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Transição da respiração aquática
para a aérea: efeitos do C 0 2 sobre a função de hemoglobina (*)
Martha Farmer (')
Resumo A dependência de pH do efeito específico ao C 0 2 (pC0 2 = 30 t o n ) sobre os equilíbrios de oxi- gênio foi medida nas hemoglobinas de quatro espé- cies de peixe e um anfíbio: Leiostomus xanthurus (teleósteo marinho), Brachyplatystoma sp. (bagre da Amazônia), Hoplostermum littorale (cascudo, de respiração aérea), Lepidosiren paradoxa (pi- rambóia, peixe pulmonado de respiração aérea) e Typhlonectes compressicauda (um Ceciliídeo). O conteúdo de C 0 2 no sangue de peixe de respiração aérea e anfíbios é consideravelmente mais alto que os de respiração aquática, contudo, as hemoglobi- nas examinadas dos de respiração aérea não apre- sentou adaptação especial à carga aumentada de C 0 2. Embora o efeito do pH sobre os equilibrios de oxigênio das diferentes hemoglobina tenha va- riado grandemente, do efeito de Root para o efeito de Bohr invertido, o efeito de C 0 2 sobre a afinida- de do oxigênio foi muito semelhante para todos, exceto para o bagre Brachyplatystoma sp., que foi um pouco maior. A queda na afinidade do oxigênio, efetuada pelo CO,, aumentou incrementando o pH para cada hemoglobina examinada. A mudança no efeito de Bohr, A log P ^ / A pH medida em pH 7. foi semelhante para todas as cinco hemoglobinas, cerca da metade da produzida pelo CO, para a Hb A humana. Isto sugere que metade das cadeias de cada hemoglobina pode ter bloqueado os grupos aminos terminais.
INTRODUÇÃO
As hemoglobinas dos vertebrados apre- sentam notável hemologia estrutural (Dayhoff, 1972), no entanto, suas propriedades funcio- nais mostram grande diversidade. Freqüente- mente, as propriedades de união do oxigênio com as hemoglobinas têm demonstrado corre- lacionar-se com as variadas exigências respi- ratórias dos animais (recentemente revisado por Riggs (1970), Prosser (1973) e Bonaven- tura ef al. (1975). Estudos comparativos da hemoglobina têm focalizado as propriedades de união do oxigênio das hemoglobinas e os
( * ) — Versão original inglesa publicada em Comp. Bioch ( 1 ) — Duke University Laboratory, Beaufort, N. C. , and Center, Durham, N. C.
efeitos modificadores de agentes alostéricos fisiologicamente importantes como íons hidro- gênio e vários ânions, especialmente fosfatos orgânicos. Mas a respiração não é limitada à captação e liberação de oxigênio: a remoção do dióxido de carbono é igualmente essencial. Do mesmo modo, a hemoglobina não é limitada ao transporte de 0 2. mas desempenha um pa- pel significativo no transporte de CQ 2 e no equilibrio ácido-base. Surpreendentemente, aspectos comparativos do transporte de C 0 (^2) pela hemoglobina têm sido pouco estudados, especialmente para as hemoglobinas de verte- brados inferiores como peixes e anfibios. Na transição da respiração aquática para a área, muitas adaptações respiratórias anatômi- cas evoluíram (revisado por Cárter, 1957; Jo- hansen, 1970). Pode-se ficar na expectativa de encontrar mudanças nas hemoglobinas que re- fletiriam tais adaptações e, de fato, poucas tendências têm sido propostas. Contudo, o número pequeno de espécies experimentadas resultou em conclusões inadvertidamente in- duzidas. Cárter (1931), primeiro hipotetizou que peixes de respiração aérea não teriam hemoglobinas com efeito Root, porque a alta tensão de C 0 2 que encontraram em seus ór- gãos respiratórios aéreos diminuiria drastica- mente sua capacidade de 0 2 de tais hemoglo- binas. Pesquisa subsequente sustentou a hipótese de Cárter. Recentemente, todavia, foram encontrados vários exemplos de peixes de respiração aérea com hemoglobinas de efeito de Root (Farmer ef al., 1978). Pensava- se que a afinidade do oxigênio dos sangues dos de respiração aérea era geralmente mais baixa e o efeito de Bohr mais alto do que para as hemoglobinas dos de respiração aquática (Johansen, 1970). Um estudo comparativo re- cente, entretanto, do sangue de 45 espécies
em. Physiol. vol. 62A(1). 1979. the Department of Physiology. Duke University Medical
SUPL. ACTA AMAZÓNICA 8(4) : 143-151. 1978 — 143
de peixes amazônicos não apoia esta conclu- são (Powers et al., 1978). Uma das diferenças mais significativas entre os de respiração aquática e aérea é a tensão mais elevada do CO2 no sangue dos de respiração aérea. Em ambos os espécimens de respiração aérea e aquática, a diferença venoso-arterial na tensão de CO2 é semelhante, em torno de 5-6 torr. Mas a tensão arterial do C O 2 dos de respiração aquática é, em geral, abaixo de 5 torr (Rahn, 1966), enquanto que a dos de respiração aérea varia de 15 a 43 torr, dependendo, em parte, do grau em que a pele ou as guelras funcio- nam na eliminação de C O 2 (Rahn & Ga- rey, 1973). Com a evolução da respiração aé- rea, adaptações ao nível molecular podem ter sido indispensáveis para a função eficiente da hemoglobina na presença da carga de C O 2 au- mentada. Se existe qualquer propriedade fun- cional que separaria as hemoglobinas dos res- piradores aéreos e aquáticos, essa seria o efei- to de C O 2 sobre elas.
Bohr, Hasselbalch e Krogh estabeleceram em 1904 que o dióxido de carbono induz as propriedades de combinação do oxigênio do sangue, o efeito de Bohr. Em 1914, Christian- sen, Douglas e Haldane demonstraram que o efeito de Bohr possuía uma conversão: a oxi- genação do sangue influencia sua capacidade combinatória de C 0 2. A um dado pC0 2 , o con- teúdo total de sangue oxigenado e a diferença, o C 0 2 oxilável, é chamado efeito de Haldane. O efeito de Bohr foi posteriormente reco- nhecido como um efeito de prótons sobre a afi- nidade de O2 da hemoglobina e era desse modo indireto, em vez de um efeito específico de C02- A conversão do efeito de Bohr, assim de- finida, é que a oxigenação induz a afinidade do íon hidrogênio da hemoglobina. Por esta razão, a oxigenação produz uma queda de pH no san- gue quando são liberados prótons previamente ligados à desoxiemoglobina (Wyman, 1948) e H + + HCO -3 H2CO3 H 2 O + C O 2. O C 0 (^2) oxilável foi inicialmente atribuído apenas ao decréscimo resultante da concentração de bi- carbonato (Christiansen et al., 1914; Hender- son, 1920), i. e. , e o efeito de Haldane era visto comp uma conseqüência direta do efeito de Bohr. Há, porém, um segundo fator contri- buindo para o efeito de Haldane. A combinação do C O 2 com os grupos aminos terminais de
ambas as cadelas da hemoglobina para formar compostos carbanatos : HbNH 2 + C 0 (^2) (^3 HbNHCOOH- ±1 HbNHCOG" + H + (Fergu- son & Roughton, 1934a). Em virtude de esses compostos serem formados, de preferência, com hemoglobina desoxigenada, ao invés de oxigenada, eles contribuem substancialmente para o CO2 oxilável do sangue (Ferguson & Roughton, 1934b). Embora a presença do efeito de Haldane resulte da presença do efeito de Bohr (Wyman, 19481, necessariamente não implica a pre- sença de C O 2 carbamino. Os efeitos de Halda- ne tem sido mencionados para os sangues ou hemeglobinas de muitos vertebrados (e. g., Lenfant et al., 1967; Johansen, 1970; Dejours, 1975; Root & Irving. 1941; Tomita & Riggs, 1971; Kilmartin & Rossi-Bernardi, 1969a; Baumann er al., 1975; Baumann & Haller, 1975). A falta do efeito de Haldane foi notadamente demons- trada em sangues de poucas espécies de elas- mobrânquios, os quais também distintamente carecem do efeito de Bohr (Lenfant & Johan- sen, 1966; Albeis & Pleschka, 1967), sugerindo que a hemoglobina carbamino provavelmente não é formada nessas espécies.
O papel do C 0 2 carbamino como um agente alostérico da afinidade do 0 2 da hemoglobina tem sido objeto de constante pesquisa, em- bora limitada quase que inteiramente às hemo- globinas dos mamíferos (revisado por Rough- ton, 1970, e Kilmartin & Rossi-Bernardi, 1973). Supunha-se que o C 0 2 carbamino baixava a afinidade do 0 2 e diminuía o efeito de Bohr da hemoglobina dos mamíferos. Mas, justamente quando as propriedades de ligação do 0 2 das hemoglobinas dos mamíferos diferem, as pro- priedades de ligação do C O 2 também (Bauer & Schroder, 1972; Bursaux ef al., 1974; Ferguson & Roughton, 1934b; Bauer er al., 1975; Bau- mann & Haller, 1975; Tomita & Riggs, 1971).
As propriedades de ligação do 0 2 das he- moglobinas dos não mamíferos, contudo, são muito mais variáveis do que as das hemoglo- binas dos mamíferos, talvez refletindo as exi- gências respiratórias mais variáveis. Por exem- plo, a sensibilidade do pH das hemogtobinas dos peixes e anfíbios podem variar de um ex- tremo a outro do efeito de Root, onde até mes- mo a capacidade de 02 é diminuída em pH bai- xo, para uma insensibilidade completa do pH
espectro de sensibilidades de p H. Dos dois respiradores aéreos, o Leiostomus tem apenas uma hemoglobina com o efeito Root (Bonaven- tura et al., 1976) e o Brachyplatystoma uma única hemoglobina com o efeito de Bohr (Mar- tin ef a/., 1978). Hoplosternum, de respiração aérea tem duas hemoglobinas, componente II com um efeito Root e componente I, aqui exa- minado, com um efeito de Bohr invertido Gar- lick er a/., (1978b). Lepidosiren, o peixe pul- monado, tem uma só hemoglobina com o efeito Bohr (Phelps er a/., 1978). Typhlonectes, uma caecília, possui uma única hemoglobina que é essencialmente insensível ao pH acima de pH 6. (Garlick et ah, 1978a). É evidente, na Fig. I, que as hemoglobinas são muito diferentes em termos de afinidade de 0 2 e sensibilidade de pH. Em vista de tal diversidades de união do C 0 2. De fato, as di- ferenças são muito pequenas. Conforme pode ser visto na Fig. I, o COs baixa a afinidade do 0 2 da hemoglobina em cada caso, o efeito cresce com o aumento do pH. Para as fiemo- globinas de Leiostomus, Brachyplatystoma e Lepidosiren o efeito de Bohr é diminuido pelo C O 2 exatamente como nas hemoglobinas dos mamíferos. Normalmente, insensíveis ao pH, a hemoglobina de Typhlonectes tem um efeito de Bohr invertido na presença de C 0 2. O efeito de Bohr, comumente invertido, do componente I do Hoplosternum, é intensificado pelo COs. A diferença em valores A log P50, com C O 2 ou sem ele, em pH 7,5, é aproximada- mente 0,2 para todos, exceto o Brachyplatys- toma e a Hb A, para os quais o A log Pso é qua- se o dobro.
O bicarbonato está sempre presente nos experimentos com C 0 2 , e, como um anion, po- deria estar contribuindo para o efeito atribuído ao C O 2. É impossível examinar o efeito de HCO3 em presença de C 0 2 sob condições de equilíbrio. Usando um aparelho de reação rá- pida e um inibidor de anidrase carbônica, Kreu- zer er al. (1971) demonstraram que há apenas um efeito muito pequeno do bicarbonato sobre a afinidade do O2 na hemoglobina humana em concentrações fisiológicas. Entretanto, para investigaria possibilidade de que o efeito do C O 2 era somente um efeito do anion em vir- tude do bicarbonato, uma concentração equiva- lente de acetato (sal de Na) foi substituída
por bicarbonato (conforme calculado da equa- ção de Henderson-Hassalbalch). O acetato tem apenas um efeito muito pequeno sobre a Hb A nessas concentrações (Antonini et al., 1971), mas sua grandeza e distribuição de carga são semelhantes às do bicarbonato, tornando-o um substituto coerente. Os equilíbrios do oxigê- nio da hemoglobina do Lepidosiren foram me- didos na ausência de C O 2 em dois dos pH com acetato substituído por bicarbonato. A afini- dade do oxigênio da hemoglobina do Lepidosi- ren, em presença do acetato 0.025 M (em pH 7.35) e do acetato 0.035 M (em pH 7.65) não é diferente da afinidade do oxigênio na ausên- cia desse ánions (Fig. I. E ) , indicando que o efeito do C 0 2 é quase certo não ser devido ao HCO -3, mas ao CC -2 carbamino.
C7> O , _ J
A Hb A
-i 1 1 1 B Leiostomus ^ ^ o n H w u s ^
1 1 1 1 C Brachyplatystoma SP
-I 1 1 0 Hoolosternum
-1 1 1 E Lepidosiren
F Typhlonectes liltorole.
_i 1 1
Dorodoxa.
_j 1 1
compressicauda.
PH
Fig. 1 — O efeito do C 0 2 sobre a afinidade do 0 2 e o efeito de Bohr das hemoglobinas humanas ( A ) , dois peixes de respiração aquática (B, C), dois peixes de respiração aérea (D, E) e um anfíbio (F). Os cír- culos cheios ( • ) indicam a hemoglobina fracionada na presença do C 0 2 (30 torr para cs peixes e o anfí- bio, e 40 torr para a Hb A ). Os círculos vazios (O) mostram a hemoglobina fracionada na ausência ao C 0 2. Os triângulos cheios ( A ) indicam a presença do acetato substituído pelo bicarbonato para mos- trar que o efeito do C 0 2 não é meramente um efeito de ãnion (veja o texto). Foram realizados experimen- tos a 20°C, = 0 , 0 5 (CI-), usando tampões Tris ou bis-Tris/HCI.
DISCUSSÃO
Embora a amostra das espécies seja pe- quena, não há provas para sustentar a hipótese de que as hemoglobinas de respiração aérea tenham propriedades de união do C 0 2 diferen- tes das hemoglobinas de respiração aquática. As propriedades de união do C 0 2 das hemoglo- binas diferem mesmo, mas tais correlatos fi- siológicos simples não são prontamente mani- festos. Isto é verdade, ainda que as hemoglo- binas dos mamíferos sejam levadas em conta, duplicando a amostra disponível da espécie. Um método comparativo diferente, todavia, pode ser levado ao estudo do efeito específico do C 0 2 como um agente alostérico de hemo- globina, pois há evidências de que certas pro- priedades estruturais delas podem estar cor- relacionadas com o efeito do C 0 2.
Diversas hemoglobinas de peixes são co- nhecidas por terem bloqueado os terminais aminos da cadeia oc (Riggs, 1970). As hemo- globinas humanas A i (^) c e Fj o c e , i l têm bloqueado os terminais aminos sobre as subunidades P e v. respectivamente, e as afinidades do C 0 (^2) de ambas essas hemoglobinas são muito me- nos afetadas pelo C 0 2 do que a Hb A ou Hb F (Bauer ef al., 1975). A hemoglobina B do gato é bloqueada de maneira semelhante e forma a metade do carbanato tanto quanto a hemo- globina A desse animal, que não é bloqueada (Baumann and Haller, 1975). A única hemo- globina de peixe previamente examinada para o efeito específico do C 0 2 é o componente S da engula, Anguilla rostrata (Gillen & Riggs, (1973). Os terminais aminos da cadeia oc apa- rentemente são bloqueados nesta hemoglobina também. O componente S da Anguilla e o Ho- plosternum, os quais possuem efeitos de Bohr invertidos semelhantes, são similarmente afe- tados pelo ATP (Garllck et al., 1978b) e pelo C 0 2 , sugerindo que o componente I do Hoplos- ternum da cadeia oc também pode ser bloquea- do. Os terminais aminos de cadeia cc da he- moglobina do Leiostomus também parecem ser bloqueados (Bonaventura et al., 1976). O efei- to do C 0 2 sobre a afinidade do 0 2 da hemoglo- bina do Brachyplatystoma, medido em pH 7,5, é maior para as outras hemoglobinas, salvo a Hb Â. Neste pH. entretanto, o valor da inclina- ção da curva do efeito de Bohr, A log Pso/ApH, induzido pelo C 0 2 é similar para todas as he-
moglobinas de peixes e anfíbios, e apenas cer- ca da metade para o da Hb A. Por causa da natureza hiperbólica da curva de dissociação do C 0 2 das hemoglobinas, a diferença na p C 0 (^2) (40 torr para Hb A vs. 30 torr para todas ou- tras) é improvávelmente dar a razão de tão grande diferença. Parece, igualmente, que me- tade das cadeias de todas cinco hemoglobinas podem ter bloqueados os grupos aminos ter- minais.
Pode ser notado que o relacionamento entre o efeito cabarmino do C 0 2 sobre a afinidade do 0 2 da hemoglobina e a quantidade de car- banato formado em uma dada tensão de C 0 2 , não é igual para todas as hemoglobinas. A afi- nidade do 0 2 da Hb F humana é um pouco me- nos susceptível ao C 0 2 do que a Hb A, contu- do, em qualquer pH e tensão de C 0 2 , uma solução da Hb F conterá ligeiramente mais carbanato do que uma solução equinolar da Hb A (Bursaux ef al., 1974; Bauer & Schroder, 1972). Dessa maneira, o efeito menor de C 0 (^2) não pode estar devido à formação diminuída de carbanatos, mas às diferenças estruturais que conduzem às diferenças das interações mole- culares (Bursaux ef al., 1974). É também ver- dade que o efeito do COz sobre a afinidade do oxigênio das hemoglobinas, quando medido em saturação de oxigênio a 50%, é consideravel- mente menos do que o efeito medido em sa- turação a 25% (Poyart, C , comunicação pes- soal). Potencialmente, o efeito do C 0 2 sobre Pjs pode ser melhor correlacionado com a for- mação de carbanato do que o efeito sobre P». Meus dados limitados sugerem, todavia, que pequenas diferenças entre hemoglobinas re- lacionadas com o efeito do C 0 2 sobre a afini- dade do 0 2 e o efeito de Bohr, tenderão a ser exagerados se medidas em PJS , em vez de mi- nimizados.
Além de serem sítios importantes de liga- ção do C 0 2 carbamino, os terminais aminos da cadeia oc são sítios importantes de união de prótons Bohr, contribuindo em 25% ao efeito Bohr alcalino da Hb A humana (Kilmartin & Rossi-Bernardi, 1969b). Os sítios de ligação de prótons, responsáveis pelo efeito Bohr áci- do (reverso) da Hb A, ainda estão em discus- são (Perutz ef al., 1969) e são até agora des- conhecidos para as hemoglobinas de peixe com efeito de Bohr reverso.
dos peixes e em menor escala às dos anfíbios (Riggs, 1970; Sullivan, 1974; Dayhoff, 1972). Além disso, os fosfatos orgânicos intraeritro- cíticos são diferentes para grupos vertebrados diferentes (Bartlett, 1976). O grau das intera- ções competitivas entre o C 0 2 e os fosfatos orgânicos dependerá da afinidade das hemoglo- binas com os fosfatos orgânicos naturais bem como com o C O 2. É possível que as hemoglo- binas tenham evoluído de tal maneira que a competição entre o C O 2 e um fosfato orgânico, cuja concentração intraerítrocítica pode ser re- gulada, permitiria a função eficiente da hemo- globina sob uma variedade de condições. Tal- vez investigações suplementares com hemo- globinas de propriedades funcionais diferentes produzirão um padrão que se correlaciona com os parâmetros fisiológicos.
AGRADECIMENTOS
Somos gratos aos Drs. Robert Noble e Claude Poyart pelas discussões estimuladoras e aos Drs. J. Boiling Sullivan e Thomas R. Fisher por suas críticas valiosas ao manuscri- to. Este trabalho foi amparado pela bolsa PCM- 06451 do National Science Foundation para pesquisar a bordo do navio-laboratorio R/V "Alpha Helix". Suporte complementar foi for- necido pela bolsa NIH HI-15.460.
SUMMARY The pH dependence of specific effect of C 0 (^3) (pC0 2 = 30 torr) on oxygen equilibria has been measured for the hemoglobins of four species of fish and one anphibian: Leiostomus xanthurus (marine teleost), Brachyplatystoma sp. (Amazonian catfish), Hoplosternum Littorale (air-breathing catfish), Lepidosiren paradoxa (air-breathing lung- fish), and Typhlonectes compressicauda (a Caeci- lian). The blood C 0 2 content of air-breatliing fish and anphibians is considerably higher than that of water breathers, yet the hemoglobins examined from the air breathers showed no special adaptation to the increased CO, load. Although the effect of pH on the oxygen equilibria of the different hemo- globins varied greatly from Root effect to reverse Bohr effet, the effect of C 0 2 on the oxygen affinity was very similar for all but that of the catfish, Br anchyplaty stoma sp., for which the effect was somewhat larger. The drop In oxygen affinity brought about by C 0 2 increased with increasing pH for each hemoglobin examined. The change in
the Bohr effect, A log P^/A PH measured at pH 7.5 was similar for all five hemoglobins, about half that produced by C 0 2 for human Hb A. This suggests that half the chains of each hemoglobin may have blocked grupos terminals aminos.
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