thaís de souza rocha estudo da hidrólise enzimática do amido ..., Notas de estudo de Raios-X

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THAÍS DE SOUZA ROCHA

ESTUDO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO DE

MANDIOQUINHA-SALSA ( Arracacia xanthorrhiza ): EFEITO DO

TAMANHO DOS GRÂNULOS

São José do Rio Preto-SP

THAÍS DE SOUZA ROCHA

ESTUDO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO DE

MANDIOQUINHA-SALSA ( Arracacia xanthorrhiza ): EFEITO DO

TAMANHO DOS GRÂNULOS

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto, para obtenção do Título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de Ciência e Tecnologia de Alimentos.

Orientadora: Profª. Drª. Célia Maria Landi Franco

São José do Rio Preto – SP 2007

THAÍS DE SOUZA ROCHA

ESTUDO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO DE

MANDIOQUINHA-SALSA ( Arracacia xanthorrhiza ): EFEITO DO

TAMANHO DOS GRÂNULOS

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto, para obtenção do Título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de Ciência e Tecnologia de Alimentos.

BANCA EXAMINADORA

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Profª Drª Célia Maria Landi Franco Universidade Estadual Paulista São José do Rio Preto, SP

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Prof. Drª Maria Victória Eiras Grossmann - Universidade Estadual de Londrina Londrina, PR

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Profª Drª Eleni Gomes Universidade Estadual Paulista São José do Rio Preto, SP

São José do Rio Preto, 27 de Fevereiro de 2007.

Dedico este trabalho a toda minha família.

“Eu fiz um pacto de coexistência pacífica com o tempo: nem ele me persegue; nem eu fujo dele. Um dia a gente se encontra...” (Mário Lago)

Resumo

A hidrólise enzimática do amido granular tem sido utilizada para estudo da estrutura e propriedades físico-químicas dos grânulos. Ela depende, entre outros fatores, da origem botânica do amido, do sistema enzimático utilizado e do tamanho dos grânulos. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito do tamanho dos grânulos na suscetibilidade enzimática do amido de mandioquinha-salsa. Amidos de duas variedades (Amarela de Carandaí, AC e Amarela de Senador Amaral, ASA) foram isolados, fracionados por tamanho e classificados em grânulos integrais (sem separação); grânulos grandes (≥ 20μm); grânulos médios (>10 e < 20μm) e grânulos pequenos (≤ 10μm). Os amidos granulares integrais e fracionados foram submetidos à hidrólise enzimática com α-amilase bacteriana e amiloglucosidase fúngica. As amostras antes e após hidrólise foram analisadas quanto a suas características estruturais e físico-químicas. Os amidos nativos mostraram, a partir de microscopia óptica e eletrônica de varredura, formatos circulares para os grânulos grandes e poligonais para os pequenos. A superfície granular apresentou-se lisa, mostrando alguns grânulos, principalmente os de maior diâmetro, com depressões e perfurações. Dos cromatogramas de permeação em gel Sepharose CL-2B não foi possível observar diferenças nos tamanhos moleculares para os amidos de ambas as variedades de mandioquinha-salsa. O teor de amilose, maior para as amostras da variedade AC, se concentrou principalmente nos grânulos grandes. Ambas as variedades mostraram padrão de difração de raios-X do tipo B e o índice de cristalinidade relativa (IC) (~20%) não diferiu para os diferentes amidos apesar da intensidade dos picos ter diminuído para os grânulos de menor diâmetro. As viscosidades intrínsecas dos amidos das variedades AC e ASA foram menores 24% e 14%, respectivamente, para os grânulos pequenos em relação aos grandes. As temperaturas de gelatinização, obtidas do DSC, diminuíram com a redução no tamanho dos grânulos, enquanto a entalpia permaneceu inalterada. Quanto menor o tamanho do grânulo maior a suscetibilidade enzimática dos amidos. Após hidrólise foi possível observar grânulos com superfície mais áspera e aumento das perfurações, principalmente nos grânulos grandes, sugerindo que as enzimas perfuraram os grânulos e a degradação de alguns ocorreu de dentro para fora. A redução no diâmetro médio dos grânulos (20% em média) após hidrólise também

Abstract

Enzymatic hydrolysis of granular starch has been used to study the structure and the physicochemical properties of the granules. It depends, among others, on the starch botanic source, on the enzymatic system used and on the size of the granules. The aim of this work was to investigate the effect of granule size on enzymatic susceptibility and on structural and physicochemical properties of Peruvian Carrot starch. Starches from two varieties (Amarela de Carandaí, AC and Amarela de Senador Amaral, ASA) were isoladed, fractionated by size and classified into whole granules (without separation); large granules (≥ 20 μm); medium granules (> 10 e <

20μm) and small granules (≤ 10 μm). The whole and fractionated granular starches were hydrolysed with bacterial α-amylase and fungal amyloglucosidase. Samples, before and after hydrolysis, were analyzed regarding their structural and physicochemical characteristics. The whole and fractionated native starches shown in optical microscope and scanning electron microscope circular shape for large granules and polygonal shape for small granules. The granular surface was smooth with some had openings, especially for the larges granules, with some depressions and holes. From chromatograms of gel permeation in Sepharose CL-2B was not possible to observe differences on the molecular size from both varieties of Peruvian Carrot. The amylose content, that was higher to AC variety, was concentraded mainly in large granules. Both varieties exhibited B-type X-ray diffraction pattern and relative degree of cristallinity (DC) (~20%) was not different for the different starches, despite the intensity of the peaks decrease for small granules. The intrinsic viscosity of starches from both varieties was smallest 24% and 14%, respectively, to small granules in relation of large granules. Gelatinization temperatures, from DSC, decreased as the granule sizes decreased, while the enthalpy remained the same. The smaller the granule size the higher was the enzymatic susceptibility. After hydrolysis, was possible to observe rough surface and an increase of holes on the starch granule, mainly on large granules, suggesting that the enzymes had holed the granules and the degradation of some granules occurred from inside to outside. The decrease on the average size of starches (20%, in average) after hydrolysis also suggests an exo-corrosion with a surface solubilization of starches from both varieties. The amylose content did not change after hydrolysis for whole starches from both varieties and for fractionated starch from variety AC, but there were a

decrease on amylose content for fractionated starches from ASA variety. The X-ray diffraction pattern of all samples did not change after hydrolysis, but the intensity of the peaks on the difractograms decreased, while the DC remained the same for whole and small starches and decreased to large granules. The intrinsic viscosity decreased especially for AC variety samples, while the gelatinization temperatures increased for all starches after hydrolysis. The results had suggested that small granules are more susceptible to enzymatic action, mainly on function of their small surface area and the enzymes attack also amorphous and crystalline regions on starch granules.

Figura 17: Quantidade de açúcar redutor produzida durante a hidrólise enzimática do amido de mandioquinha-salsa da variedade Amarela de Carandaí antes e após fracionamento por tamanho.................................................................... Figura 18: Quantidade de açúcar redutor produzida durante a hidrólise enzimática do amido de mandioquinha-salsa da variedade Amarela de Senador Amaral antes e após fracionamento por tamanho ....................................................... Figura 19: Distribuição do tamanho dos grânulos das diferentes frações antes e após hidrólise da variedade Amarela de Carandaí ..................................................

Figura 20: Distribuição do tamanho dos grânulos das diferentes frações antes e após hidrólise da variedade Amarela de Senados Amaral....................................... Figura 21: Micrografias dos grânulos amido fracionados por tamanho da variedade Amarela de Carandaí após hidrólise enzimática observados em microscópio óptico sob luz normal .................................................................. Figura 22: Micrografias dos grânulos amido fracionados por tamanho da variedade Amarela de Senador Amaral após hidrólise enzimática observados em microscópio óptico sob luz normal ..................................................................

Figura 23: Micrografias dos grânulos de amido fracionados por tamanho da variedade Amarela de Carandaí após hidrólise observados em microscópio eletrônico de varredura ................................................................................................... Figura 24: Micrografias dos grânulos de amido fracionados por tamanho da variedade Amarela de Senador Amaral após hidrólise observados em microscópio eletrônico de varredura ................................................................................... Figura 25: Perfil de eluição dos amidos de mandioquinha-salsa fracionados por tamanho antes da hidrólise enzimática em Sepharose CL-2B ........................ Figura 26: Difractogramas de raios-X dos amidos de mandioquinha-salsa integrais e fracionados por tamanho ................................................................................ Figura 27: Viscosidade intrínseca dos amidos integrais e separados por tamanho antes e após hidrólise da variedade Amarela de Carandaí ............................. Figura 28: Viscosidade intrínseca dos amidos integrais e separados por tamanho antes e após hidrólise da variedade Amarela de Senador Amaral ..................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composição química dos amidos de mandioquinha-salsa (em%)...................

Tabela 2: Tamanho dos grânulos dos amidos de mandioquinha-salsa ........................... Tabela 3: Teor de amilose dos amidos de mandioquinha-salsa...................................... Tabela 4: Índice de cristalinidade (IC) e intensidade (CPS) dos picos principais dos difractogramas de raios-X dos amidos de mandioquinha-salsa....................... Tabela 5: Viscosidade intrínseca dos amidos de mandioquinha-salsa............................ Tabela 6: Propriedades de pasta dos amidos de mandioquinha-salsa............................ Tabela 7: Propriedades térmicas dos amidos de mandioquinha-salsa............................ Tabela 8: Tamanho médio dos grânulos das diferentes frações dos amidos de mandioquinha-salsa ........................................................................................ Tabela 9: Porcentagem de hidrólise por diferença de peso dos amidos integrais e separados por tamanho dos grânulos ............................................................. Tabela 10: Tamanho médio dos grânulos de amido separados por tamanho antes e após a hidrólise enzimática .............................................................................

Tabela 11: Teor de amilose (%) dos amidos de mandioquinha-salsa integrais e fracionados por tamanho antes e após hidrólise ............................................. Tabela 12: Índice de cristalinidade (IC) e intensidade (CPS) dos principais picos dos difractogramas de raios-X dos amidos de mandioquinha-salsa integrais e fracionados por tamanho antes e após hidrólise da variedade Amarela de Carandaí ......................................................................................................... Tabela 13: Propriedades térmicas dos amidos de mandioquinha-salsa integrais e fracionados por tamanho antes e após hidrólise da variedade Amarela de Carandaí ......................................................................................................... Tabela 14: Propriedades térmicas dos amidos de mandioquinha-salsa integrais e fracionados por tamanho antes e após hidrólise da variedade Amarela de Senador Amaral .............................................................................................

• 1. INTRODUÇÃO
• 2. REVISÃO DE LITERATURA
• 2.1 O GRÂNULO DE AMIDO
• 2.1.1 Constituintes menores do amido
• 2.1.2 Forma e tamanho dos grânulos de amido
• 2.1.3 Propriedades funcionais dos amidos
• 2.2 A MANDIOQUINHA-SALSA..............................................................................
• 2.2.1 O amido de mandioquinha-salsa
• 2.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO GRANULAR
• 2.3.1 Ação da enzima α -amilase no grânulo de amido
• 2.3.2 Ação da enzima amiloglucosidase fúngica no grânulo de amido
• 2.3.3 Ação sinérgica das enzimas α -amilase e amiloglucosidase fúngica
• 2.3.4 Efeito do tamanho dos grânulos na hidrólise enzimática
• 3. MATERIAIS E MÉTODOS
• 3.1 MATERIAIS
• 3.2 MÉTODOS
• 3.2.1 Isolamento dos amidos
• 3.2.2 Caracterização dos amidos
• 3.2.2.1 Composição centesimal....................................................................................
• 3.2.2.2 Forma e distribuição do tamanho dos grânulos
• 3.2.2.3 Distribuição do tamanho molecular dos amidos................................................
• 3.2.2.4 Teor de amilose
• 3.2.2.5 Difração de raios-X
• 3.2.2.6 Viscosidade intrínseca......................................................................................
• 3.2.2.7 Propriedades de pasta......................................................................................
• 3.2.2.8 Poder de inchamento
• 3.2.2.9 Propriedades térmicas......................................................................................
• 3.2.3 Separação dos grânulos por tamanho
• 3.2.3.1 Forma e distribuição de tamanho dos grânulos
• 3.2.4 Atividade enzimática
• 3.2.4.1 Atividade da enzima α-amilase bacteriana........................................................
• 3.2.4.2 Atividade da enzima amiloglucosidase fúngica
• 3.2.5 Hidrólise enzimática
• 3.2.5.1 Forma e distribuição de tamanho dos grânulos
• antes e após hidrólise 3.2.6 Propriedades estruturais e físico-químicas dos amidos fracionados
• 3.2.6.1 Distribuição do tamanho molecular dos amidos................................................
• 3.2.6.2 Teor de amilose
• 3.2.6.3 Difração de raios-X
• 3.2.6.4 Viscosidade intrínseca......................................................................................
• 3.2.6.5 Propriedades térmicas......................................................................................
• 3.2.7 Análise estatística
• 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
• 4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS AMIDOS
• 4.1.1 Composição química dos amidos
• 4.1.2 Forma e distribuição do tamanho dos grânulos
• 4.1.3 Distribuição do tamanho molecular dos amidos
• 4.1.4 Teor de amilose
• 4.1.5 Difração de raios-X
• 4.1.6 Viscosidade intrínseca
• 4.1.7 Propriedades de pasta
• 4.1.8 Poder de inchamento
• 4.1.9 Propriedades térmicas
• 4.2 SEPARAÇÃO POR TAMANHO DOS GRÂNULOS
• 4.2.1 Forma e distribuição do tamanho dos grânulos das diferentes frações
• 4.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
• 4.3.1 Atividade enzimática
• 4.3.2 Hidrólise enzimática dos amidos antes e após separação por tamanho
• 4.3.3 Forma e distribuição de tamanho dos grânulos após hidrólise
• FRACIONADOS ANTES E APÓS HIDRÓLISE.................................................. 4.4 PROPRIEDADES ESTRUTURAIS E FÍSICO-QUÍMICAS DOS AMIDOS
• 4.4.1 Distribuição do tamanho molecular dos amidos
• 4.4.2 Teor de amilose
• 4.4.3 Difração de raios-X
• 4.4.4 Viscosidade intrínseca
• 4.4.5 Propriedades térmicas
• 5. CONCLUSÕES
• 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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(PETERSON; FULCHER, 2001). O tamanho e forma de grânulos de amido estão entre os fatores de importância na determinação de usos potenciais. Geralmente, o tamanho se refere à média do diâmetro dos grânulos. A distribuição de tamanhos de grânulos pode variar de menores que 5 μm como no caso de amidos de arroz e maiores que 100 μm, como no amido de batata (SANGUANPONG et al., 2003). Lindeboom, Chang e Tyler (2004) classificaram grânulos grandes como maiores que 25 μm, médios com valores entre 10 e 25 μm, pequenos, entre 5 e 10 μm, e bem pequenos, com tamanhos menores que 5 μm. A estrutura do grânulo é importante para explicar as características funcionais identificadas no amido. Uma maneira indireta que possibilita o entendimento da estrutura física e química dos amidos é o uso de enzimas sobre o amido granular da cinética de ataque de enzimas (FRANCO et al., 2001). A taxa de hidrólise depende principalmente da origem botânica do amido, do sistema enzimático utilizado e do tamanho dos grânulos, entre outros fatores. Amidos que naturalmente apresentam superfície porosa, como os de milho, são degradados com maior facilidade que aqueles cuja superfície é lisa, como por exemplo, o de mandioca (FRANCO; CIACCO, 1992; FRANCO; CIACCO; TAVARES, 1998). Estudos relatam que a ação conjunta de enzimas para a digestão de amidos nativos apresenta bons resultados. O sinergismo mais comum estudado é de endo e exo enzimas (ROBERTSON et al., 2006), como no caso da α-amilase (endo) e da amiloglucosidase (exo). O tamanho dos grânulos influencia a taxa de hidrólise do amido granular. Franco, Ciacco e Tavares (1998) observaram que grânulos de amidos de menor diâmetro são mais suscetíveis à hidrólise que aqueles de maior diâmetro. A porcentagem de hidrólise aumenta conforme o tamanho do grânulo diminui. Este trabalho teve como objetivo investigar o efeito do tamanho dos grânulos na suscetibilidade enzimática do amido de mandioquinha-salsa, bem como nas suas propriedades estruturais e físico-químicas.

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2. R EVISÃO DE LITERATURA

2.1. O grânulo de amido

O amido é um carboidrato encontrado em abundância na natureza só competindo em quantidade com a celulose. É a fonte de reserva mais importante de todas as plantas, estando presente em sementes, raízes, tubérculos e algumas sementes de cereais (THE BRITISH NUTRITION FOUNDATION, 1990). Apresenta- se na forma de discretos grânulos com forma e tamanho dependentes da sua fonte botânica. Possui características químicas e físicas únicas, além de suas qualidades nutricionais, diferentes das dos outros carboidratos (BEMILLER; WHISTLER, 1996). Devido a suas propriedades físico-químicas e funcionais exclusivas, este carboidrato tem grande importância nos mais diversos setores industriais (FRANCO et al., 2001). As fontes mais importantes de amido são os grãos de cereais, representando cerca de 40 a 90% de seu peso seco, de leguminosas, entre 30 e 70%, e os tubérculos, de 65 a 85%, em base seca. O consumo de amido representa cerca de 70 - 80% das calorias consumidas nas dietas humanas em geral (CASALI; SEDYAMA, 1997). O amido é um homopolissacarídeo neutro formado por duas frações: amilose e amilopectina. A primeira é composta de unidades de glicose com ligações glicosídicas α-1,4 formando assim unidades de maltose e, a segunda, por unidades de glicose unidas em α-1,4 com cadeias de glicose ligadas em α-1,6 de modo que, além de unidades de maltose, tem-se, em menor proporção, isomaltose nos pontos de ramificação (Figura 1). Enquanto a amilose é uma molécula essencialmente linear, apresentando um pequeno número de ramificações (FRENCH, 1973; 1984; HIZUKURI; TAKEDA; YASUDA, 1981; BULÉON et al., 1998), a amilopectina é uma molécula altamente ramificada, mas com 5 a 6% de ligações α-1,6 nos pontos de ramificação (FRENCH, 1984; LINEBACK, 1984). As estruturas descritas podem ser representadas por uma estrutura aproximadamente linear para amilose, que pode formar estruturas helicoidais, e estruturas ramificadas para a amilopectina.