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Este documento discute as mutações no gene da chat que podem abolir ou reduzir a síntese de acetilcolina (ach) e sua relação com a expressão de receptores colinérgicos nicotínicos e muscarínicos. O texto aborda a importância da atividade do vacht na disponibilidade de colina para a chat remanescente e a relação estequiométrica dos transportadores de ach. Além disso, são discutidos os grupos de receptores colinérgicos, a interação entre eles e o peptídeo amilóide, e a importância dos receptores colinérgicos na capacidade de reconhecimento social e no aprendizado.
O que você vai aprender
Tipologia: Notas de aula
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Bráulio Marcone de Castro
Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Pós-Graduação em Farmacologia Bioquímica e Molecular
Junho de 2009
Bráulio Marcone de Castro
Orientador: Marco Antônio Máximo Prado Co-Orientadores: Vânia Ferreira Prado Grace Schenatto Pereira B ELO H ORIZONTE Junho de 2009
Tese de doutorado submetida ao Curso de Pós-graduação em Farmacologia Bioquímica e Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de doutor em Ciências.
A Deus.
Agradeço aos meus pais, irmãos e Cris pelo apoio, confiança e paciência.
Aos professores Marco Antônio e Vânia, pela oportunidade do aprendizado e pela orientação.
À professora Grace pela orientação, apoio, conselhos e pela amizade.
Ao professor Marcus Vinícius Gomez, pelo exemplo e pela oportunidade.
À Cristina Martins, companheira de trabalho e grande amiga.
Ao professor Márcio Flávio , pelo apoio nos experimentos e pelas sugestões.
Aos professores Rogélio (UFOP), Rafaela (Meritus), Geraldinho e José Maurício (ISA).
Aos alunos Greice, Bruno, Rodrigo e Patrícia pela ajuda, idéias e comprometimento.
A todos amigos e colegas dos laboratórios de Neurofarmacologia e Neurobiologia molecular.
Aos amigos Diogo, Danuza , Adriane e Rodrigo pelo apoio indispensável para a realização desse trabalho e pela amizade.
Aos amigos Janice, Melissa, Luciene, Geraldo, Bruno, Dani, Fabíola, Lucimar, Cristiane, Fabiana , Paulo, Monalise, Alessandra, Patrícia, Ivana, Iaci, Bento, Ernani, Ricardo, Magda, Juliana e Daniel pelo convívio e amizade.
À Nancy e Ana Cristina, pela amizade e exemplo.
À Diane, irmã de estrada.
Ao amigo Célio Júnior, pela ajuda.
Ao amigo Xavier, pelo apoio e trabalho.
Ao amigo Ricardo, pelos conselhos sempre sensatos.
Aos amigos Vitório e Leandro, pelo apoio nos tempos de Ouro Preto.
Aos amigos da PC02, pela alegria.
A liberação do neurotransmissor acetilcolina (ACh) depende de sua
estocagem em vesículas sinápticas, um passo controlado pela atividade do
transportador vesicular de ACh (VAChT). A neurotransmissão mediada por
ACh possui um importante papel em diferentes funções cognitivas, como
memória, aprendizado e atenção. Por outro lado, disfunções do sistema
colinérgico estão presentes em doenças que apresentam o comprometimento
de funções cognitivas, como Doença de Alzheimer e Doença de Huntington.
Interessados em determinar a importância do VAChT para funções
fisiológicas do sistema colinérgico, nosso grupo desenvolveu, através de
técnicas de recombinação homóloga, camundongos com diferentes níveis de
redução na expressão do VAChT. Ao gerarmos e caracterizarmos
camundongos nocaute para o VAChT, demonstramos a importância do
transportador para a viabilidade dos animais e para o desenvolvimento normal
do sistema neuromuscular. Entretanto, camundongos com a ausência do
VAChT, devido à mortalidade precoce, são inviáveis para a realização de
experimentos comportamentais. Passamos então a utilizar camundongos com
redução na expressão do transportador (Kock-dowm), capazes de atingir a
vida adulta e com desenvolvimento similar aos camundongos selvagens.
Camundongos Knock-down heterozigoto ( VAChT KDHET) e homozigoto
(VAChT KDHOM^ ) para o VAChT apresentam redução de 45% e 65% na
expressão do VAChT, respectivamente. Realizamos experimentos capazes
de avaliar diferentes formas de memória e aprendizado. Demonstramos que a
redução na expressão do VAChT, e consequentemente na liberação de ACh,
é capaz de prejudicar a memória social, sendo tal prejuízo revertido pela
elevação farmacológica do tônus colinérgico. A redução na expressão do
VAChT também trouxe prejuízos sobre o aprendizado não – associativo,
verifcado através da habituação ao campo aberto. Experimentos utilizando
cocaína, uma droga capaz de inibir a recaptação de dopamina, sugerem que
o déficit observado na habituação ao campo aberto pode envolver disfunções
no balanço entre o sistema colinérgico e dopaminérgico. O aprendizado de
tarefas procedurais, avaliado através do uso do cilindro giratório, mostrou-se
mais lento em camundongos com redução da expressão do VAChT. Dessa
forma, demonstramos que a liberação de ACh mediada pelo VAChT é
essencial para a sobrevivência, além disso a deficiência de liberação de
acetilcolina pelo transportador compromete o desenvolvimento normal da
junção neuromuscular em camundongos. Com o uso de camundongos Knock-
down, demonstramos que a atividade do VAChT é capaz de limitar a
capacidade de formação de distintas formas de memória, com consequências
sobre o aprendizado, de forma similar ao encontrado em determinadas
doenças humanas.
VAChT KD HOM^ Camundongo “knock-down” homozigoto para o VAChT
VMAT Transportador vesicular de monoaminas
Figura 1: Desenho esquemático da neurotransmissão colinérgica
Figura 2: Figura representativa da posição dos neurônios colinérgicos no sistema nervoso
central de ratos.
Figura 3: Esquema do loco gênico colinérgico e a estratégia utilizada na construção do vetor para a geração dos animais VachT Del
Figura 4: Geração de camundongo VAChT DEL/DEL
Figura 5: Quantificação da expressão de mRNA do VAChT por PCR em tempo real.
Figura 6: Expressão do VAChT em camundongos nocaute.
Figura 7: Imunofluorescência para o VAChT em JNM de camundongos VAChT nocaute.
Figura 8: Imunofluorescência para o CHT1 em JNM de camundongos VAChT Del.
Figura 9: Dosagem de Acetilcolina em camundongos VAChT nocaute.
Figura 10: Quantificação da expressão de mRNA da ChAT e CHT1 dos camundongos por PCR em tempo real.
Figura 11: Alterações na morfologia da junção neuromuscular de camundongos VAChT Del detectadas por imunofluorescência em diafragma.
Figura 12: Memória social de camungos selvagens e KD HET^ avaliada através de um protocolo de habituação-desabituação a um camundongo juvenil.
Figura 13: Capacidade olfatória de camundongos medida através do tempo necessário para encontrar um pedaço de alimento sob a maravalha.
Figura 14: Habituação olfatória a um estímulo não social
Figura 15: Preferência por estímulo social em camundongos selvagens e VAChT KDHET.
Figura 16: Memória social de camundongos WT e KDHET^.
Figura 17: Tratamento com Galantamina reverte o déficit de memória social apresentado por camundongos KDHET
Figura 18: Camundongos KD HOM^ apresentam déficit de memória social similar aos camundongos KDHET
Figura 19: Camundongos VAChT KD HOM^ apresentam redução na habituação intra-sessão ao campo abetro quando comparados aos camundongos selvagens.
Figura 20: Camundongos VAChT KD HOM^ não apresentam habituação ente sessões ao campo aberto.
Figura 21: Galantamina reduz a hiperatividade locomotora de camundongos com elevação crônica ou aguda do tônus dopaminérgico.
Figura 22: Atividade locomotora induzida por cocaína.
Figura 23: Condicionamento por lugar induzido por cocaína em camundongos selvagens e VAChT KD HOM.
Figura 24: Aprendizado motor no cilindro giratório (rotarod) de camundongos selvagens e VAChT KD HET
Figura 25: Camundongos VAChT KD HET^ aprendem mais lentamente a tarefa do cilindro giratório que camundongos selvagens.
Figura 26: Padrão de passadas de camundongos selvagens e VAChT KD
Figura 27 : Consolidação do aprendizado no rotarod entre as sessões
Tabela 1 : Iniciadores utilizados para genotipagem dos camundongos VAChT DEL
Tabela 2: Iniciadores desenhados para PCR em tempo real
1.1 A neurotransmissão química
Até o século XIX, havia um consenso de que a comunicação entre neurônios ocorreria através de uma conexão física direta. Entretanto, estudos realizados por Ramon y Cajal, utilizando a coloração por prata desenvolvida por Golgi, foram capazes de convencer a comunidade científica de que essas conexões, hoje conhecidas como sinapses, são próximas em vez de contínuas (revisto por Taylor e Brown, 1999). Posteriormente, Otto Loewi demonstrou a natureza química da comunicação entre neurônios. Em um experimento clássico, ele estimulou o nervo vago do coração perfundido de uma rã e permitiu que o líquido de perfusão entrasse em contato com o coração de outra rã. Como resultado, a atividade do coração da rã receptora foi diminuída através da ação da “substância do vago”, denominada por ele de parassimpatina. Posteriormente a parassimpatina passou a ser denominada de acetilcolina (ACh) (revisto por Brown DA, 2006). É aceito, portanto, que a transmissão química é a principal forma de comunicação entre neurônios. A neurotransmissão química clássica requer os seguintes passos: 1-Síntese do neurotransmissor no terminal pré-sináptico; 2- Estocagem do neurotransmissor em vesículas sinápticas; 3-Liberação regulada de neurotransmissor na fenda sináptica; 4-A presença de receptores específicos para o neurotransmissor no terminal pós-sináptico; 5-Uma forma de terminar a ação do neurotransmissor (revisto por Taylor e Brown, 1999). Os eventos pré e pós-sinápticos são altamente regulados e sujeitos às modificações depedentes do uso, que são a base da plasticidade sináptica. Um dos grandes desafios da neurociência é explicar como diferentes padrões de atividade de sistemas de neurotransmissores coordenam comportamentos complexos, e como alterações nesses sistemas participam de processos patológicos.
1.2. A neurotransmissão colinérgica
A ACh foi o primeiro neurotransmissor identificado, sendo proposta como mediadora da função celular por Hunt, em 1907. Em 1914, Dale demonstrou que sua ação era capaz de mimetizar a estimulação de nervos parassimpáticos. Loewi, em 1921, forneceu evidências claras de que há liberação de ACh após estimulação nervosa (revisado por Brown DA, 2006) Hoje, sabe se que a neurotransmissão colinérgica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. Seu bloqueio agudo é geralmente letal, enquanto sua perda gradual, como observada na Doença de Alzheimer, é associada com a deterioração progressiva de funções neurais (revisto por Hoffman e Taylor, 2006). A ACh participa do controle central e periférico do movimento, funcionamento do sistema nervoso autônomo, regulação do sono e de múltiplos processos cognitivos como memória, atenção e aprendizado ( revisto por Sarter M e cols. 2005; Gold PE, 2003). A ACh é sintetizada pela enzima colina acetiltransferase (ChAT), a partir dos substratos colina e acetato, e posteriormente transportada para o interior de vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). Após ser liberada no terminal sináptico, a ACh interage com seus receptores e é hidrolisada em colina e acetato. A colina é então recaptatada para o neurônio pré-sináptico, principalmente pelo transportador de colina de alta afinidade (CHT1), e utilizada para a síntese de novas moléculas de ACh (Ribeiro et al., 2006; Prado et al.,2002) (Figura1).
que apresenta sua expressão aumentada em neurônios colinérgicos (Beigneux e cols., 2004, Tomaszewicz e cols., 2003). O suprimento de colina é provido principalmete da dieta, devido à incapacidade de neurônios em sintetizar colina (Fernstrom e cols., 1981; Zeisel e cols., 1981). A ChAT é encontrada predominantemente como uma proteína solúvel no citoplasma, com uma pequena parcela da população total da enzima associada a membranas ou ao núcleo (Gill SK e cols., 2003). A atividade da ChAT é influenciada por sua distribuição, interação com proteínas celulares e estado de fosforilação (revisto por Dobransky e Ryllet, 2005). Ferramentas bioquímicas e farmacológicas indicam que a ChAT encontra-se em excesso cinético em relação aos seus substratos, sugerindo que sua ação não seja a etapa limitante da síntese de ACh (Blusztajn e Wurtman, 1983). Entretanto, uma redução da atividade da ChAT, encontrada em diferentes situações patológicas, pode afetar a disponibilidade de ACh (Oda Y, 1999). Na Doença de Alzheimer avançada, observa-se uma redução na concentração e atividade da ChAT no córtex cerebral e hipocampo (revisto por Mesulam, 2004). Entretanto, ainda é controverso se há redução na atividade da ChAT nos estágios leve e moderado da DA (Contestabile AE, 2008) Na Doença de Huntington, a redução na síntese de ACh parece ser parcialmente responsável pelos movimentos involuntários observados em pacientes afetados pela doença. Embora a quantidade de neurônios colinérgicos no estriado esteja preservada, há uma redução significativa da atividade da ChAT (Cichetti F e cols., 2000). Mutações no gene da ChAT capazes de abolir ou reduzir a síntese de ACh foram encontradas em uma forma de miastenia frequentemente fatal, denominada Síndrome miastênica congênita com episódios de apnéia (Ohno e cols., 2001; Kraner e cols., 2003). A utilização de camudongos nocaute tem se mostrado uma ferramenta poderosa para o estudo da função e regulação de proteínas envolvidas com a neurotransmissão colinérgica. Animais nocaute para o gene da ChAT foram gerados. Enquanto camundongos nocaute da ChAT são natimortos, camundongos haploinsuficientes para a ChAT (com redução de aproximadamente 50% na atividade enzimática) surpreendentemente não apresentaram nenhuma alteração fisiológica aparente. A caracterização neuroquímica dos animais heterozigotos
revelou um aumento na expressão do CHT1 de cerca de 50%. Sugere-se que o aumento na atividade do CHT1 tenha sido capaz de aumentar a disponibilidade de colina para a ChAT remanescente e dessa forma manter os níveis de ACh normais (Brandon e cols., 2004).
1.2.2 Captação de colina pelo terminal pré-sináptico
A incapacidade de neurônios colinérgicos em realizar a síntese de novo de colina torna a captação da colina para o interior neuronal essencial para manter a síntese de ACh (Zeisel, 1981). Existem dois sistemas de transporte de colina bem caracterizados e distintos entre si. A colina é transportada por um sistema de baixa afinidade ( Km de 100 μM), independente de íons sódio e inibido seletivamente por altas concentrações de hemicolínio-3 (HC-3), com Ki de aproximadamente 50 μM. Esse sistema encontra-se distribuído em vários tipos celulares e parece estar envolvido com a síntese de fosfatidilcolina. O outro é um sistema de transporte de alta afinidade por colina, com Km de 1a 5 μM, depende de sódio e cloreto, e inibido por baixas concentrações de HC-3 ( Ki de 10-100 nM) (Okuda T e cols_._ , 2000; Ribeiro e cols., 2006). O sistema de alta afinidade está presente principalmente em neurônios colinérgicos e é responsável por suprir colina para a síntese de ACh. A captação de colina pelo sistema de transporte de alta afinidade é assumida como etapa limitante da síntese de ACh (Blakely e cols., 2004; Ribeiro FM e cols., 2006) O transporte de colina de alta afinidade foi descrito nos anos de 1960. Entretanto, os genes para o transportador de colina de alta afinidade (CHT1) em ratos e C. elegans foram apenas recentemente clonados (Okuda T e cols., 2000). O CHT1 de humanos, que codifica uma proteína de 580 aminoácidos, apresenta alta homologia com os genes de rato (98%) e camundongo (93%) (Apparsundaram S e cols., 2000; Guermonprez e cols., 2002; Wang e cols., 2001). Modelos de estrutura secundária para o CHT1 predizem uma proteína transmembrana (contendo treze domínios transmembrânicos), com a porção amino-terminal com orientação extracelular e a região carboxi-terminal intracelular (Apparsundaram S e cols., 2000). Confirmou-se a orientação extracelular da região amino-terminal através do uso de epitopos “FLAG” fundidos com a região amino-terminal do ChT1, que posteriormente
selvagens. O mecanismo utilizado para manter a capacidade de transporte de colina normal, mesmo com redução da expressão do transportador, envolve mecanismos pós-traducionais. Observou-se um aumento na proporção de CHT1 na membrana em relação a compartimentos intacelulares. O aumento do CHT1 localizado na membrana foi capaz de compensar a redução da expressão da proteína e manter o transporte de colina em níveis normais (Ferguson SM e cols., 2003; Ferguson SM e cols., 2004). Mudanças na expressão e atividade do CHT1 são relacionadas a doenças com comprometimento do sistema colinérgico. A avaliação post mortem do CHT em pacientes com Doença de Alzheimer revelou um aumento na presença do transportador na membrana plasmática, de forma específica para regiões corticais que sofrem degeneração (Slotkin TA e cols., 1994). A exposição aguda de células HEK expressando o CHT1 ao agente gerador de peroxinitrito, SIN-1, foi capaz de reduzir o transporte de colina de maneira tempo e dose – dependente, por aumentar a internalização do transportador para compartimentos intra-celulares (Pinthong M. e cols., 2008). É um resultado que mostra uma relação entre espécies nitrosativas, que parecem estar envolvidas com a patogênese da Doença de Alzheimer (revisto por Bossy- Wetzel E e cols., 2004), redução da capacidade de captação de colina e uma provável consequência negativa na síntese de ACh.
1.2.3 Transporte de Acetilcolina para vesículas sinápticas
A ACh sintetizada no citoplasma é transportada para o interior de vesículas sinápticas. Como a relação entre a concentração de ACh vesicular e citoplasmática é de 100:1, é necessário um mecanismo de transporte ativo para que a ACh seja transportada para o interior da vesícula. O VAChT é capaz de realizar esse transporte utilizando um gradiente de prótons gerado por uma ATPase do tipo V. O transporte realizado pelo VAChT possui uma relação estequiométrica de dois prótons por molécula de ACh (Parsons e cols., 2003). O VAChT é uma glicoproteína de 500-600 aminoácidos. A análise de hidrofobicidade da seqüência primária dos seus aminoácidos prediz uma macromolécula com 12 domínios transmembrana, flanqueados por domínios amino e carboxi-terminal citoplasmáticos (Alfonso e cols., 1993; Varoqui e cols., 1994).
Em 1993, Alfonso e colaboradores clonaram e sequenciaram o cDNA correspondente ao gene unc-17 de C. elegans. Foi proposto que o produto deste gene poderia ser um transportador vesicular, baseado em sua grande homologia com os transportadores vesiculares de monoaminas (VMATs). Além disso, a expressão de mutantes do gene unc-17 em C. elegans levou a fenótipos que indicam o comprometimento da função colinérgica. Em 1994, Varoqui e cols. identificaram o homólogo de unc-17 expresso no órgão elétrico de Torpedo. Ainda em 1994, Erickson e Colaboradores e Roghani e colaboradores identificaram o homólogo das proteínas de C. elegans e Torpedo em rato. Erickson e cols. (1994) e Liu e Edwards (1997) demonstraram que essa proteína consiste em um transportador vesicular de acetilcolina funcional, através da reconstituição do transporte in vitro. O gene do VAChT apresenta organização gênica particular, estando localizado no interior do primeiro íntron do gene que codifica a ChAT (Bejanin e cols. 1994). Acredita-se que os mRNAs de VAChT e ChAT sejam transcritos a partir de um mesmo promotor e sofram processamentos alternativos, envolvendo excisões de seqüências de aproximadamente 1 a 7 Kilobases (Bejanin e cols. 1994; Cervini e cols. 1995). Essa disposição sugere que a regulação da expressão destes dois genes possa ser semelhante (Cervini e cols. 1995). Após o enchimento das vesículas sinápticas, essas são direcionadas para uma região subjacente à membrana sináptica denominada zona ativa. As vesículas são ancoradas à membrana sináptica e se tornam responsivas às mudanças na concentração intracelular de cálcio. Quando um potencial de ação atinge o terminal nervoso, canais de cálcio ativados por voltagem são abertos. As ondas de cálcio resultantes induzem a fusão de vesículas sinápticas com a membrana e a consequente liberação de ACh (revisto por Sudhof, 2004). A resposta da célula pós-sináptica a um único evento exocítico (uma vesícula liberada) é denominada de tamanho quantal. Um acúmulo de evidências geradas a partir de estudos realizados nos últimos dez anos suporta a hipótese de que a expressão de transportadores vesiculares pode regular a quantidade de neurotransmissor contida em vesículas e consequentemente o tamanho quantal (Krantz e cols., 2008). O aumento na expressão do VAChT na junção neuromuscular imatura de Xenopus é capaz de duplicar o tamanho quantal. Já a expressão do
