Correlações entre Micróglia e Memória Espacial em Cebus apella, Manuais, Projetos, Pesquisas de Estatística

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MEMÓRIA ESPACIAL E MORFOMETRIA TRIDIMENSIONAL DA MICRÓGLIA

DE CA1 E DO GIRO DENTEADO DO Cebus apella****. CARLOS SANTOS FILHO Belém

CARLOS SANTOS FILHO

MEMÓRIA ESPACIAL E MORFOMETRIA TRIDIMENSIONAL DA MICRÓGLIA

DE CA1 E DO GIRO DENTEADO DO Cebus apella****. Tese de Doutoramento a ser apresentada ao Programa de Pós-graduação em Neurociências e Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Neurociências e Biologia Celular. Área de concentração em Neurociências Orientador: Prof. Dr. Cristovam Wanderley Picanço Diniz. Belém

RESUMO

O presente trabalho tem o intuito de Investigar possíveis correlações entre a morfologia da micróglia do hipocampo e giro denteado e o desempenho cognitivo individual em teste de memória espacial no Cebus apella. Devido ao bom desempenho do Cebus apella em tarefas cognitivas hipocampo-dependentes, utilizou-se testes selecionados da Bateria Cambridge de Testes Neuropsicológicos (CANTAB) utilizada previamente com sucesso tanto em primatas do Velho Mundo quanto em humanos. Empregou-se o teste motor de adaptação a tela para checar a adaptação dos indivíduos à tela sensível ao toque e o teste de aprendizado pareado (TAP) para avaliar aprendizado e memória espacial. Para o estudo da correlação entre o desempenho individual no TAP da bateria CANTAB e a morfologia da micróglia, foi necessário reconstruir e analisar parâmetros morfométricos selecionados a partir de micróglias reconstruídas dos terços médio e externo da camada molecular do giro denteado e do lacunosum molecular de CA1, empregando microscopia tridimensional. A definição dos limites da formação hipocampal foi feita empregando-se critérios arquitetônicos previamente definidos. Para imunomarcação seletiva de micróglias foi utilizado o anticorpo policlonal (anti-Iba1) dirigido contra a proteína adaptadora ligante de cálcio ionizado Iba-1. A partir de procedimentos de estatística multivariada identificou-se a ocorrência de agrupamentos microgliais baseados em parâmetros morfométricos que permitiram a distinção de pelo menos dois grandes grupos microgliais em todos os indivíduos. Os resultados comportamentais expressos em taxa de aprendizado e alguns dos parâmetros morfométricos da micróglia dos terços externo e médio da camada molecular do giro denteado revelaram significativas correlações, lineares e não lineares. Em contraste, nenhuma correlação dessa natureza foi encontrada no lacunosum molecular de CA1. Nós sugerimos baseado no presente e em trabalhos anteriores que a correlação entre desempenho cognitivo e a complexidade estrutural da glia não é um atributo exclusivo dos astrócitos e que a morfologia da micróglia da camada molecular do giro denteado pode estar associada ainda que de forma indireta ao desempenho individual em testes de memória espacial. Palavras Chave: microglia, morfometria tridimensional, aprendizado e memória espacial, hipocampo, giro denteado, Cebus apella.

ABSTRACT

This study aims to investigate possible correlations between the morphology of microglia in the hippocampus and dentate gyrus and cognitive performances in individual tests of learning and spatial memory in Cebus apella. Due to the good performance of Cebus apella in hippocampal-dependent cognitive tasks, we used selected tests of Cantab battery successfully used in Old World non-human primates and man. To adapt individuals to the touch screen and to assess spatial learning and memory, Motor Screening Test (MOT) and Paired Associated Learning Test (PAL) were used respectively. To detect possible correlations between microglial morphology and individual performances in the spatal learning and memory tasks, it was necessary to reconstruct and analyze microglial morphological details from the middle and outer one-thirds of the dentate gyrus molecular layer and from the lacunosum molecular layer of CA1, employing three dimensional microscopy. The definition of the boundaries and layers of CA1 and dentate gyrus employed architectural criteria previously defined. For selective microglia immunostaining, it was used polyclonal antibody against the adapter binding ionized calcium Iba - 1 protein (anti- Iba1). The occurrence of clusters after multivariate statistical analysis based on microglial morphometric parameters allowed the distinction of at least two major morphological groups of microglia in all individuals. The spatial learning rate and some of the morphometric parameters of microglia from dentate gyrus revealed significant linear and non-linear correlations. In contrast, CA1 did not show any correlation between microglial morphology and behavior. Based on the present and previous studies we suggest that the correlation between cognitive performances and complexity of morphological glial features is not an exclusive attribute of astrocytes and that microglial morphology of the molecular layer of dentate gyrus may be indirectly associated to the performance of individual tests of spatial memory. Key words: microglia, morphometry three-dimensional, spatial learning and memory, hippocampus, dentate gyrus, Cebus apella.

4.5 - Análise de Agrupamentos e Discriminante da Morfologia da Micróglia dos Terços Externo e Médio da Camada Molecular do Giro Denteado.................... 56 5 - DISCUSSÃO .................................................................................................... 70 5.1 - Memória Espacial no Cebus apella ........................................................... 71 5.2 - A Contribuição do Giro Denteado para Melhorar a Resolução da Memória Espacial (Separação de Padrões Ambíguos) .................................................... 72 5.3 - Plasticidade Sináptica e Micróglia na Camada Molecular do Giro Denteado: Implicações funcionais de morfologias especializadas ...................................... 76 5.4 - Limitações Técnicas .................................................................................. 79 6 - CONCLUSÕES ................................................................................................ 82 7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 83

1 - INTRODUÇÃO

A partir das observações de Brenda Milner e Scoville acerca das funções mnemônicas do paciente H.M. que sofreu profunda amnésia após ressecção cirúrgica bi-lateral da porção medial dos lobos temporais, foi possível reconhecer que a memória é uma capacidade cerebral separada de outras funções cognitivas como a percepção, a inteligência, a personalidade ou a motivação; que as memórias de curto e longo prazo são entidades funcionais distintas; e que o substrato anatômico para manutenção da memoria de longo prazo não é o lobo temporal medial (Clark e Squire, 2013). Desde então uma busca sistemática tem sido feita para encontrar as bases neurais (celulares e moleculares) da memória tentando reproduzir em primatas as mesmas lesões do paciente H.M. (Correll e Scoville, 1965). Dos ensaios iniciais em primatas tornou-se aparente que humanos e animais experimentais desenvolvem estratégias diferentes para resolver tarefas comportamentais em função da existência de múltiplos sistemas de memória. Por exemplo, macacos aprendem tarefas de discriminação visual complexas após muitas tentativas, o que tem sido referido como aprendizado de habituação e que parece incluir os núcleos da base (Teng et al. , 2000), enquanto em humanos essas tarefas são aprendidas memorizando diretamente o material utilizado para estimulação e essa estratégia de aprendizado parece envolver apenas os lobos temporais mediais. Assim, a escolha de testes comportamentais hipocampo-dependentes em espécies não humanas é uma tarefa que exige cuidado para que o teste selecionado para avaliação seja equivalente ao mesmo tipo de memória que é comprometida em humanos após o dano no lobo temporal medial (Clark e Squire, 2013). Um bom exemplo dessa escolha que mimetiza a amnesia do lobo temporal humana é a tarefa de reconhecimento de objetos não pareados, com retardo e de uma única tentativa (do inglês “Delayed Non-Matched to Sample” – DNMS) (Zola- Morgan, Squire e Mishkin, 1982). Nesse teste o animal é treinado para selecionar um objeto que não foi apresentado previamente durante a fase de exposição baseado no fato de que a familiaridade com um dos objetos é suficiente para guiar

Em recente trabalho de revisão Kesner (Kesner, 2013) sintetiza a contribuição funcional do giro denteado para a memória de reconhecimento contextual de objetos em cinco itens: 1) processamento integrativo convergente de aferências sensoriais múltiplas visando a representação espacial; 2) acentuação das diferenças entre estímulos espaciais ambíguos executando o padrão de separação espacial; 3) separação contextual; 4) informação contextual no reconhecimento de objetos e 5) integração temporal, memória remota e padrão de separação espacial dependente de neurogênese. Um sexto item é atribuído à região ventral do giro denteado que participa no processamento de informação de odores por mecanismo de separação de padrões (Kesner, 2013). Para executar a tarefa de integração e separação de padrões o giro denteado recebe aferências múltiplas que incluem as originárias dos córtices relacionados ao sistema vestibular, olfatório, visual, auditivo e somatossensorial, convergindo para o hipocampo através das áreas perirrinal e entorrinal lateral, assim como recebe projeções específicas para a representação espacial em células especializadas (Aggleton, 2012). Num caso e noutro é através das vias perfurantes lateral e medial que essas informações são carreadas, de modo que o componente medial é seletivo para o processamento de informação espacial e o componente lateral para os componentes não espaciais (Witter et al. , 1989; Hafting et al. , 2005; Hargreaves et al. , 2005). Em mamíferos, o hipocampo contém uma rede de neurônios que se comunicam através de um circuito trissináptico bem definido funcionalmente e classificado como do tipo “feed-forward”. A chegada de informações sensoriais converge para o córtex entorrinal que projeta, via circuito perfurante, para o giro denteado. Do giro denteado saem projeções, via fibras musgosas, para a região de CA3, de onde, através das fibras colaterais de Schaeffer, projetam-se ipsilateralmente e contralateralmente para a região de CA1 de onde saem fibras para o subículo e daí para fora do hipocampo; para revisão recente ver (Aggleton, 2012). A Figura 1 é um diagrama esquemático das principais interconexões dentro do lobo temporal medial do primata, ai contidos o subículo e o giro denteado.

A Figura 2 é um diagrama esquemático das conexões associadas ao sistema de memória do lobo temporal medial em mamíferos, proposto por Eichenbaum e colaboradores (Eichenbaum et al. , 2012) em revisão recente. As vias de projeção associadas à localização espacial (O quê?) são dirigidas ao córtex perirrinal e a área entorrinal lateral, enquanto que o reconhecimento da localização espacial do objeto (Onde?) é feito através das projeções dirigidas para a área parahipocampal e o córtex entorrinal medial. No hipocampo essas projeções são integradas permitindo que se possa dizer o que é e onde está o objeto de interesse. Figura 01. Diagrama esquemático das principais interconexões do lobo temporal medial do primata, incluindo o giro denteado (GD) e o subículo (SUB). Os alvos das projeções das camadas II e III do córtex entorrinal do hipocampo são também indicadas. A espessura das setas reflete a densidade das projeções (Aggleton, 2012).

1.1.1 - A Contribuição do Giro Denteado Numerosas evidências apontam que a integridade do giro denteado é fundamental para a memória de reconhecimento de objeto e o seu comprometimento diminui a capacidade dos indivíduos lesionados de distinguir objetos (padrões) similares em contextos espaciais diferentes (Gilbert, Kesner e Lee, 2001). No mesmo trabalho esses autores demonstram que a separação de padrões temporais é função de CA1. Na formação hipocampal dos mamíferos o giro denteado é caracterizado por enviar projeções unidirecionais poderosas para as células piramidais de CA através das fibras musgosas. Essas fibras formam um tipo único de sinapse rica em zinco que parece oferecer uma duplicata da informação que as células piramidais de CA3 já haviam recebido dos neurônios da camada II do córtex entorrinal e que projetam tanto para a camada molecular do giro denteado quanto para CA3. Essa duplicata parece preencher os requisitos necessários para lidar com o problema de ter que acentuar as diferenças entre os eventos antes de codifica-los, para poder distinguir o novo do velho, e essa tarefa é a previamente denominada separação de padrões (Leutgeb e Moser, 2007). Em estudos com camundongo knockout para receptores de NMDA no giro denteado, (incapazes portanto de originar LTP de forma seletiva nas sinapses da via perfurante com os dendritos das células granulares), observou-se que a performance dos camundongos no paradigma padrão de condicionamento para medo contextual não foi afetada em relação aos controles, quando o teste de “freezing” (imobilidade do camundongo) era aplicado em uma segunda câmara com diferenças visuais marcantes. Entretanto quando as duas câmaras de teste eram tornadas menos distintas uma da outra e o condicionamento aplicado, o camundongo knockout era incapaz de distingui-las sendo punido com o estímulo aversivo (choques) pela escolha incorreta, enquanto que os animais controle aprendiam a evitar a escolha incorreta (Mchugh et al. , 2007).

A capacidade de detectar quando um estímulo é novo ajuda o animal a focar sua atenção aos eventos no ambiente que potencialmente representam novas ameaças ou novas oportunidades e a questão que se impõe é a de qual seria a contribuição do giro denteado para essa tarefa? A memória de reconhecimento de objeto pode ser subdividida em duas categorias: o reconhecimento do objeto em si mesmo e o reconhecimento associativo. O reconhecimento do objeto está relacionado ao item sob observação identificando quando se trata de um objeto novo ou familiar enquanto que o reconhecimento associativo permite identificar se um grupo de elementos familiares foi ou não espacialmente reconfigurado (Aggleton, Brown e Albasser, 2012). Empregando genes de expressão rápida que não requerem síntese proteica prévia para serem ativados, foi possível correlacionar o padrão de sua ativação com as tarefas comportamentais de interesse (Barbosa et al. , 2013). Genes de expressão rápida podem ser classificados em dois grupos: fatores reguladores de transcrição que influenciam a função celular através da ativação de outros genes que eles regulam e os genes denominados de fatores efetores que controlam diretamente a função celular de maneira específica. Os genes C-Fos e zif268 são fatores reguladores de transcrição e desempenham papeis na plasticidade de longo prazo (Guzowski, 2002). A expressão transitória desses genes após estimulação de diferentes naturezas precede a de outros genes, daí a sua denominação “de expressão rápida” (Herrera e Robertson, 1996). As regiões que tiveram suas células ativas mapeadas através de genes de expressão rápida durante a estimulação, revelaram diferenças chave nos dois componentes da memória de reconhecimento de objeto indicando que a novidade do objeto é consistentemente associada à ativação em apenas duas regiões, o córtex perirrinal e a área visual associativa adjacente a área Temporal 2, enquanto que o reconhecimento associativo ativou C-Fos no hipocampo mas não no córtex perirrinal (Aggleton, Brown e Albasser, 2012). A falta da expressão de C-Fos no córtex perirrinal na tarefa de reconhecimento associativo foi interpretado como refletindo o fato de que o(s) item(s) sob observação permanece(m) familiar(es)

1.1.2 - A Contribuição de CA As células piramidais de CA1 são a origem das eferências primárias do circuito hipocampal e o alvo de dois inputs excitatórios principais: uma projeção menos densa da camada 3 do córtex entorrinal (EC3) que termina no terço externo dos dendritos das células piramidais e um mais denso que se origina de CA3 e que termina nos terços proximais dos dendritos apicais (Carr e Frank, 2012). A Figura 3 ilustra um diagrama esquemático de tais conexões. Figura 03. Aferências excitatórias para CA1. A informação acerca do ambiente atinge CA1 diretamente através da via têmporo-amônica com origem na camada 3 do córtex entorrinal (em vermelho). Essa via faz sinapse na região distal do dendrito apical das células piramidais de CA1 no stratum lacunosum molecular. Essa via também faz sinapse com CA2 e a partir das células piramidais de CA2 (laranja) conecta o dendrito apical das células piramidais de CA1 em seus terços proximal e médio, assim como os dendritos basais no stratum radiatum e oriens respectivamente. As projeções mais densas com ramos colaterais recorrentes (projeções excitatórias fazendo sinapse com os mesmos neurônios que as originaram) provem de CA3 (azul). Estas últimas estabelecem associações e se projetam densamente para o stratum radiatum de CA1 (Carr e Frank, 2012).

A codificação de informação espacial nova dentro do hipocampo parece dependente do desenvolvimento de novas representações durante a exploração do ambiente onde o animal está. De fato quando um animal se move pela primeira vez em um novo ambiente cerca de 50% dos neurônios piramidais de CA tornam-se ativos e cada neurônio ativo é ativado em uma área restrita do ambiente referida como “o campo local” (do inglês “place field”) (Karlsson e Frank, 2008). Esses campos receptores que detectam a localização espacial relativa respondendo de forma seletiva à posição do animal em áreas espaciais definidas, se desenvolvem a partir da exploração do novo ambiente e isso é consistente com a importância do hipocampo para a codificação da novidade espacial (Carr e Frank, 2012; Spiers et al. , 2013). Por outro lado evidências recentes revelam que os neurônios hipocampais podem codificar várias tarefas cognitivas relacionadas permitindo correlacionar a posição relativa do animal e a informação associada ao comportamento corrente (Allen et al. , 2012). A consolidação subsequente desses eventos se dá tanto durante o sono quanto em estado de alerta e esse evento parece estar relacionado ao ritmo elétrico hipocampal SWR (do inglês “sharp-wave ripple”) que aparentemente tem papeis diferentes nos estados de sono e de alerta. No primeiro caso ele parece codificar e consolidar a nova experiência espacial hipocampo-dependente e no segundo caso ele parece estar associado a mecanismos de recuperação da informação espacial estocada de forma contextualizada (“replay”) (Carr e Frank, 2012). Por conta do fato de que a integridade da projeção têmporo-amônica é essencial para a consolidação da memória espacial (Remondes e Schuman, 2004) e as sinapses dessa projeção que se destina aos dendritos distais das células piramidais na camada lacunosum molecular de CA1 exibem plasticidade sináptica associada ao aprendizado espacial (Remondes e Schuman, 2002; 2003), escolhemos reconstruir a micróglia dessa camada em busca de possíveis correlações de sua morfologia com o aprendizado espacial.

Independente do circuito ou subsistema envolvido, o denominador comum aparente nesses eventos neurais é a plasticidade sináptica que foi classificada em função de sua duração, como sendo de curto prazo que pode durar minutos a horas, ou de longo prazo permanecendo por dias, meses ou anos, também chamada de consolidação sináptica (Clopath, 2012). Além disso, tem sido descrito em sobreposição às plasticidades de curto e longo prazo, a plasticidade intrínseca, que repousa na regulação (do número, da distribuição ou da atividade) de canais iônicos e que se limita a regular o limiar de excitação neuronal facilitando ou dificultando o disparo de impulsos nervosos, adicionando-se aos conceitos pré-existentes, o de metaplasticidade (Sehgal et al. , 2013). Todos esses mecanismos estão disponíveis em todas as espécies estudadas até então, de modo que não conseguimos ainda identificar as razões que nos tornam cognitivamente melhores do que as outras espécies (Zhang e Barres, 2013). De forma surpreendente evidências recentes revelaram que células progenitoras dos astrócitos humanos quando transplantadas para camundongos, sobrevivem, migram e dão origem a astrócitos humanos em cérebros de camundongos que passam a aprender e lembrar de forma mais eficiente do que aqueles com seus próprios astrócitos e esse aprendizado melhor foi associado à amplificação do fenômeno de potenciação de longo prazo (Zhang e Barres, 2013). Esses achados parecem sugerir que os astrócitos da espécie humana podem ter contribuição decisiva no processo que torna os humanos cognitivamente melhores do que outras espécies (Han et al. , 2013). Coincidentemente os astrócitos humanos são maiores e estruturalmente mais complexos do que os de roedores (Oberheim et al. , 2006) com diâmetros de somas 2,6 vezes maiores, apresentando cerca de 10 vezes mais processos primários GFAP positivos, produzindo ondas de cálcio 4 vezes mais rápidas do que os dos roedores (Oberheim et al. , 2009). As questões que se levantam como consequência desses achados são: seriam as células da glia nas diferentes espécies com desempenhos cognitivos diferentes, distintas do ponto de vista morfofuncional? e se assim for será que sua maior complexidade estrutural e funcional contribui para melhores performances

cognitivas? Por outro lado será que esses achados de correlação entre o desempenho cognitivo e a complexidade morfofuncional da glia são um atributo exclusivo dos astrócitos ou eles também se aplicam à micróglia e aos oligodendrócitos? É relevante lembrar que entre roedores e primatas há uma variação grande de desempenhos cognitivos entre espécies da mesma classe ou entre espécies de classes diferentes e o estudo comparativo de células da glia nessas espécies pode ser útil para testar em maior escala o modelo da complexidade morfofuncional glial associado a melhor desempenho cognitivo. 1.3 - O Papel da Micróglia em Condições Homeostáticas As células microgliais já são reconhecidas como o 4o^ elemento da sinapse, atuando como sensores sinápticos durante o desenvolvimento e no cérebro adulto, sendo capazes de responder à mudanças na atividade neural e à liberação de neurotransmissores (Schafer, Lehrman e Stevens, 2012). Durante o desenvolvimento as células microgliais parecem influir em eventos associados à proliferação e diferenciação neuronais, vascularização, sinaptogênese e mielinização, assim como participam da remoção de neurônios em apoptose, de debrís celulares e de conexões sinápticas (Wake, H., Moorhouse, A. J. e Nabekura, J., 2011; Bitzer-Quintero e González-Burgos, 2012; Schafer, Lehrman e Stevens, 2013; Wake et al. , 2013). Coerente com essas descrições, já é amplamente reconhecido que as células microgliais modulam a neurogênese, controlam o turnover de neurotransmissores e dão suporte ao metabolismo neuronal participando da regulação da angiogênese e do fluxo sanguíneo cerebral (Tremblay et al. , 2011; Blank e Prinz, 2012). Mais recentemente as células microgliais têm sido implicadas na restauração de circuitos sinápticos lesionados, além de modular a faixa de operação sináptica através do assim chamado “synaptic scalling”. O monitoramento constante dos contatos sinápticos e parte de sua regulação