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Um estudo sobre a proteína tbccd1, sua função, localização celular e as mutações encontradas na sua sequência de aminoácidos. O documento discute as proteínas relacionadas, como tbcc, rp2 e sun1 e 2, e as suas interações com o centrossoma e o núcleo. Além disso, são apresentados resultados de estudos sobre a localização da proteína em células de mamíferos e a importância de determinados resíduos de aminoácidos na sua localização no centrossoma.
O que você vai aprender
Tipologia: Notas de estudo
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Índice
Agradecimentos ...................................................................................................................... iv Resumo ................................................................................................................................... vi Abstract.................................................................................................................................. vii
iv
À minha orientadora, Professora Doutora Helena Soares, por me ter aceite no seu grupo de investigação de modo a poder desenvolver este projecto. Muito obrigada por toda a disponibilidade, apoio, amizade e pela confiança demonstrada no meu trabalho. Agradeço também pela transmissão de conhecimentos e experiência científica, que me ajudaram a crescer a nível pessoal e científico.
Ao Professor Doutor Fernando Antunes por ter aceite ser meu orientador interno e pelo seu apoio e ajuda prestada no desenvolvimento do trabalho.
Aos restantes Professores do grupo, Doutora Luísa Cyrne, Doutora Susana Marinho e Doutora Carla Real, pelas discussões, auxílio e palavras de apoio.
Aos colegas do grupo de Bioquímica dos Oxidantes e Antioxidantes, CQB, FC, UL, Sara Carvalhal, Alexandra Tavares, João Gonçalves, Ruben Ramalho, Daniela Grácio, Rita Tenente, Gonçalo Rodrigues, Gonçalo Covas, Verônica Brito, Juan Rodrigues, Ana Judite Duarte e Joana Pinto, pelo bom ambiente de trabalho no laboratório, pela ajuda na bancada, pelas brincadeiras e por terem tornado este ano especial. Um agradecimento especial à Alexandra Tavares por todos os ensinamentos, pela ajuda prestada no desenvolvimento deste trabalho e, acima de tudo, pela amizade.
Aos meus pais por todo apoio incondicional e incentivo ao longo destes anos e por
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O centrossoma é o principal centro organizador de microtúbulos das células animais, desempenhando funções celulares essenciais no processo de divisão celular, uma vez que regula a nucleação e organização espacial dos microtúbulos, estando também implicado no posicionamento de organelos na célula, como o complexo de Golgi, no estabelecimento da polaridade celular, na migração e adesão celulares e na ciliogénese. Nas células animais o centrossoma encontra-se posicionado no centro da célula em estreita associação com o núcleo. Os cofactores da tubulina (TBCA-E) são proteínas que participam na via de folding da tubulina e possuem funções relacionadas com o citoesqueleto, desempenhando papéis essenciais nas células eucariotas. A proteína TBCCD1 ( TBCC-domain containing protein 1 ) é uma proteína centrossomal relacionada com o TBCC e com a proteína RP2, uma vez que possui os domínios funcionais TBCC e CARP, porém não parece possuir actividade de GAP para a tubulina. O TBCCD1 é um potencial regulador do posicionamento do centrossoma em estreita interacção com o núcleo e da organização citoplasmática.
Neste trabalho descrevemos a identificação do domínio responsável pela localização centrossomal da proteína TBCCD1 humana, constituído pelos primeiros 20 resíduos de aminoácidos da sua região N-terminal. Em células humanas observámos que a expressão da proteína TBCCD1 com uma mutação pontual no resíduo de prolina na posição 24 leva à deslocalização da γ-tubulina do centrossoma. Verificámos também que três mutações pontuais distintas nos motivos VxPX e KRAK da proteína causam uma menor eficiência na formação de cílios primários.
Concluindo, a proteína centrossomal TBCCD1 humana parece ter uma ligação à γ-tubulina, contudo ainda não está esclarecido se esta interacção é directa ou indirecta, podendo a γ- tubulina ser um parceiro molecular do TBCCD1. O TBCCD1 deverá também ter um papel essencial in vivo resultante do seu envolvimento na manutenção da ligação do centrossoma ao núcleo e no processo de ciliogénese.
Palavras-chave: TBCCD1, centrossoma, γ-tubulina, cílios
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The centrosome is the major microtubule organizing center in animal cells, playing an essential role in cellular processes such cell division, since it regulates the nucleation and spatial organization of microtubules, and is also implicated in organelle positioning in the cell, such as the Golgi apparatus, cell polarity establishment, cell migration and adhesion and ciliogenesis. In animal cells, the centrosome is positioned in the center of the cell in close association with the nucleus. The tubulin cofactors (TBCA-E) are proteins involved in tubulin folding pathway that have emerged as proteins with crucial roles in eukaryotic cells related to the cytoskeleton. The TBCCD1 protein (TBCC domain-containing protein 1) is a centrossomal protein related to TBCC and RP2 protein, since it contains the TBCC and CARP domains. However, TBCCD probably doesn’t have a GAP activity towards tubulin. The TBCCD1 is a potential regulator of the positioning of the centrosome and cytoplasmic organization.
In this work we described the identification of the centrosome targeting motif of the human TBCCD1, corresponding to the first 20 amino acid residues of its N-terminus region. Our studies performed in mammalian cell lines revealed that the expression of TBCCD1 with a point mutation in the proline residue at position 24 leads to the mis-localization of γ-tubulin from the centrosome. Furthermore, we also found that three distinct point mutations in the motifs VxPX and KRAK lead to a lower efficiency of transfected cells to assemble primary cilia.
Also, the obtained results clearly show that the human centrossomal TBCCD1 protein seems to have an interaction with γ-tubulin, but whether this is direct or indirect is still not clear. However, our results support the idea that γ-tubulin will probably be a molecular partner of TBCCD1. The TBCCD1 should also have an essential role in vivo resulting from their involvement in maintaining the nucleus-centrosome association and its involvement in ciliogenesis.
Keywords: TBCCD1, centrosome, γ-tubulin, cilia
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GCPs - γ-tubulin complex proteins
GCP-WD - γ-tubulin complex proteins-WD40 domain
GDP – 5’-difosfato de guanina
GFP – proteína fluorescente verde
GTP – 5’-trifosfato de guanina
IFT – transporte intraflagelar
LB – meio Luria Bertani ou Lysogeny Broth
LRR – domínio leucine-rich repeats
MAPs – proteínas associadas a microtúbulos
MTOCs – centros organizadores de microtúbulos
mRNA – RNA mensageiro
NDPk – nucleoside diphosphate kinase
NDK1 – nucleoside diphosphate kinase 1
N-terminal - extremidade de uma cadeia polipeptídica cujo primeiro resíduo de aminoácido apresenta um grupo amina livre
Pak1 – p21-activated kinase 1
PBS – solução tampão fosfato-salino
PCM – material pericentriolar
PCR – polymerase chain reaction
PLK4 – polo-like kinase 4
PP2A – protein phosphatase 2A
RNA – ácido ribonucleico
RNAi – RNA de interferência
RP2 – Retinitis pigmentosa protein 2
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RT-PCR – reverse transcription polymerase chain reaction
SAS6 – spindle assembly abnormal 6
SDS – dodecil sulfato de sódio
siRNA – pequeno RNA interferente (de short interfering RNA )
TBCA – cofactor da tubulina A (de tubulin cofactor A )
TBCB – cofactor da tubulina B (de tubulin cofactor B )
TBCC – cofactor da tubulina C (de tubulin cofactor C )
TBCCD1 – TBCC-domain containing protein 1
TBCD – cofactor da tubulina D (de tubulin cofactor D )
TBCE – cofactor da tubulina E (de tubulin cofactor E )
Triton X-100 – iso-octifenoxipolietoxietanol
Tween 20 – polioxietileno(sorbitan)monolaurato
UBL – domínio ubiquitin-like
γ-TuRC - γ-tubulin ring complex
γ-TuSC - γ-tubulin small complex
I - Introdução 2 Inês Pereira
extremidades dos microtúbulos possuem taxas de polimerização diferentes, onde a extremidade que tem exposta β-tubulina corresponde à que possui uma menor concentração crítica de tubulina e uma maior e mais rápida polimerização. A extremidade que tem exposta α-tubulina é a que tem uma menor taxa de polimerização. As duas extremidades são designadas por “+” e “-“, respectivamente (Amos & Schlieper, 2005; Conde & Cáceres, 2009; Desai & Mitchison, 1997).
Os microtúbulos são estruturas altamente dinâmicas que podem alternar, de forma estocástica, entre as fases de crescimento (polimerização) e encurtamento (despolimerização), comportamento denominado por instabilidade dinâmica e que se baseia na ligação e hidrólise do GTP pela tubulina (Nogales, 2001). Ambos os monómeros α- e β-tubulina possuem um local de ligação ao GTP, mas apenas a β-tubulina apresenta actividade de GTPase, sendo capaz de o hidrolisar em GDP e posteriormente permutar por GTP (Amos & Schlieper, 2005). Assim, durante a polimerização, o GTP ligado à β-tubulina é hidrolisado, resultando em GDP. Deste modo, enquanto a adição de heterodímeros-GTP for maior e mais rápida que a hidrólise do GTP, o microtúbulo manterá um CAP de tubulina-GTP na extremidade “+” que o estabiliza, dando-se a polimerização. Quando esta CAP é estocasticamente perdida devido há hidrólise dos GTP pelos heterodímeros na extremidade “+”, há uma diminuição das interacções nos heterodímeros dos protofilamentos adjacentes, levando à formação de protofilamentos curvados e à despolimerização do microtúbulo (Nogales, 2001).
In vivo , sempre que as duas extremidades dos microtúbulos se encontram livres, para além da instabilidade dinâmica, estes apresentam um comportamento designado por treadmilling. Este comportamento reside nas diferentes capacidades de polimerização das duas extremidades. Assim, se a velocidade de adição de subunidades na extremidade “+” for igual à velocidade de perda de subunidades na extremidade “-“ não se observará qualquer alteração no comprimento dos microtúbulos. Caso contrário o microtúbulo tenderá a desaparecer, se ambas as extremidades tendem a perder heterodímeros, ou a crescer mais por uma extremidade enquanto a outra tende a diminuir. A existência de treadmilling está relacionada com as diferentes concentrações críticas de heterodímeros para polimerizar apresentada pelas duas extremidades (Nogales, 2001).
As propriedades dinâmicas dos microtúbulos dependem não só da capacidade intrínseca da tubulina para polimerizar, a qual está relacionada com o estado do nucleótido, mas podem também ser modificadas e reguladas por outros factores, como por exemplo: (i) a disponibilidade de diferentes isotipos de α- e β-tubulina por regulação diferencial da
I - Introdução 3 Inês Pereira
transcrição de diferentes genes que codificam para a tubulina; (ii) o controlo da via de folding da tubulina; (iii) a existência de modificações pós-traducionais na tubulina; (iv) o funcionamento e regulação dos centros organizadores de microtúbulos onde ocorre a nucleação de microtúbulos; (v) interacção dos microtúbulos com MAPs e proteínas motoras (Nogales, 2001).
I.1.1 Nucleação dos Microtúbulos
A baixas concentrações de tubulina, a polimerização de novos microtúbulos é um processo cineticamente limitante. De forma a ultrapassar esta barreira a nucleação de microtúbulos in vivo ocorre em estruturas especializadas, designadas centros organizadores de microtúbulos (MTOCs) (Wiese & Zheng, 2006). O principal MTOC das células animais é o centrossoma, enquanto nas leveduras são os corpos polares do fuso ( spindle pole bodie). No entanto, existem outros organelos capazes de nuclear os microtúbulos, como o complexo de Golgi (Chabin-Brion et al., 2001), corpos basais ou o corpo médio (Lüders & Stearns, 2007; Wiese & Zheng, 2006).
Para iniciar a formação dos microtúbulos é necessário que heterodímeros de α- e β-tubulina se associem de modo a criar uma base, onde a sua extremidade “-“ está ligada ao MTOC (Pereira & Schiebel, 1997) e a partir da qual os microtúbulos podem alongar rapidamente. Existem proteínas na célula que regulam a formação dos microtúbulos, facilitando a sua nucleação imitando esta base ou estabilizando-a (Wiese & Zheng, 2006). A nucleação dos microtúbulos ocorre primariamente nos MTOCs, mais especificamente num complexo multiproteico em forma de anel, o γ-tubulin ring complex (γ-TuRC). O γ-TuRC é uma estrutura altamente conservada composta por γ-tubulina e proteínas associadas (Zheng et al., 1995) que permite criar a base para que a polimerização dos heterodímeros de α- e β-tubulina ocorra (Heald & Nogales, 2002).
A γ-tubulina é uma proteína que se verificou ser essencial na nucleação dos microtúbulos. Foi identificada pela primeira vez em Aspergillus nidulans (Oakley & Oakley, 1989). Neste mesmo estudo foi demonstrado que é indispensável na formação dos microtúbulos nos corpos polares do fuso da levedura. É uma proteína ubíqua e conservada filogeneticamente, pertencendo à superfamília das tubulinas e com elevada homologia com as α- e β-tubulina, mas que não incorpora os protofilamentos que formam a parede dos microtúbulos, ligando-se à
I - Introdução 5 Inês Pereira
Actualmente, existem dois modelos propostos para explicar de que forma o γ-TuRC está envolvido na nucleação dos microtúbulos: o modelo do molde e o modelo do protofilamento, ver figura I.1.B.
O modelo do molde postula que as subunidades de γ-tubulina adjacentes interagem lateralmente umas com as outras formando um complexo em anel que constitui a primeira volta da hélice do microtúbulo em crescimento, funcionando o γ-TuRC como molde para a associação longitudinal dos heterodímeros de α- e β-tubulina. No modelo do protofilamento é proposto um arranjo perpendicular das subunidades de γ-tubulina no γ-TuRC, através de interacções topo a topo, formando uma espécie de protofilamento. Este protofilamento seria prolongado pela adição de heterodímeros de α- e β-tubulina, que se associariam lateralmente (Wiese & Zheng, 2006). A obtenção da estrutura da γ-tubulina revelou que esta tem tendência a formar associações laterais no complexo γ-TuRC, favorecendo o modelo do molde (Aldaz et al., 2005). Contudo, não existem ainda evidências experimentais definitivas para esclarecer qual o modelo que corresponde à realidade.
O complexo γ-TuRC está envolvido, para além da nucleação, na regulação da dinâmica dos microtúbulos, limitando os eventos de despolimerização, e consequentemente aumentando a estabilidade dos microtúbulos (Bouissou et al., 2009).
I.2 O Centrossoma de células animais
O centrossoma é o principal centro organizador de microtúbulos (MTOC) das células animais, desempenhando uma função essencial no processo de divisão celular (Chae et al., 2005), uma vez que regula a nucleação e organização espacial dos microtúbulos. Esta estrutura foi descrita pela primeira vez por Theodor Boveri em 1888 (Bettencourt-Dias & Glover, 2007).
I.2.1 Estrutura e função do centrossoma
O centrossoma de células animais é composto por um par de centríolos, o centríolo-mãe e o centríolo-filho, orientados ortogonalmente, ligados por fibras conectoras nas extremidades
I - Introdução 6 Inês Pereira
proximais e rodeados por uma matriz proteica densa denominada material pericentriolar (PCM) (figura I.2.) (Bettencourt-Dias & Glover, 2007).
Figura I.2. O centrossoma de células animais. Representação esquemática do centrossoma de células animais, constituído por dois centríolos, ligados por fibras conectoras e rodeados por material pericentriolar (PCM). O centríolo-mãe apresenta apêndices distais (seta azul) e sub-distais (ponta da seta branca). Adaptado de Gonçalves etal., 2010b.
Os centríolos são estruturas cilíndricas em forma de barril ( barrel-shaped ) constituídas por nove tripletos de microtúbulos, organizados numa configuração simétrica radial e encontram- se polarizados ao longo do seu eixo proximal-distal. Por sua vez, cada tripleto é constituído por um microtúbulo completo e dois incompletos (Doxsey, 2001). Estas estruturas são extremamente estáveis, uma vez que os seus microtúbulos são resistentes a agentes despolimerizantes como o frio ou detergentes. Esta estabilidade pode ser devida a modificações pós-traducionais da tubulina centriolar, como a poliglutamilação, ou a proteínas que sejam componentes estruturais dos centríolos (Bettencourt-Dias & Glover, 2007).
Devido à duplicação dos centríolos no ciclo celular, cada par é composto por um centríolo- mãe, mais velho, e um centríolo-filho, mais novo. Os dois centríolos são morfologicamente diferentes, uma vez que o centríolo-mãe possui apêndices sub-distais e distais que ligam os microtúbulos ao centrossoma e ancoram os centríolos à membrana plasmática, respectivamente. Ao ancorar-se à membrana plasmática o centríolo-mãe passa a designar-se por corpo basal (Kobayashi & Dynlacht, 2011) e pode nuclear o axonema ciliar. Na passagem de centríolo-mãe para corpo basal ocorrem alterações estruturais, como a aquisição de apêndices adicionais, e de outras propriedades, que serão importantes para a formação e organização dos cílios ou flagelos (Debec et al., 2010).
