o tratamento SD produziu folículos G significativamente maiores (P<0,05) do que P ou M. Adicionalmente, esse tratamento produziu folículos G maiores do que o protocolo AD. Todos os genes estudados apresentaram abundância similar (P>0,05) em córtex e folículos P, M e G, comparando-se os tratamentos SD com AD. Os folículos grandes expressaram menos mRNA de FSHR (P<0,05) que córtex (SD) ou folículos pequenos (AD). Em relação ao LHCGR , a categoria M mostrou maior expressão (P<0,05) do que folículos P (no grupo SD) ou do que córtex (em AD). Os genes TGFβR-1 , BMPR1A e BMPR2 apresentaram menor expressão (P<0,05) em folículos M, quando comparado ao P (no grupo SD) ou ao córtex (em AD). Quanto à taxa de ovulação, o número de CH não foi alterado pela dose hormonal (P>0,05), sendo 4,00±1,17 e 2,50±0,43, para SD e AD respectivamente. Além disso a expressão de LHCGR foi similar nos CH (P>0,05) produzidos pelos tratamentos.
Among the species of Latin America wild animals, the collared peccary ( Pecari tajacu , Linnaeus 1758) has aroused commercial interest. Consequently, indiscriminate hunting associated with habitat destruction results in a decrease in the number of free-living individuals. Thus, the use of reproductive biotechniques may generate improvements in the captive management and increase its productivity, reducing hunting and destruction of this species‟ habitats. The present study aimed to apply hormonal treatments for estrus synchronization adapted from domestic species in peccary females. Therefore, females were stimulated with two hormonal protocols of association of gonadotropins, Swine Dose (SD) and Allometric Dose (AD), and treatments were compared for ovarian follicular development and gene expression of gonadotrophin receptors ( FSHR and LHCGR ) and ( TGFβR-1 or ALK-5 ), bone morphogenic protein receptor type 1A ( BMPR1A or ALK-3 ), bone morphogenic protein receptor type 2 ( BMPR2 ), besides housekeeping genes glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH ), histone 2A ( H2A ) and ubiquitinously expressed transcription protein ( UXT ). The ovarian response was analyzed for the number of total antral follicles and classified into three size categories: S (<3mm), M (3-5mm) and L (>5mm). The ovulation rate was recorded by the number of corpora hemorrhagica (CH). The preantral population was represented by fragments of ovarian cortex. Expression of genes was analyzed by qPCR in the antral follicles S, M, and L, in cortex and CH. The amount of follicles S, M or L was similar (P>0.05) between SD and AD. However, SD treatment produced significantly larger L follicles (P<0.05) than S or M. In addition, this treatment produced larger L follicles than AD protocol. All studied genes showed similar abundance (P>0.05) in cortex and follicles S, M and L, comparing SD treatment with AD. Large follicles expressed less FSHR mRNA (P<0.05) than cortex (SD) or small follicles (AD). Concerning LHCGR , M category showed higher expression (P<0.05) than S follicles (in the SD group) or cortex (in AD). The TGFβR-1, BMPR1A and BMPR2 genes presented lower expression (P<0.05) in M follicles when compared to S (in the SD group) or to cortex (in AD). Regarding the ovulation rate, CH number was not altered by hormonal dose (P>0.05), being 4.00±1.17 and 2.50±0.43, for SD and AD respectively. In addition, the expression of LHCGR was similar between CH (P>0.05) produced by the treatments. According to the relative expression of the genes in follicles and cortex, it is possible to conclude that FSHR, TGFβR-1, BMPR1A and BMPR2 are more active at the beginning and LHCGR at the late phase of follicular development.
Additionally, higher doses of eCG/hCG do not increase ovulation rate and LHCGR expression does not increase in CH. Finally, studies are needed to better understand the reproductive physiology of peccaries.
Keywords: Tayassuidae. Collared peccary. Ovarian follicle. Follicular development.
Figura 10- Aparência vulvar de fêmea de cateto em estro. Fonte: MAYOR et al., 2007 b adaptado................................................................... 31 Figura 11- Desenho esquemático dos principais passos da foliculogênese. A foliculogênese se inicia com o recrutamento dos folículos primordiais que se tornarão folículos primários. As CGs se proliferam progressivamente em várias camadas ao redor do oócito (folículos secundários e pré-antrais tardios). Após essa fase, uma camada de células da teca envolverá o folículo, iniciando a produção de estrogênios. À medida que as CGs continuam a proliferação, estimulada pela ação do FSH, o antro é formado, gerando dois tipos de células de granulosa: cumulus e murais. Nesta fase, a seleção ocorre entre os folículos em crescimento e apenas um ou um número limitado de folículos continuam a crescer até o estágio pré-ovulatório, enquanto outros sofrem atresia. Após a ovulação, que é desencadeada por um pico de LH, as células da teca e as células da granulosa mural sofrem luteinização. Fonte GEORGES et al., 2013 adaptado.......................................................................................... 35 Figura 12- Desenho esquemático de onda folicular antral com o estado do folículo indicado por cor. Esboços detalhados de folículos atrésicos indicam atresia avançada. O tempo é medido a partir do início da onda. Fonte: HENNET; COMBELLES, 2012 adaptado............................................................................................ 36 Figura 13- Relação endócrina-neuroendócrina entre hipotálamo, glândula pituitária e gônada. Hormônio hipotalâmico (GnRH) é trandportado pelos vasos sanguíneos para a pituitária anterior. FSH e LH estimulam as gônadas. Estrógenos secretados pelas gônadas promovem feedback. Fonte: HAFEZ; HAFEZ, 2000 .................................................................................................... 37 Figura 14- Diagrama simplificado que mostra a seqüência de eventos envolvidos na via de transdução do sinal. A ligação do ligante a um receptor de tipo II resulta no recrutamento de um receptor de tipo I para formar um complexo de sinalização heteromérica no qual o receptor do tipo I é transfosforilado pelo receptor do
tipo II. Fonte: KNIGHT; GLISTER, 2003 adaptado..................... 39 Figura 15 Complexo tetramérico formado por dois receptores tipo I e dois receptores tipo II, desencadeando a via Smad de sinalização intracelular. Fonte: BUDI; DUAN; DERYNCK, 2017 adaptado........................................................................................... 39 Figura 16- Ilustração da dinâmica de genes durante a foliculogênese. A parte superior da figura indica as fases da foliculogênese, enquanto a parte inferior expõe a dinâmica dos genes que expressam os receptores de hormônios gonadotróficos desde o crescimento folicular até a fase pré-ovulatória. A expressão dos genes FSHR e LHCGR ilustra a importância dos homônios correspondentes em cada estágio de desenvolvimento folicular. Fonte: KHAN et al., 2016 adaptado............................................... 42
CAPÍTULO 1 Figure 1 - Overview of reproductive tracts of hormonally stimulated collared peccaries. Representative tracts of animals treated with swine (a) or allometric (b) dose of gonadotropins are shown. LO: left ovary. RO: right ovary. S: small follicle. M: medium follicle. L: large follicle. arrows indicate corpus hemorrhagicum ……………………………………………….. 72 Figure 2- Ovaries of hormonally stimulated collared peccaries. Animals #1, #2, #5 and #6 were treated with SD (Swine Dose) of gonadotropins. Animals #3, #4, #7 and #8 were treated with AD (Allometric Dose) of gonadotropins. LO: left ovary. RO: right ovary. S: small follicle. M: medium follicle. L: large follicle. Arrows indicate corpus hemorrhagicum. ………………………. 73 Figure 3- Ovarian gene expression in follicles and cortex from hormonally stimulated peccaries. Transcript levels of FSHR and LHCGR , TGFβR- 1 (ALK5) , BMPR1A (ALK3) and BMPR2 genes in follicles categorized by size and ovarian cortex from peccaries treated with Swine Dose (SD) or Allometric Dose (AD) of PG600®^ are shown. The reference genes GAPDH, H2A and UXT were used for signal normalization. The mRNA levels in AD
Tabela 1 - Características reprodutivas dentro das espécies de mamíferos ungulados P. tajacu, S. scrofa, S. scrofa domesticus, B. taurus e C. hircus quanto aos parâmetros de duração de ciclo estral, taxa de ovulação e tempo gestacional............................................................ 31 Tabela 2- Caracterização de receptores tipo I e II que atuam, através da formação de tetrâmeros, na ligação de fatores envolvidos na foliculogênese. Baseado em MAZERBOURG e HSUEH, 2006..... 40
CAPÍTULO 1 Table 1 - Primer sequences used for gene expression analysis in Pecari tajacu tissues ……………………………………………………… 76 Table 2 - Quantitative RT-PCR amplification parameters for gene expression analysis in Pecari tajacu ovaries …………………… .. 77 Table 3- Number of follicles categorized by size collected from peccaries hormonally treated for ovarian stimulation ………………. … 78 Table 4- Biopsy masses of ovarian follicles achieved from hormonally treated Pecari tajacu females …………………………………. ….. 79
ACP Água de coco em pó ActR Proteína receptora de ativina (Activin receptor protein ) ALK Quinase semelhante a receptor de ativina kinase ( Activin receptor-like ) ANOVA Análise de variância BMP Proteína morfogenética óssea ( Bone morphogenetic protein ) cDNA DNA complementar ao RNA mensageiro CL Corpo lúteo cm Centímetro CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CCO Complexo cumulus -oócito DNA ácido desoxirribonucleico eCG Gonadotrofina Coriônica Equina ( Equine Chorionic Gonadotropin ) EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético FSH Hormônio folículo-estimulante ( Follicle-stimulating hormone ) FSHR Receptor de hormônio folículo-estimulante ( Follicle-stimulating hormone receptor ) FUNCAP Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico GC Célula da granulosa GDF Fator de diferenciação e crescimento ( Growth differentiation factor ) GnRH Hormônio liberador de gonadotrofina ( Gonadotropin-Releasing Hormone ) hCG Gonadotrofina Coriônica Humana ( Human Chorionic Gonadotrophin ) IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente IUCN União Internacional para Conservação da Natureza ( International Union for the Conservation of Nature ) kg Quilograma LDL Lipoproteínas de baixa densidade (l ow density lipoproteins ) LH Hormônio luteinizante ( Luteinizing hormone ) LHCGR Receptor de hormônio luteinizante e gonadotrofina coriônica ( Luteinizing hormone and chorionic gonadotrophin receptor ) m Metro mg Miligrama
2.1.1 Taxonomia e filogenética........................................................................................... Características anatômicas e morfológicas................................................................. Anatomia do sistema reprodutor do macho................................................................ Anatomia do sistema reprodutivo da fêmea..............................................................
2.2.1 Ciclo estral..................................................................................................................... Oogênese......................................................................................................................... Foliculogênese...............................................................................................................
2.3.1 Fatores de crescimento e seus receptores.................................................................. Gonadotrofinas e seus receptores...............................................................................
2.4.1 Microarranjos de DNA............................................................................................ Sequenciamento de RNA.......................................................................................... qPCR em tempo real................................................................................................
