TRANSGENIA ANIMAL E SUAS APLICAÇÕES
Whemenson Lennon Gomes de Oliveira
Orientador: Prof. Dr. Ivo Pivato
BRASÍLIA- DF
JUNHO/2015
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
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Aplicação de Animais Transgênicos na Produção Animal: Benefícios e Métodos, Notas de estudo de Biotecnologia
Este documento discute sobre a aplicação de animais transgênicos na produção animal, seus métodos de criação e os benefícios para a saúde humana. Os autores citados incluem boverhof, collares, cooper e outros. Palavras-chave: animais transgênicos, produção animal, saúde humana.
O que você vai aprender
- Quais são as perspectivas futuras na área de animais transgênicos?
- Quais doenças humanas podem ser estudadas usando animais transgênicos?
- Quais métodos existem para criar animais transgênicos?
- Quais são as implicações éticas e de segurança em relação a animais transgênicos?
- Quais são os benefícios de animais transgênicos na produção animal?
Tipologia: Notas de estudo
2022
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TRANSGENIA ANIMAL E SUAS APLICAÇÕES
Whemenson Lennon Gomes de Oliveira Orientador: Prof. Dr. Ivo Pivato
BRASÍLIA- DF
JUNHO/
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
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TRANSGENIA ANIMAL E SUAS APLICAÇÕES
Monografia apresentada para conclusão do curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília
Orientador: Prof. Dr. Ivo Pivato
BRASÍLIA- DF
JUNHO/
WHEMENSON LENNON GOMES DE OLIVEIRA
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Dedico este trabalho aos meus familiares, professores e amigos, dedico também as pessoas que trabalham com os animais a fim de melhorar a saúde humana respeitando as outras espécies.
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SUMÁRIO
- Introdução............................................................................................................ Página
- Revisão De Literatura..........................................................................................
- 2.1. Transgenia animal..........................................................................................
- 2.2. Métodos.......................................................................................................... - 2.2.1 Microinjeção pronuclear....................................................................... - 2.2.2. Transferência gênica mediada por retrovírus...................................... - 2.2.3. Alteração genética mediada por transposons..................................... - 2.2.4. Animais transgênicos a partir de transferência nuclear...................... - 2.2.5. Transferência de gene mediada por espermatozoides....................... - 2.2.6. Transferência de gene mediada por células-tronco embrionárias.... - 2.2.7. Confirmação da integração do DNA exógeno...................................
- 2.3. Animais transgênicos em prol da saúde...................................................
- 2.3.1. Animais transgênicos como biorreatores..........................................
- 2.3.2. Animais como doadores de órgãos para humanos...........................
- 2.4. Aplicação dos animais transgênicos na produção....................................
- 2.3. Animais transgênicos em prol da saúde...................................................
- Conclusão..........................................................................................................
- Referências Bibliográficas.................................................................................
- Relatório Final De Estágio Obrigatório..............................................................
- 5.1. Atividades desenvolvidas.............................................................................
- 5.2. Considerações Finais...................................................................................
vii LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1 - Esquema ilustrativo da microinjeção pronuclear..................................
FIGURA 2 - Injeção do agente viral previamente modificado..................................
FIGURA 3 – Micromanipulador................................................................................
FIGURA 4 - Técnica de transferência nuclear.........................................................
FIGURA 5 - SMGT utilizando a incubação de espermatozoides...........................
FIGURA 6 - Comparação entre o salmão transgênico e o não transgênico..........
ix RESUMO
TRANSGENIA ANIMAL E SUAS APLICAÇÕES
A produção de animais alterados em laboratório, tem proporcionado a oportunidade de obtenção de ganhos nas mais diversas áreas. Na produção animal, animais transgênicos são capazes de produzir leite com composição modificada, podendo beneficiar várias pessoas, principalmente as intolerantes à lactose e os alérgicos à proteína do leite. Eles podem também produzir mais carne, lã ou leite, além da possibilidade de ter sua resistência a doenças aumentada. Animais modificados também podem ser usados em prol da saúde humana, podendo ser utilizados como biorreatores para produção de proteínas farmacêuticas, como doadores de órgãos para humanos ou até como modelos para estudar doenças humanas como o câncer e o Alzheimer. Atualmente existem vários métodos para se produzir animais transgênicos e independente da metodologia a ser utilizada, três passos básicos fazem parte da maioria das técnicas, sendo eles a aquisição de um embrião ou ovócito da espécie a ser alterada; introdução do gene de interesse dentro do embrião ou do ovócito; e por fim, a transferência dos embriões para as fêmeas receptoras. Para criar animais transgênicos, pode-se optar por qualquer um dos métodos existentes, como a microinjeção pronuclear, a introdução de gene por retrovírus, a transferência de gene mediada por células tronco-embrionárias, além de várias outras.
Palavras-chave: animais transgênicos, biorreatores, produção animal, saúde humana.
x ABSTRACT
TRANSGENIC ANIMALS AND THEIR APPLICATIONS
Production of modified animals provided the opportunity to achieve improvement in several fields. In animal production, transgenic animals are able to produce milk with altered composition, benefitting many people, especially those lactose intolerant and allergic to milk protein. They can also produce more meat, wool or milk, in addition to the possibility of to be more resistant to diseases. Modified animals can also be used in support of human health, being employed as bioreactors for pharmaceuticals proteins production, as organ donors to humans or even as models in the study of human diseases, such as cancer and Alzheimer. There are several methods to produce transgenic animals currently, and independent of the methodology chosen, three basic steps are part of most of techniques, being them the acquisition of an embryo or oocyte of the specie chosen to be modified, the introduction of exogenous genetic information inside the embryo or oocyte and finally the introduction of the embryos in recipient females. In order to create transgenic animals, any of the existent methods can be elected, between them pronuclear microinjection, introduction of the gene by retrovirus, gene transference mediated by embryonic stem cells, among several others.
Keywords: animal production, bioreactors, human health, transgenic animals.
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A transgenia animal ainda é algo muito recente, e um dos desafios para produzir animais transgênicos é exatamente o alto custo para pesquisa e obtenção de resultados satisfatórios. Outra questão muito polêmica é em relação à ética na experimentação animal que muito se tem falado no século XXI. O objetivo desta revisão bibliográfica é destacar as técnicas, os pontos positivos e desafios, além de outras informações relevantes referentes à transgenia animal.
2. Revisão De Literatura
2.1. Transgenia animal
Existem varias técnicas para produzir um animal transgênico, entretanto todas elas possuem o mesmo objetivo, que é o de produzir um animal com alguma característica especial de interesse humano. São exemplos de objetivos da transgenia animal: maior conversão alimentar em animais domésticos, resistência a doenças em humanos ou animais, resistência a parasitos, carne de maior qualidade, maior produção de leite, produção de substancias farmacêuticas, produzir animais mais adaptados a um determinado ambiente e transplantes de órgãos (CASTRO, 2001 CAMARA et al., 2008).
2.2. Métodos
O método a ser utilizado vai depender do tipo de alteração genética que se deseja fazer, podendo ser um procedimento de modificação, introdução ou inativação de um gene (PESQUERO et al., 2007; KUMAR et al., 2013). Para se produzir um animal transgênico, é necessário realizar no mínimo três passos essenciais independente da metodologia a ser realizada, sendo eles: a aquisição de um embrião ou ovócito da espécie a ser alterada; introdução da informação genética dentro do embrião ou do ovócito; e por fim a transferência dos embriões para as fêmeas receptoras. Estes três processos fazem parte da maioria das manipulações embrionárias exigidas para se criar um animal transgênico (CASTRO, 2001).
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Das técnicas existentes, podemos citar a microinjeção pronuclear, transferência de gene mediada por espermatozoides, infecção de embriões por retrovírus (RIBEIRO & AZEVEDO, 2001; DORFMAN, 2012), transferência de DNA mediada por transposons, agregação ou injeção de células-tronco embrionárias geneticamente modificadas, transferência de segmentos de cromossomos, entre outras (PESQUERO et al., 2007; AIGNER et al., 2010). A seguir, serão apresentadas as principais técnicas e características dos procedimentos mais utilizados na transgenia animal.
2.2.1. Microinjeção pronuclear
A microinjeção pronuclear foi uma das primeiras técnicas a ser utilizada com sucesso em mamíferos. Inicialmente foi utilizada em ratos, e pouco tempo depois o método foi implementado em outras espécies como coelhos, ovelhas, aves, peixes e suínos (GORDON et al., 1980; GIBBONS et al., 2014). O processo é realizado em um microscópio invertido equipado com micromanipuladores (GADEA & VÁZQUEZ, 2010), onde uma micropipeta contendo segmentos de DNA (aproximadamente 1000 cópias em 1-2 pL ) atravessa a zona pelúcida do ovócito fecundado (HOUDEBINE, 2003) e é feita a injeção do DNA em um dos pró-núcleos (Figura 1) (CLARK & WHITELAW, 2003; BOVERHOF et al., 2011). O ideal é que a microinjeção pronuclear seja feita entre 15 e 20h após a fecundação, em caprinos deve-se realizar primeiramente a centrifugação dos ovócitos, devido a grande quantidade de gotas lipídicas em seu citoplasma (FREITAS et al., 2014). Depois de injetado o embrião permanece em cultivo in vitro até que seja transferido para receptoras sincronizadas (RUMPF & MELO, 2005). Das vantagens da microinjeção pronuclear, podemos citar a grande probabilidade de transmissão da linhagem germinativa do transgene, um baixo limite no tamanho ou tipo de DNA sintetizado, além de possuir uma relativa estabilidade devido a herdabilidade do gene transgênico (PINKERT, 2004). Por outro lado o método também possui desvantagens, como o custo e o tempo gasto na realização da micromanipulação e a microinjeção, não possui a garantia de integração do DNA exógeno (PINKERT, 2004), a incorporação de genes é
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(CHAN et al., 1998; HOFMANN et al., 2004). O método também pode ser feito expondo os embriões in vitro a soluções concentradas de vírus recombinantes (PURSEL & REXROAD, 1993), com o gene de interesse previamente inserido no retrovírus. Depois de infectados os embriões são transferidos para as fêmeas receptoras, assim completando a gestação (PEÑARANDA & ASENSIO, 2007).
FIGURA 2 – Injeção do agente viral previamente modificado, no espaço entre a zona pelúcida e a membrana do zigoto (espaço perivitelino) (PFEIFER, 2004).
O método apesar de interessante também possui limitações, como o limitado tamanho de material genético carreado pelo retrovírus (HU & PATHAK, 2000). Além disso, somente células em divisão podem ser infectadas (MILLER et al., 1990), sendo que o retrovírus se integra ao DNA do hospedeiro de forma aleatória, podendo causar resultados inesperados(JAHNER & JAENISCH, 1985), como mutações ou morte fetal. Em animais de produção, a eficiência da transgenia utilizando vetores retrovirais chega a ser 50 vezes superior em relação ao que se consegue através da microinjeção pronuclear (PEÑARANDA & ASENSIO, 2007).
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2.2.3. Alteração genética mediada por transposons
Transposons são segmentos de DNA que podem se mover e se multiplicar no genoma de uma célula, fazendo a integração do material genético de forma aleatória (HOUDEBINE, 2009) em um processo chamado de transposição (SILVA, 2009). Existem dois grupos de transposons, os transposons classe I e classe II. Os retrotransposons também conhecidos como transposons classe I, são sequências de DNA que são transcritas em RNA e estas retranscritas em DNA, as cópias geradas se integram em múltiplos sítios do genoma do indivíduo sob ação da enzima transcriptase reversa (BOSCH et al., 2015). O “DNA transposons” ou transposons classe II são sequências de DNA que se movimentam no genoma do hospedeiro por intermédio da enzima transposase, onde cópias do DNA não são geradas (BOSCH et al., 2015). Os transposons foram identificados primeiramente no milho (MCCLINTOCK 1950), pouco tempo depois eles foram detectados no genoma de eucariotos e procariotos (MAKALOWSKI et al., 2012). Graças a engenharia genética já se pode manipular os transposons fazendo que eles transportem DNA exógeno para incorporar no material genético do futuro animal transgênico. Em vertebrados quase todos os transposons já descobertos, foram inativados por mutações naturais. Mas já foi possível obter transposon ativo capaz de realizar transposição, ele pertence à uma família de peixes actinopterigeos (salmonídeos), tal segmento de DNA foi obtido através de múltiplas mutagêneses dirigidas (FERNÁNDEZ, 2008). Uma das desvantagens do transposon na transgenia é o limitado espaço para transportar genes externos (HOUDEBINE, 2002). Para se conseguir mais espaço e evitar que o transposon recombinante se alastre de forma desgovernada, é retirado o gene da enzima transposase, sendo adicionada no vetor, uma transposase exógena a fim de integrar o vetor recombinante no genoma hospedeiro (SILVA, 2009).
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A transferência nuclear é um método que possui uma vantagem muito importante na produção de animais modificados, porque já é possível alterar o material genético de células doadoras de núcleo antes da TN. Existem várias técnicas para se alterar a informação genética de células que serão utilizadas, como a alteração via vetores retrovirais, via lipossomas e por eletroporação (BRESSAN, 2008). Para a produção de animais transgênicos, a técnica de transferência nuclear se torna uma opção interessante em relação ao método de microinjeção pronuclear, porque nela se economiza mais tempo e custos (POLEJAEVA & CAMPBELL, 2000; VISINTIN et al., 2008). E ainda é possível produzir “knock-out” gênicos e trocas de alelos por recombinação homóloga entre o DNA endógeno e exógeno das células doadoras (MCCREATH et al., 2000).
FIGURA 4 – Esquema ilustrativo que demonstra a técnica de transgenia animal por transferência nuclear. Na coluna (A) a célula com o gene de interesse é obtida, no (B) é coletado um ovócito na metáfase II para ser enucleado, no (C) a célula com o gene modificado é transferida para o ovócito enucleado, (D) processo de cultivo in vitro com posterior transferência do embrião para receptora (NIEMANN et al ., 2009).
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O sucesso nos métodos de transgenia por TN depende de certas exigências, e uma das mais importantes é a necessidade de células primárias ou de linhagens celulares compatíveis com as alterações genéticas essenciais para o ganho ou perda da função do futuro animal (VISINTIN et al., 2008). Mesmo assim a taxa de sucesso da técnica muitas vezes não ultrapassa 1% do total (SOLTER, 2000). Essa menor viabilidade dos embriões é expressa principalmente por causa da diminuição na taxa de implantação, pela maior mortalidade fetal e perinatal e também pelas diversas anomalias apresentadas em animais recém-nascidos (LIMA & SANTOS, 2010).
2.2.5. Transferência de gene mediada por espermatozoides
A transferência de gene mediada por espermatozoide (SMGT) é uma técnica que utiliza a habilidade do espermatozoide de transferir, incorporar e carrear o DNA para o ovócito durante a fertilização sendo possível produzir animais geneticamente alterados (LAVITRANO et al., 1989). A SMGT apesar de ser um ótimo método para gerar animais transgênicos, ainda possui limitações como a reduzida incorporação de DNAs exógenos pelo espermatozoide (CAMPOS, 2011). Outro problema é a atuação de enzimas DNases presentes no plasma seminal ou dentro do espermatozoide, que são capazes de destruir o material genético exógeno, o que irá reduzir o sucesso da transferência do gene externo (COLLARES et al., 2010). O processo de incorporação do gene exógeno na SMGT pode ser feito de diversas formas como eletroporação, onde pulsos elétricos alternados irão abrir poros na membrana plasmática do espermatozoide que facilitará a internalização do DNA exógeno; o método de lipofecção também pode ser utilizado, que consiste na interação do lipossomo carregado positivamente com o DNA de carga negativa que formará lipoplexos que sofrem endocitose, e serão carreados para o núcleo. Outra maneira é através da incubação dos espermatozoides com o DNA exógeno (Figura 5), onde o sêmen é previamente lavado, para que o IF-1 (Fator inibitório 1) responsável por impedir a ligação de DNA ao espermatozoide seja removido, em seguida ele é incubado junto com gene de interesse. Haverá então a ligação do DNA com PLDNAs (proteínas ligadoras de DNA) presentes na