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Um dado interessante é que a tipagem sanguínea de pacientes que pertencem ... TASSIER/aula-pratica-aglutinacao-v-out-12-17.pdf>, Acesso em: 17 de abril de.
Tipologia: Notas de aula
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P R O J E T O
Quem somos? Objetivo desse material Sistema ABO e RhD Técnicas de tipagem. Quais suas vantagens e desvantagens? Técnica em lâmina Técnica em gel Técnica em tubos Técnica em microplacas Metodologia de realização Técnica em tubo Técnica de microplacas Técnica em gel teste Técnica em lâmina Técnica de tipagem fator RhD Realização da leitura e seus possíveis erros Técnica em tubo Técnica em microplaca Técnica em gel teste Técnica em lâmina Pré requisito de realização Referências
SUMÁRIO O grupo PET Farmácia integrante do Programa de Educação Tutorial, vinculado ao Curso de Graduação em Farmácia da Faculdade de Ciências farmacêuticas, Alimentos e Nutrição -FACFAN, da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul - UFMS, atuando fortemente junto a comunidade interna e externa da UFMS envolvidos nos conceitos de uso racional de medicamentos, cuidados na administração, manutenção do tratamento farmacológico e no descarte adequado dos produtos residuais finais. O grupo realiza diferentes estratégias para atingir a comunidade, como promoção de eventos/palestras/discussões em diferentes ambientes acadêmicos e comunitários, distribuição de material educativo, ações em escolas públicas para integração da universidade com a comunidade e dispõe em mídias sociais informações relevantes para auxiliar a população na utilização correta de medicamento. Atualmente contamos com a participação de quinze petianos e do nosso tutor Teófilo F. Mazon Cardoso
QUEM SOMOS?
O objetivo da proposta é disponibilizar material didático com embasamento técnico científico para o aperfeiçoamento técnico dos acadêmicos com o intuito de habilita-los profissionalmente, pois como membros atuantes na equipe multiprofissional da saúde desempenham papel fundamental para a melhoria na qualidade de vida da população. Este material informativo também pretende facilitar o acesso às informações científicas atualizadas e fidedignas para a população externa.
OBJETIVO
VISÃO GERAL
Localiza dentro da técnica direta de tipagem, antigamente, as provas de aglutinação eram realizadas em lâminas de microscopia, entretanto, no Brasil, determinou-se pela legislação que as provas de aglutinação não serão mais feitas em lâminas, pois essa técnica é a menos vantajosa. Vantagem: teste rápido, econômico, passível de ser automatizado mas permite ser executado sem a necessidade de equipamentos específicos. Essa técnica pode ser utilizada em tipagem ABO de emergência, sempre devendo ser suplementada por alguma das outras técnicas. Desvantagem: menos sensível, apresenta maior quantidade de resultados falso positivos em virtude da rapidez com que a mistura de reação seca favorecendo a agregação das células, apresentam então maior dificuldade na interpretação.
Neste método, os aglutinados são capturados num microtubo que contém partículas de gel que irão reter os glóbulos vermelhos aglutinados o que permite que as células não aglutinadas passem através de uma coluna para a parte inferior. O método pode ser modificado para diferentes tipos de testes. Microtubos específicos podem permitir a separação de diferentes populações de células. Vantagens: a facilidade de utilização, mesmo que a experiência laboratorial seja muito pouca; a estabilidade das reações por longos períodos de tempo; a necessidade de volumes de amostras mais reduzidos; e o fato de ser uma tecnologia que facilmente é automatizada, além de ser sensível, reprodutivo, fornece reações claras e estáveis, o que melhora a interpretação dos resultados. Desvantagens: método moroso e dispendioso, pelos equipamentos que utiliza e alto custo de execução.
VANTAGENS E DESVANTAGENS
QUAIS AS TÉCNICAS
DE TIPAGEM?
O teste em tubo é um método muito comum, que tem sido utilizado ao longo dos anos e que perdura até os dias de hoje. É realizada pela classificação direta que pesquisa a presença dos antígenos ABO nas hemácias testes, usando anti-soros, e a técnica reversa pesquisa seus anticorpos correspondentes no soro, utilizando hemácias comerciais.
Vantagem: possibilidade de incubação por tempo relativamente longo, sem secagem do conteúdo dos tubos, apresenta simplicidade na leitura e classificação dos resultados, além de ser mais limpa, higiênica e sensível.
Desvantagem: na direta pode ocorrer poliaglutinação de hemácias; Antígenos A e B fracos; Aglutinação inespecífica pela presença de geléia de Wharton; Rouleaux: é o empilhamento das hemácias tornando todas as reações falsamente positivas, inclusive o controle. E na realização da técnica reversa, desvantagens como: ocorrer que o subgrupo de A e AB com presença de anti‑A1; Presença de autoaglutinina fria na amostra; Ausência ou diminuição de anticorpos naturais anti‑A e anti‑B, como em recém‑nascidos, idosos e imunodeprimidos; Presença de anticorpo irregular no plasma ou soro. Portanto um método de difícil automatização.
VANTAGENS E DESVANTAGENS
QUAIS AS TÉCNICAS
DE TIPAGEM?
Rotular três tubos de ensaio: A, B, AB; Nos tubos adequadamente rotulados, colocar uma gota dos soros anti‑A, anti‑B e anti‑AB, respectivamente; A cada tubo acrescentar uma gota de suspensão de hemácias da amostra = 50 microlitros, sendo essa suspensão a 5% em soro fisiológico; Agitar os tubos e centrifugar adequadamente (1.000 rpm durante um minuto ou 3.400 rpm durante 15 segundos); Fazer a leitura da aglutinação contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o botão de aglutinação.
São utilizados tubos de vidro ou plástico medindo 10 mm ou 12 mm x 75 mm, onde são dispensados reagentes e amostras. Metodologia:
Rotular as microplacas e adicionar 1 gota de cada reagente a ser testado; Preparar uma suspensão, aproximadamente a 2-4%, de glóbulos vermelhos em soro fisiológico (os glóbulos podem ser lavados antes da ressuspensão em soro fisiológico); Utilizando uma pipeta, adicionar 1 gota de cada suspensão de glóbulos vermelhos aos poços apropriados; Misturar completamente o conteúdo de cada poço. Centrifugar a placa a 100-250 x g durante 40-60 segundos; Ressuspender cada botão de glóbulos agitando manualmente a placa ou colocando-a num agitador de microplacas. Examinar cada poço para verificar a existência de aglutinação. Registar os resultados.
O método consiste na utilização de microplacas de acrílico com fundo em “U” ou fundo em “V”. Existem também microplacas com membrana imuno‑ativa fixada na superfície dos poços. Metodologia:
METODOLOGIA PARA
REALIZAÇÃO DA TÉCNICA
Todos os cartões devem estar centrifugados e os reagentes e amostras devem permanecer em temperatura ambiente no mínimo 15 minutos antes do início dos testes; Centrifugar a amostra de sangue durante 5 minutos a 3400 rpm; Retirar o lacre do cartão; Dispensar uma gota de hemácias A1 no microtubo A1 e uma gota de hemácias B no microtubo B; Dispensar 50 microlitros de plasma/soro do paciente/receptor nos microtubos A1 e B; Preparar suspensão de hemácias a 1% diluindo 12,5 microlitros de concentrado de hemácias do paciente/receptor em 1mL de LISS, homogeneizando adequadamente; Dispensar 50 microlitros da suspensão nos microtubos A, B, D, ctl(controle); Centrifugar de acordo com instruções do fabricante.
Microtécnica em que se utilizam cartões contendo micro tubos com Gel Sephadex 6100 ou Poliacrilamida. Metodologia:
Adicionar gota de sangue em cada lado da placa; Adicionar de um lado soro anti-A e do outro soro anti-B; Misturar com uma paleta; Realizar a leitura;
Metodologia:
METODOLOGIA PARA
REALIZAÇÃO DA TÉCNICA
Identificar dois tubos de ensaio como D e CTL (controle); No tubo indicado como D uma gota de soro anti Rho (D) e no tubo identificado como CTL (controle), uma gota de controle Th; Aos dois tubos adicionar uma gota de suspensão de GV (glóbulos vermelhos) a 5% em solução salina. Essa suspensão, pode ser feita no próprio plasma ou soro; Misturar bem e centrifugar os dois tubos a 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto; Ressuspender o sedimento, agitando delicadamente os tubos e ler macroscopicamente a aglutinação; Se o teste for negativo (aglutinação ausente), proceder conforme indicado no teste para pesquisa de D fraco.
Metodologia
Coleta do sangue em tubo apropriado. Qualidade da coleta. Uso de vidrarias limpas e sem resíduos de detergente (que podem causar resultados falso‑positivos). Técnica de separação do soro adequada. Preparo correto das suspensões de hemácias (concentração muito abaixo ou acima da estabelecida pelos fabricantes podem causar resultados falso negativos). Qualidade dos reagentes empregados. Padronização dos ensaios técnicos. Qualidade dos equipamentos empregados. Pessoal técnico capacitado
Técnica em microplacas : Quando está aglutinado o soro tem a quantidade de anticorpos suficientes, formando um complexo de anticorpos e antígenos no fundo da placa. Em caso de não-aglutinação da amostra para determinado soro, ocorre devido a ausência do anticorpo para reação.
Fatores que influenciam os testes:
Técnica em gel teste: A interpretação é baseada na observação da aglutinação das hemácias na coluna cromatográfica, sendo negativa, com a formação de um botão de hemácias no fundo do microtubo. O gel aprisiona os agregados de hemácias, funcionando como um filtro durante a centrifugação, de forma que se tem um resultado positivo quando a aglutinação é classificada de 1+ a 4+.
Possíveis erros: Para qualquer outro tipo de combinação de resultados os testes deverão ser considerados inconclusivos quanto à tipagem ABO. A presença de aglutinação de qualquer intensidade no microtubo controle “ctl” invalida todos os resultados.
REALIZAÇÃO DA LEITURA
Se a amostra aglutinar ao adicionar o soro anti-A e não aglutinar com o soro anti-B significa que tem o tipo sanguíneo A. Se a amostra não aglutinar ao adicionar o soro anti-A e aglutinar com o soro anti-B significa que tem o tipo sanguíneo B. Se aglutinar com os dois soros, a pessoa tem tipo sanguíneo AB. Se não aglutinar com nenhum dos dois, significado que é o tipo sanguíneo O.
Técnica em lâmina: A interpretação dos resultados em lâmina também é baseada na aglutinação, colocando a amostra em contato com o soro anti A, anti- B e anti- AB. Como mostrado na figura.
Coleta do sangue em tubo inapropriado. Qualidade da coleta. Uso de vidrarias sujas e com resíduos de detergente (que podem causar resultados falso‑positivos). Técnica de separação do soro inadequada. Preparo incorreto das suspensões de hemácias (concentração muito abaixo ou acima da estabelecida pelos fabricantes podem causar resultados falso negativos). Qualidade dos reagentes empregados. Padronização dos ensaios técnicos. Qualidade dos equipamentos empregados. Pessoal técnico incapacitado.
Se aglutinar significa que o sangue contém antígeno Rh +. Se não aglutinar significa que o sangue não contém antígeno Rh. Então é Rh -.
Possíveis erros:
Sistema RhD:
REALIZAÇÃO DA LEITURA
REFERÊNCIAS
