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Este trabalho visa diminuir o tempo de destilação do método kjeldahl para análise de proteína em alimentos, garantindo a confiabilidade dos dados gerados. Através de testes estatísticos, o documento compara os resultados de concentração de nitrogênio e proteína bruta obtidos em diferentes tempos de destilação.
O que você vai aprender
Tipologia: Slides
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QMC5515 – Estágio Supervisionado RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO DESENVOLVIDO NA SEÇÃO LABORATÓRIAL AVANÇADA DE SANTA CATARINA DO LABORATÓRIO FEDERAL DE DEFESA AGROPECUÁRIA GREGORI BARP ORIENTADOR: Dr. LUCIANO VITALI SUPERVISOR: Dr. HEITOR DAGUER FLORIANÓPOLIS – SC NOVEMBRO/
Gregori Barp AVALIAR A POSSIBILIDADE DE REDUÇÃO DO TEMPO DA ETAPA DE DESTILAÇÃO DO MÉTODO KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA BRUTA EM ALIMENTOS E RAÇÕES FLORIANÓPOLIS – SC NOVEMBRO/ Projeto de Estágio Supervisionado (QMC-5515) apresentado ao Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina desenvolvido na Seção Laboratorial Avançada – SLAV – São José pertencente ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA, como requisito para a obtenção do Título de Bacharel em Química Tecnológica. Orientador: Prof. Dr. Luciano Vitali Supervisor: Dr. Heitor Daguer.
iv RESUMO A determinação de proteína utilizando a técnica volumétrica desenvolvida por Kjeldahl é uma das mais usadas no mundo. É um método confiável para análise de nitrogênio que facilita os laboratórios acreditados pela norma ISO 17025 quanto à garantia da qualidade dos dados gerados. Milhares de medidas de proteínas são geradas diariamente para fiscalização e monitoramento nos laboratórios para avaliação da conformidade técnica dos alimentos, garantindo seu valor nutricional e evitando fraudes. A diminuição do tempo de análise é necessária para o aumento da frequência analítica de um laboratório de rotina. Por conta disso, este trabalho visou a diminuição do tempo de destilação do método Kjeldahl para análise de proteína em alimentos, garantindo a confiabilidade dos dados gerados. Essa análise faz parte do escopo de métodos da Seção Laboratorial Avançada de Santa Catarina, pertencente ao Laboratório Federal de Defesa Agropecuária, um dos laboratórios oficiais do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA. A realização deste trabalho durante o estágio possibilitou uma experiência única de aprendizado profissional na formação para conclusão do curso de Bacharelado em Química Tecnológica. Palavras-chave: análise de alimentos, método Kjeldahl, volumetria, nitrogênio, proteína.
v Lista de abreviaturas e siglas ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas CGAL – Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários DTEC – Departamento de Serviços Técnicos ISO- Organização Internacional para Padronização (tradução do inglês) LFDAs – Laboratórios Federais de Defesa Agropecuária MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento NBR – Norma Brasileira SDA – Secretaria de Defesa Agropecuária
vii Lista de figuras Figura 1 : Digestor......................................................................................... 19 Figura 2 : Destilador...................................................................................... 20 Figura 3 : Antes da titulação......................................................................... 21 Figura 4 : Após titulação, pH próximo de 3,8................................................ 21
RESUMO iv Lista de abreviaturas e siglas v Lista de tabelas vi Lista de figuras vii
**1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 10
4.1. Objetivo geral................................................................................... 14 4.2. Objetivos Específicos ..................................................................... 14
5. METODOLOGIA................................................................................... 15 5.1. Reagentes......................................................................................... 15 5.1.1. Reagentes...................................................................................... 15 5.2. Equipamentos................................................................................... 15 5.3. Preparo das soluções na determinação de proteína bruta por acidimetria................................................................................................
5.4. Teste inicial usando amostra padrão de sulfato de amônio........ 16 5.5. Determinação de proteína bruta em alimentos e rações por acidimetria................................................................................................
5.5.1. Digestão micro Kjeldahl................................................................ 18 5.5.1.1. Teste de performance do procedimento de digestão............. 19 5.5.2. Destilação e Titulação................................................................... 20 6.DISCUSSÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NO ESTÁGIO............... 22
Ao longo dos anos tem-se visto uma corrida na obtenção de maior grau de satisfação referente à qualidade dos alimentos, a qual requer garantias de melhor controle de processos industriais. Nesse cenário, é de fundamental importância a atuação do químico tecnológico em paralelo, assegurando as boas práticas de fabricação dos processos industriais. A confiabilidade dos produtos é atestada pelos laboratórios acreditados pelo INMETRO na normativa ABNT NBR ISO/IEC 17025 que são os requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração. O presente trabalho foi realizado em um dos laboratórios acreditados pelo INMETRO para execução dessa norma, situado na Seção Laboratorial Avançada localizada em São José – SLAV – SC, pertencente ao Laboratório Federal de Defesa Agropecuária – (LFDA/RS) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA. De todos os setores do laboratório e métodos analíticos acompanhados durante o estágio, no presente relatório o foco será a determinação de proteína bruta em alimentos e rações pelo método Kjeldahl. Isso decorreu da demanda do laboratório por avaliar a possibilidade de uma melhora desse método diminuindo o tempo de análise em uma de suas etapas, sem que ocorressem perdas na confiabilidade dos dados gerados. A resultante seria o aumento da capacidade desse tipo de análise pelo laboratório, o que pode ser bem interessante, uma vez que no controle de qualidade muitas amostras precisam ser analisadas diariamente.
Os LFDAs são unidades laboratoriais descentralizadas do MAPA, sendo coordenados pela CGAL, DTEC e subordinados à SDA/MAPA. OS LFDAs têm como política de qualidade a busca pela conformidade dos ensaios realizados em relação aos requisitos da ABNT NBR ISO/IEC 17025, trabalhando em consonância com a missão do MAPA (promover o desenvolvimento sustentável da agropecuária e a segurança e competitividade de seus produtos), sua visão (ser referência mundial em seus serviços laboratoriais agropecuários) e objetivo (ser reconhecido como referência e excelência na prestação de serviços laboratoriais para defesa agropecuária). Os LFDAs possuem como competência realizar analises oficiais, fazer o monitoramento de fiscalizações e auditorias em laboratórios da rede nacional e promover o suporte técnico-científico e laboratorial às atividades de fiscalização, programas e controles oficiais. LFDAs e SLAVs estão localizados em todas as regiões do Brasil: região Norte, LFDA Belém – PA; região Nordeste, LFDA Recife – PE; região Centro- Oeste, LFDA Goiânia – GO com SLAV em Campo Grande – MS; região Sudeste, LFDA Pedro Leopoldo – MG com SLAV em Uberlândia e Belo Horizonte, LFDA Campinas – SP com SLAV em Jundiaí - SP; região Sul, LFDA Porto Alegre – RS com SLAV em São José – SC, sendo esse último local onde foram realizados os trabalhos do estágio. A SLAV de São José – SC recebe amostras tais como: pescados para análise de biotoxinas, sódio e potássio, produtos lácteos, produtos cárneos como frango e embutidos para determinação de proteínas, provenientes de todas as regiões do Brasil. O laboratório está equipado com instrumentos de análises de alta tecnologia, assegurando confiabilidade dos dados. Além disso, o laboratório emprega métodos de referência em suas análises.
A determinação de proteína em alimentos é dividida em etapas, como é mostrado no esquema 1. Esquema 1 : Divisão das etapas do método de determinação de proteína. O método de Kjeldahl baseia-se na digestão das proteínas e outros compostos nitrogenados com ácido sulfúrico concentrado, fraco agente oxidante da matéria orgânica, oxidando o carbono e hidrogênio da proteína formando dióxido de carbono (CO 2 ) e água (H 2 O). O nitrogênio é reduzido, formando o sulfato de amônio ((NH 4 ) 2 SO 4 ), conforme Equação 1. Em seguida o sulfato de amônio é destilado na presença da solução concentrada de hidróxido de sódio, objetivando transformar o íon amônio (NH 4 +) presente no ((NH 4 ) 2 SO 4 ) em amônia gasosa (NH 3 ↑), que reage com o ácido bórico (H 3 BO 3 ), formando o borato de amônio (NH 4 H 2 BO 3 ), Equação 2 e 3 , e finalmente titulada com ácido clorídrico de concentração conhecida ( Equação 4 ), onde quanto maior o volume gasto do titulante, por titulação de retorno, maior a quantidade de nitrogênio presente na amostra.7,8, Proteína(S) + H 2 SO4(l) CO 2 ↑ + (NH 4 ) 2 SO4(aq) + H 2 O(l) Equação 1 Δ (NH 4 ) 2 SO4(aq) 2NaOH(aq) Na 2 SO4(aq) + 2 NH 3 ↑ + 2 H 2 O(l) Equação 2 Δ NH 3 ↑ + H 3 BO3(aq) NH 4 H 2 BO3(aq) Equação 3 NH 4 H 2 BO3(aq) + HCl(aq) NH 4 Cl(aq) + H 3 BO3(aq) Equação 4 A etapa digestão das amostras é essencial na degradação da matéria orgânica presente na mesma, e por mais longa que seja esta etapa, se faz necessário esse tempo mais longo. A destilação é a segunda etapa mais longa do método, com tempo de análise de seis minutos por amostra, seguida de titulação que geralmente é feita em curto tempo. Assim, o estudo realizado avaliou a variação do tempo de destilação, visando à sua redução, sem comprometer a garantia da qualidade dos dados obtidos, fator importante de ser melhorado em um método para aumentar sua frequência analítica. Digestão Destilação^ Titulação
4.1. Objetivo geral Avaliar a possibilidade de redução do tempo da etapa de destilação do método Kjeldahl para determinação de proteína bruta em alimentos e rações. 4.2. Objetivos Específicos
5.3. Preparo das soluções na determinação de proteína bruta por acidimetria
de titulação com solução de HCl 0,1 molL-^1. O percentual de nitrogênio recuperado foi determinado conforme Equação 5 e Equação 7 , comparando os valores obtidos para cada tempo selecionado. As medidas realizadas em cada tempo foram obtidas em triplicata.
Equação 5 Onde: % Nr = percentual de nitrogênio recolhido; V = volume gasto de titulante (mL); B = volume do branco (mL); CT = concentração teórica da solução titulante (molL-^1 ); FC = fator de correção da solução titulante; m = massa de amostra (g). O FC foi calculado conforme Equação 6.
Equação 6 Onde: m = massa de carbonato de sódio (g); V = volume gasto de titulante (mL); CT = concentração teórica da solução titulante (molL-^1 )
Onde: %Nrec = percentual de nitrogênio recuperado; % Nr = percentual de nitrogênio recolhido; %N = percentual de nitrogênio de acordo com o grau de pureza do sulfato de amônio, conforme Tabela 3. O ponto final da titulação ou ponto de viragem foi verificado mediante utilização de pHmetro. Como o destilado é recolhido em ácido bórico ( Equação 3 ), após titulação do amônio, a solução de ácido bórico é recuperada ( Equação 4 ), mostrando uma titulação de retorno. O ponto final da titulação deve ter o mesmo pH da solução original de ácido bórico 4%, pH em torno de 3,8.
Figura 1: Digestor Tabela 4 : Programa de aquecimento para digestão de amostras na determinação de proteína bruta (método micro-Kjeldahl) Etapa Temperatura (°C) Tempo (min) 1 50 60 2 100 60 3 150 30 4 200 30 5 250 30 6 300 30 7 380 a 420 Até digestão completa Foi utilizada amostra de ração certificada com concentração conhecida de nitrogênio para avaliar a etapa de digestão para validação do método na determinação de proteína. 5. 5 .1.1. Teste de performance do procedimento de digestão O teste foi realizado com material de referência para calcular a massa de nitrogênio recuperado, substituindo a amostra certificada de ração por 0,08 g de L-triptofano, 0,34 g de sacarose e ácido sulfúrico, que foram adicionados ao tudo digestor e mantidos em repouso antes da digestão. Ao final, foi calculada a fração de massa de nitrogênio recuperado após o procedimento de destilação seguido de titulação, calculado através da Equação 5 e Equação 8.
Onde: %Nrec = percentual de nitrogênio recuperado; % Nr = percentual de nitrogênio recolhido; %N = percentual de nitrogênio de acordo com o grau de pureza do L-triptofano. 5. 5. 2. Destilação e Titulação Terminada a etapa de digestão, tanto a amostra certificada de ração quanto o teste de performance do procedimento de digestão (itens 5.5.1 e 5.5.1.1 ) foram submetidos à etapa de destilação, ( Figura 2 ), variando o tempo de 2, 4 e 6 minutos, juntamente com o teste de performance do procedimento de destilação (item 5.4 ), seguido de titulação, como é visto nas Figuras 1 e 2 , com solução de HCl 0,1 molL-^1. O percentual de nitrogênio recuperado foi determinado conforme Equação 5 e Equação 8 comparando os valores obtidos de nitrogênio para cada tempo selecionado, onde o cálculo de proteína bruta foi realizado conforme Equação 9. Figura 2: Destilador
