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Um experimento que consiste na reidratação de uma cultura probiótica liofilizada em quatro tipos de diluentes diferentes. Através do método pour plate, spread plate e microdiluição, o crescimento celular e a presença de turbidez são avaliados para verificar a qualidade e viabilidade do produto. O estudo é importante para a indústria alimentícia, uma vez que os probióticos têm se mostrado eficazes no aprimoramento da saúde humana.
Tipologia: Slides
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Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Nutrição da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília, como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Bacharel em nutrição. Orientadora: Prof.ª Dra. Eliana Santos Leandro BRASÍLIA – DF 2018
Agradeço primeiramente a Deus por ter me proporcionado a oportunidade de chegar até aqui e por sua proteção ao longo dessa jornada. Aos meus pais, por sempre acreditarem em mim e me apoiarem em todos os meus sonhos e realizações. Sou grata a eles por todo o tempo que estiveram ao meu lado, me conduzindo e auxiliando durante minhas escolhas, festejando minhas vitórias e contribuindo em minha formação acadêmica. À minha irmã Fernanda, por seu amor, brincadeiras, descontrações e momentos de alegria. Aos meus familiares, pela compreensão e suporte durante o curso. À minha orientadora, Prof.ª Dra. Eliana dos Santos Leandro, por todos os ensinamentos, dedicação e amparo na elaboração deste trabalho. Aos estagiários e técnicos do laboratório, por todo auxílio durante as análises. Aos professores Márcio e Ernandes, por terem me proporcionado aulas incríveis, que proporcionam alegria e descontração durante o processo de aprendizagem. Aos meus colegas de curso, mais especificamente aos grupos “Quase nutricionistas” e “NSP da ralé”, por terem oferecido momentos memoráveis.
O aumento da busca por uma alimentação saudável atraiu o interesse da indústria alimentícia. Desse modo, houve a formação de novos produtos como os probióticos. Probióticos são micro-organismos vivos capazes de oferecer algum benefício para saúde do hospedeiro, no entanto, o processamento pode comprometer as características das células. A ANVISA estabelece requisitos para manter um padrão de qualidade na comercialização desse produto e, dessa forma, faz-se necessária a elaboração de estudos e pesquisas que investiguem a qualidade dos produtos disponíveis no mercado para verificar se as empresas seguem esses requisitos. O experimento consistiu na reidratação de uma cultura probiótica liofilizadas em quatro tipos de diluentes: solução salina, Ringer, água peptonada e MRS. Cada amostra foi homogeneizada e, após o tempo de reidratação, foram feitas diluições seriadas. Logo após, foram plaqueadas pelos métodos Pour plate e Spread plate. Fez-se também a microdiluição das amostras reconstituídas. As placas de Petri e de microdiluição foram incubadas por um tempo total de 48 horas. Nos métodos Pour plate e Spread plate , verificou-se o crescimento celular correspondente a <2Log UFC/g e, na microdiluição, apurou-se a presença de turbidez fraca na reidratação em MRS e ausência de turbidez para os demais diluentes. Portanto, constatou-se que o produto em questão não estava de acordo com os padrões de qualidade para ser considerado probiótico e propagar alegações de benefícios, uma vez que as células estavam injuriadas e inviáveis. Palavras-chave: Probiótico. Liofilização. Viabilidade. Lactobacillus acidophilus.
Tabela 1 – População estimada de acordo com método de plaqueamento, tempo de reidratação, tipo de diluente e grau de diluição ......................................................... 19 Tabela 2 – Grau de turbidez em decorrência do diluente e tempo de incubação por meio de microdiluição ................................................................................................ 21
9 Tratando especificamente do uso terapêutico, as culturas probióticas podem ser comercializadas em sua forma liofilizada que produz células viáveis para posterior encapsulação. O processo de liofilização submete as células a variações extremas de temperatura e tais variações podem ocasionar a perda de viabilidade das células. No entanto, são utilizadas técnicas que objetivam manter as células viáveis mesmo após passar pelo processo de liofilização. Uma dessas técnicas é a utilização de substâncias crioprotetoras que permitem assegurar a qualidade da cápsula probiótica a ser comercializada em seu processo de obtenção (LI et al., 2016; HER; KIM; LEE, 2014 ; GBASSI; VANDAMME, 2012; JALALI et al., 2012). Com isso, existem legislações incumbidas de certificar a comercialização dos produtos probióticos disponibilizados pela indústria e regulamentar as alegações de benefícios a saúde que esses produtos referem. Tanto na Europa, quanto nos Estados Unidos, existem legislações que solicitam a comprovação das alegações de benefícios por meio de evidências científicas (GONZÁLEZ-DÍAZ; GIL-GONZÁLEZ; ÁLVAREZ-DARDET, 2018). No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) dispõe na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 241, de 26 de Julho de 2018, que os fabricantes de produtos probióticos devem apresentar documentos técnicos devidos que comprovem a viabilidade da cultura, bem como os benefícios alegados de acordo com a estirpe utilizada, que também deve ser exposta e caracterizada. Dessa forma, faz-se necessária a elaboração de estudos e pesquisas que investiguem a qualidade dos produtos disponíveis no mercado e suas adequações quanto aos requisitos propostos pela legislação, da mesma maneira que é importante averiguar diferentes métodos utilizados na condução do estudo de viabilidade das células.
10 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Avaliar o efeito de diferentes soluções diluentes e métodos de plaqueamento na determinação da viabilidade de um produto probiótico liofilizado. 2.2 Objetivos específicos
12 et al., 2011). O gênero Bifidobacterium já foi considerado como bactéria lática por compartilhar algumas de suas características em comum, no entanto, é filogeneticamente independente. (WESSELS et al., 2004). As bactérias ácido lácticas (BAL) são Gram-positivas, anaeróbias, catalase negativas e não formadoras de esporos, morfologicamente podem ser formadoras de cocos ou bastões. Quanto à temperatura de crescimento, as bactérias ácido lácticas são classificadas como mesófilas, isto é, apresentam crescimento ótimo em temperaturas entre 25°C e 45°C (FORSYTHE, 2013). Considerando o produto final da fermentação, são agrupadas em homofermentativas e heterofermentativas, sendo que as homofermentativas produzem principalmente ácido láctico a partir da fermentação de glucose e as heterofermentativas produzem outras substâncias além de ácido láctico, como dióxido de carbono, ácido acético e etanol (CARR; CHILL; MAIDA, 2002). As bactérias ácido láctica fazem parte da microbiota humana e são encontradas tanto nas mucosas humanas como também podem ser adquiridas através da alimentação, em razão de participarem do processo de produção de alimentos com carnes, vinhos, laticínios e vegetais acidificados (FORSYTHE, 2013). O amplo uso dos probióticos na indústria de alimentos se estende desde métodos convencionais, como a produção de queijos, e segue até desenvolvimentos mais recentes da tecnologia de alimentos (RIBEIRO; SIMÕES; JURKIEWICZ, 2009). Além disso, as bactérias ácido lácticas são utilizadas na silagem para alimentação animal a fim de conferir os benefícios e aumentar a qualidade da carne do animal alimentado com probióticos (KUSS et al., 2009). A BAL também pode ser adicionada com agente de biopreservação em frutas e vegetais a partir do controle de fungos e bactérias (SOBRINO-LÓPEZ; MARTÍN-BELLOSO, 2008). Portanto, destaca-se também que estas bactérias podem conferir aumento da vida de prateleira, valor nutricional, sabor, aroma e textura de um produto (RODRIGUES; FELKL; BITENCOURT, 2012; OLIVEIRA et al., 2002). As bactérias ácido lácticas possuem a capacidade de conservação, isto é, contribuem positivamente com a vida útil de prateleira do alimento a qual elas
13 foram adicionadas (RODRIGUES; FELKL; BITENCOURT, 2012). O que pode ser explicado pela característica de biocontrole que essas bactérias possuem, ou seja, as bactérias probióticas possuem ação antimicrobiana a partir da liberação de bacteriocinas que possuem ação contra microrganismos patogênicos, liberam também ácidos orgânicos que conferem vantagens às bactérias lácticas no processo de fixação na mucosa intestinal e a competição por nutrientes é outro fator que explica a ação antimicrobiana (DALIÉ et al., 2009; FLEMMING; FREITAS, 2005; FULLER et al., 1989; PETRI, 2000). As bactérias probióticas são utilizadas pela indústria principalmente em alimentos infantis, produtos lácteos e preparações farmacêuticas, sendo o grupo dos lácteos o mais representativo deles (SACCARO, 2008). Portanto, a produção de alimentos probióticos e a realização de pesquisas com culturas probióticas está voltada para a utilização alimentos de origem animal, como leites fermentados e iogurtes, por serem os mais comercializados nesse contexto (SAAD, 2006). Além da apresentação em alimentos, as culturas probióticas são comercializadas também em forma de comprimidos, cápsulas e sachês compostos pela bactéria liofilizada (GUARNER et al., 2011). A liofilização é um dos métodos utilizados para obtenção de células viáveis para encapsulação. Esse método consiste na secagem a partir do congelamento e sublimação do líquido presente. O processo é compreendido por três etapas: congelamento rápido, desidratação primária e desidratação secundária, sendo as etapas de desidratação e as condições de armazenamento responsáveis por perdas na sobrevivência das células (SANTIVARANGKNA et al., 2011). Dentre outros fatores que interferem na sobrevivência das células encontram-se o meio de congelamento, temperatura, atmosfera, temperatura de desidratação e atividade de água (CHAMPAGNE et al., 1991). Portanto, para garantir a viabilidade da cultura probiótica, existem fatores que visam a proteção para submeter ao processo de encapsulação. Uma das formas de auxiliar na proteção é a utilização do meio de liofilização composto por carboidratos, que tem seus mecanismos atribuídos às ligações de hidrogênio entre a membrana da célula e o meio de cultura, e a partir disso são desencadeadas as ações de
15 culturas probióticas comercializados (BRASIL, 1999a; BRASIL, 2000; STRINGHETA et al., 2007). A quantidade mínima de células viáveis de lactobacillus acidophilus para conferir benefício à saúde deve estar entre 10^8 e 10^9 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) e o produto comercializado deve apresentar essa quantidade mínima de colônias, e a empresa deve comprovar sua eficácia a partir da apresentação de laudo de análise do produto que comprove a quantidade mínima viável do microrganismo até o final do prazo de validade e teste de resistência da cultura utilizada à acidez gástrica e aos sais biliares (BRENNAN; WANISMAIL; BIBEK, 1983; ANVISA, 2018).
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4. METODOLOGIA Trata-se de um estudo experimental de caráter qualitativo e quantitativo realizado no Laboratório de Higiene dos Alimentos do Departamento de Nutrição da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília, Brasília – DF. 4.1. Obtenção do produto probiótico Adquiriu-se um produto probiótico encapsulado em uma farmácia do Distrito Federal para avaliar se a viabilidade do micro-organismo probiótico correspondia a informada pelo fabricante. Na embalagem do produto probiótico, consta que o produto contém 2,0 x 10^8 UFC/g do probiótico por cápsula. Na bula do produto consta que juntamente com o probiótico há presença de estabilizantes, antiumectantes e corantes. Na embalagem, consta a informação que o produto foi fabricado em janeiro de 2018 e a data de vencimento é referente a janeiro de 2020. 4.2 Reidratação do produto probiótico liofilizado A reidratação do produto probiótico liofilizado foi realizada nos seguintes meios: (i) água peptonada 0,1%; (ii) salina 0,85 %; (iii) solução Ringer solution e (iv) caldo MRS. O produto probiótico liofilizado foi retirado das cápsulas e colocados em microtubos eppendorffs de capacidade de 1,5 mL. Alíquotas de 1 mL das soluções diluentes foram adicionadas nos eppendorffes contendo o probiótico. O produto foi homogeneizado e incubado a 37 °C por 1h e 2 horas. 4.3 Determinação da viabilidade Após o período de reidratação os produtos reidratados foram avaliados pelos seguintes métodos microbiológicos: (i) plaqueamento em MRS pela
18 4.4. Análise dos resultados Os resultados obtidos pelas técnicas de plaqueamento por Spread plate e Pour plate levam em consideração o número de Unidades Formadoras de Colônias obtidas. Recomenda-se a contagem das placas que apresentam entre 25 a 250 colônias. Já pelo método de microdiluição, avalia-se somente a presença de turbidez do meio.
19 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na tabela 1 a seguir, estão apresentados os resultados obtidos com os métodos de plaqueamento Spread plate e Pour plate. Tabela 1 – População estimada de acordo com método de plaqueamento, tempo de reidratação, tipo de diluente e grau de diluição Método Diluente Tempo de reidratação População estimada Spread plate Água peptonada 1h <2Log UFC/g 2h <2Log UFC/g Solução Ringer 1h <2 Log UFC/g 2h <2 Log UFC/g Caldo MRS 1h <2Log UFC/g 2h <2Log UFC/g Solução salina 0,85% 1h <2Log UFC/g 2h <2Log UFC/g Pour Plate Água peptonada 1h <2Log UFC/g 2h <2Log UFC/g Solução Ringer 1h <2Log UFC/g 2h <2Log UFC/g Caldo MRS 1h < 2 Log UFC/g 2h <2Log UFC/g Solução salina 0,85% 1h <2Log UFC/g 2h <2Log UFC/g Fonte: A autora. Os métodos Pour plate e Spread plate apresentaram resultados estimados correspondentes a <2 UFC/g para todos os diluentes utilizados e tempos de reidratação. As variações extremas de temperatura durante a liofilização e processo de armazenamento são capazes de comprometer a
