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Os taninos e saponinas já foram identificados como princípios ativos de vários extratos vegetais pesquisados pela farmacognosia mundial. Uma.
Tipologia: Notas de estudo
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Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
Fernanda Vieira Castejon Orientador: Prof. Dr. José Henrique Stringhini
ii
Seminário apresentado junto à disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós- graduação em Ciência Animal da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás
Nível: Mestrado
Área de concentração: Produção animal
Linha de pesquisa: Metabolismo nutricional, alimentação e forragicultura na produção animal
Orientador: Prof. Dr. José Henrique Stringhini – EVZ/UFG Comitê de orientação: Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição – FF/UFG Prof. Dra. Elisabeth Gonzales – EVZ/UFG
Taninos e saponinas são substâncias conhecidas por algumas de suas características marcantes, como a adstringência e fator antinutricional dos taninos e a função emulsificante das saponinas. Porém, as características de conhecimento comum são poucas frente a diversidade de mecanismos de ação e possíveis usos ainda desconhecidos na indústria em geral. Há várias linhas de pesquisas sobre compostos tânicos e saponinas, tanto na fisiologia vegetal, quanto na atividade biológica/farmacológica desses compostos. São estudos feitos sobre metodologias de identificação e determinação em plantas; avaliação da variação da concentração na planta, entre plantas da mesma espécie e relacionadas ao clima; relação com insetos herbívoros; usos na alimentação humana; alimentação animal; usos em processos industriais, etc. Na alimentação humana e animal, a busca crescente por alimentos nutracêuticos e aditivos fitogênicos que substituam produtos industriais atualmente utilizados em maior escala tem se constituído em grande motivação de pesquisas. Os taninos e saponinas já foram identificados como princípios ativos de vários extratos vegetais pesquisados pela farmacognosia mundial. Uma vertente de pesquisas dentro da farmacognosia que tem sido utilizada com o objetivo de facilitar o processo de descoberta de novas substâncias é a etnofarmacologia. A etnofarmacologia é o ramo da Etnobiologia/Etnobotânica que associa informações obtidas de comunidades que fazem o uso da flora medicinal com estudos químicos/farmacológicos realizados em laboratórios especializados. Não é o interesse principal isolar todos os compostos ou um composto em particular, e sim identificar os compostos responsáveis pela ação farmacológica (ELISABETSHY, 2001). Assim, tem se interesse em conhecer os principais princípios ativos das plantas com potencial de uso tanto na medicina humana, quanto na animal. Os compostos tânicos são responsáveis pela adstringência de muitos frutos e outros produtos vegetais. A adstringência ocorre devido à precipitação de glicoproteínas salivares, levando à perda do poder lubrificante (BRUNETON, 1991). São compostos fenólicos, e portanto são altamente reativos quimicamente que formam pontes de hidrogênio, intra e
intermoleculares (MONTEIRO et al. 2005). Estes compostos são facilmente oxidáveis, tanto por enzimas vegetais específicas quanto por influência de metais, como cloreto férrico, o que ocasiona o escurecimento de suas soluções (MELLO & SANTOS, 2001). Possuem a habilidade de formar complexos insolúveis em água com alcalóides, gelatina e outras proteínas, características nas quais são baseados os principais testes de detecção. A complexação entre taninos e proteínas é a base para suas propriedades como fator controlador de insetos, fungos e bactérias, assim como para seus principais usos industriais (Ex: manufatura do couro). São compostos do metabolismo secundário vegetal ou metabolismo especial e são importantes nas interações entre a planta e seu ecossistema. As saponinas em solução aquosa formam espuma persistente e abundante. Essas atividades provem do fato de apresentarem em sua estrutura uma parte lipofílica denominada aglicona ou sapogenina e uma parte hidrofílica constituída por um ou mais açúcares (SCHENKEL et al., 2001). A espuma formada é estável à ação de ácidos minerais diluídos, diferenciando-se dos sabões comuns. Alguns dos compostos saponósidos desorganizam a membrana dos glóbulos vermelhos do sangue, o que pode levar à hemólise. Outra característica encontrada é a capacidade de complexar com esteróides, que é utilizada para explicar a ação antifúngica e hipocolesterolmiante (CUNHA & ROQUE, 2005). Em animais que ingerem rações com saponinas como aditivo, há redução da liberação de amônia das fezes (reduzindo o odor) e aumento da consistência das mesmas. Tais características são interessantes para a criação de cães e gatos, e em criações comerciais de suínos e aves. Pode resultar em melhoria da qualidade do ar, qualidade de cama, facilidade de limpeza de instalações, e outros benefícios que levam à melhoria do desempenho produtivo. Sendo, portanto, moléculas promissoras como aditivos em rações animais. Com essa revisão, objetivou-se estudar esses dois importantes princípios ativos encontrados em plantas: taninos e saponinas.
género Rhus (sumagre), das vagens de Caesalpinia spinosa (tara) e das galhas de várias espécies de carvalho.
FIGURA 2 - Exemplo de ligação depsídica formada entre o grupo fenólico superior e o grupo inferior de uma unidade de ácido gálico FONTE: HARVEY (2001).
Os elagitaninos são moléculas que possuem um ou dois resíduos de hez-hidroxidifenoila de configuração R ou S, os quais são obtidos pelo acoplamento oxidativo C-C entre dois resíduos de ácido gálico adjacentes. Após a hidrólise ácida das ligações ésteres, ocorre a liberação do ácido difênico, que se rearranja espontaneamente para o ácido elágico. Os elagitaninos isolados até o presente são monômeros, dímeros, trímeros e tetrâmeros (MELLO & SANTOS, 2001). Na alimentação humana, os elagitaninos são encontrados apenas em grupos restritos de alimentos tais como framboesa, morango, castanha, avelã, caju e pistachio. Estes taninos foram encontrados, também, em partes não comestíveis de plantas, como as folhas. É possível encontrar taninos elágicos em vinhos envelhecidos em barricas de madeira de carvalho, como resultado da sua difusão da madeira durante o estágio de produção em barricas (CLIFFORD et al., 2000). Os taninos condensados ou proantocianidinas estão distribuídos por diversas famílias do reino vegetal, em geral, em plantas lenhosas. São polímeros de flavan-3-ol e/ou flavan-3,4-diol (figura 3), produtos do metabolismo do fenilpropanol (HEIL et al., 2002). As proantocianidinas são assim denominadas pelo fato de apresentarem pigmentos avermelhados da
classe das antocianidinas, como cianidina e delfinidina. As moléculas têm grande variação estrutural, resultante de padrões de substituições entre unidades flavânicas, diversidade de posições das ligações e a estereoquímica (MELLO & SANTOS, 2001).
FIGURA 3 - Estrutura química de taninos condensados FONTE: LEKHA & LONSANE (1997).
A análise de proantocianidinas nos alimentos torna-se difícil pela, já mencionada, variedade de estruturas existentes e à escassez de técnicas analíticas que permitam a sua separação, identificação e quantificação. Apesar de os polímeros constituírem a maioria dos polifenóis das plantas, a análise química se limita, normalmente, a monômeros, dímeros e alguns trímeros (CHEYNIER, 2005). Os taninos condensados são mais comuns na dieta humana do que os taninos hidrolisáveis. Estão presentes em concentrações relativamente importantes em alguns frutos (uvas, maçãs, etc.) e suas bebidas derivadas, no cacau e chocolate (SANTOS-BUELGA & SCALBERT, 2000).
2.1.2 Atividade biológica
Diversos estudos sobre atividade dos taninos evidenciaram importante ação antibacteriana, ação sobre protozoários, na reparação de tecidos, regulação enzimática e protéica, entre outros. Estes efeitos dependem da dose, tipo de tanino ingerido e período de ingestão.
Já as propriedades antimicrobianas dos taninos, são bem conhecidas e documentadas. Porém, os resultados ainda são controversos, e em apenas alguns trabalhos se faz a diferenciação do tipo de tanino presente no extrato, o que poderia esclarecer as dúvidas quanto aos efeitos observados. SCALBERT (1991) afirma que taninos condensados e hidrolisáveis não apresentam diferenças significantes frente a fungos e bactérias, e justifica que o efeito da toxicidade relacionado à estrutura molecular do tanino é ainda desconhecido. LOGUERCIO et al. (2005) realizaram estudo para avaliar a existência de efeito antibacteriano do extrato hidro-alcoólico a 10% (m/v) de folhas de jambolão ( Syzygium cumini (L.) Skeels). As folhas são ricas em taninos e saponinas. A investigação partiu da utilização popular como adstringente, diurético, antidiabético e estomáquico. Foram utilizadas várias cepas bacterianas gram positivas e gram negativas e comparado os halos de inibiçao de crescimento bacteriano causados pelo extrato, etanol, solução salina e antimicrobiano padrão para teste de resistência específico para cada bactéria. Os resultados obtidos se encontram na Tabela 1.
Tabela 1. Diâmetros médios do halo de inibição (em mm) avaliados pelo método de difusão em Ágar (Kirby-Bauer) Isolado bacteriano Extrato Etanol Solução Salina Antimicrobiano Staphylococcus sp. 147/02^ GRAM POSITIVAS Staphylococcus sp. 558/96 22a*20a 5,67b5b 6,67b1,0c^ 4,33b8b S. aureus 147/02 12a 6bc 2,67c 10,67ab S. aureus 144/98 16,33b 1,67c 4c 24a S. intermedius 115/92 24b 5c 6,33c 29,33a S. aureus Bacillus cereus ATCC (^) 179/94 25923 26,67b 2c 7,67c 38,33a Corynebacterium sp. 083/99 14,67b^ 4,33c^ 4c^ 22a Rhodococcus equi 488/01 25,67b19,67a^ 7,33c5b 7,67c5,33b^ 31,67a22a Streptococcus canis 154/90 15b 4c 3,33c 29,67a GRAM NEGATIVAS E. coli 120/93 17a 4,33bc 2,67c 8,67b E. coli E. coli 158/93ATCC 25922 17,33a 2,33b 2b 21,33a Salmonella typhi ATCC 6539 23,33a22,67b^ 1,33c2c^ 0,67c1,67c^ 10,67b31,33a S. Chorelasuis ATCC 10708 24,33a 1,33c 2,67c 18,33b Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 21b 1,33c 2c 30a Proteus sp. 447/01 12,67a 1c 0,67c 9,33b *Médias seguidas de letras desiguais diferem entre si pelo teste de Duncan em nível de 5% de probabilidade de erro. Fonte: Adaptada de LOGUERCIO et al. (2005)
O extrato apresentou efeito inibitório sobre várias bactérias, inclusive apresentando resultados melhores que antimicrobianos comerciais. Diferenças de atividade frente bactérias gram-positivas e gram-negativas são atribuídas à constituição da parede celular bacteriana. Bactérias gram-positivas possuem paredes celulares quimicamente menos complexas e têm menor teor lipídico do que as gram-negativas. AURICCHIO et al. (2007) realizaram experimento para verificação de possíveis ações antimicrobianas, antioxidantes e tóxicas do extrato hidroalcoólico de Eugenia uniflora L, composto por flavonóides e taninos (20,06%).O extrato demonstrou atividade antimicrobiana a Staphylococcus aureus, Salmonela cholerasuis e Pseudomonas aeruginosa. Pelos dados das análises realizadas, foi verificada a atividade antioxidante in vitro e a baixa toxicidade no ensaio agudo com camundongos. O efeito foi atribuído aos compostos fenólicos, principalmente os taninos. Ação antiviral de taninos foi pesquisada por COHEN et. al. (1964). Realizaram inoculação do extrato de Melissa officinalis em ovos embrionados com 9 a 11 dias de idade, e posteriormente desafiaram com os vírus Newcastle, Herpes, Vaccinia, Semliki Forest. A administração prévia do extrato possibilitou a sobrevivência dos embriões, sugerindo a atuação de taninos nos mecanismos de infecção viral. A atividade antiparasitária é relatada em alguns trabalhos. VILLALBA et al. (2010) realizaram experimento em que buscaram avaliar a preferência de consumo entre feno de alfafa ou feno de alfafa misturado com quebracho ( Schinopsis quebracho-colorado ), que é fonte de tanino, e a carga parasitária em cordeiro. O grupo de tratamento com feno de alfafa acrescido de quebracho apresentou níveis menores de carga parasitária. Os resultados obtidos da preferência de consumo levaram os autores a concluir que os animais naturalmente infectados procuram alimentar da mistura com taninos que sugere mecanismo semelhante a auto-medicação. Em recente estudo realizado por SIA et al. (2011), foi avaliado a ação do extrato de Mimosa pudica em veneno de Naja kaouthia , e foi comparado com taninos utilizados comercialmente (ácido tânico) no tratamento de picadas. A pré-incubação do veneno com o extrato manteve 100% de sobrevivência no grupo de ratos após 24 horas. Foi considerado mais eficaz
proteínas. Por outro lado, podem formar complexos ternários de proteína- tanino-polissacarídeo que, pelo caráter iônico dos polissacarídeos, seria mais solvatado em solução e isto poderia diminuir a agregação. Pelos resultados obtidos com as diferentes proteínas (BSA, IB8c e α-amilase), constatou-se que existe grande dependência da concentração de proteína e de tanino no fenômeno da agregação.
2.1.4 Utilização comercial
Atualmente, vários são os usos dos compostos tânicos. O uso no curtimento do couro feito a milhares de anos merece destaque já que utiliza grandes quantidades dos taninos vegetais no dito “curtimento vegetal” e em outras etapas do processo. Geralmente, é utilizado para produção de solas e de tipos especiais de couro, e também em combinação com os outros tipos de curtimento (sintético, por exemplo). Pelo seu alto custo, os taninos são reutilizados o máximo possível, fazendo só a reposição de solução para o lote seguinte. Com o aumento do uso de materiais sintéticos na fabricação de solas, o curtimento vegetal de couro para este fim diminuiu significativamente (PACHECO, 2005). As espécies vegetais mais utilizadas como fontes de taninos são quebracho ( Schinopsis spp.) e acácia ( Acacia mearnsii De Wild.). Além dessas são produzidos também a partir dos gêneros Çeneros, Tsuga, Castanea, Quercus, Terminalia (MELLO & SANTOS, 2001). Taninos condensados têm sido usados para fabricação de polímeros e resinas (BATTESTIN et al., 2004 ). Esses polímeros têm sido utilizados como um meio para reduzir o fluxo de água em barragens, para estabilizar o solo em fundações de construções, na produção de borrachas, na fabricação de conglomerados e laminados de madeira. Na fabricação de resinas de troca catiônica, as características são semelhantes às resinas derivadas do petróleo (LELIS & GONÇALVES, 2001). Também são relatados como agentes floculantes ou coagulantes para o tratamento de água (PORTER & HEMINGWAY, 1989; citado por BATTESTIN et. al, 2004).
Quando sulfonados, os taninos condensados podem ser empregados para formar complexos de metais pesados solúveis em água, utilizados em plantas cítricas com deficiência de ferro ou na complexação com chumbo no controle de poluição em rodovias. Para a preservação da madeira, complexos com cobre são efetivos biocidas (MELLO & SANTOS, 2001). Taninos também estão presentes em bebidas de consumo humano, nas quais são responsáveis pelo sabor adstringente de vinhos, sucos de frutas, chás e outras bebidas. O ácido tânico é utilizado na produção de cerveja para reduzir a concentração protéica pela precipitação como complexos tanino- proteicos (REINOLD, 1999). Os flavan-3-óis, proantocianidinas e antocianidinas têm grande importância para o desenvolvimento de sabor e aparências do vinho tinto em seu processo de envelhecimento (SINGLETON, 1992).
2.1.5 Taninos na nutrição animal
Os taninos condensados são bastante conhecidos como fatores antinutricionais de alimentos utilizados em dietas dos animais de produção. Representam o grupo mais importante de polifenóis na nutrição animal, em função dos efeitos deletérios no aproveitamento das rações e no desempenho produtivo dos animais (WARREHAM et al., 1994). MITJAVILA et al. (1977) verificaram que o ácido tânico adicionado na dieta de ratos aumentou a excreção de ácido siálico e glicosamina, indicando que o excesso de nitrogênio liberado nas fezes seria de origem metabólica (muco gastrointestinal). Nesse estudo, foram utilizadas pequenas doses de ácido tânico, doses que são normalmente encontradas em alimentos consumidos. O aumento do muco não foi suficiente para proteção das mucosas, que na análise histopatológica evidenciou necrose intestinal e erosão nas células da camada mucosa. Os taninos na nutrição animal interferem de maneira distinta em animais monogástricos e ruminantes. Em ruminantes, os taninos podem produzir efeitos positivos reduzindo a quantidade de proteína digerida no rúmen e, aumentar a quantidade de proteína disponível no intestino delgado, eliminar parasitas e diminuir o timpanismo espumoso (MUELLER-HARVEY, 2010).
sorgo, a canola e o girassol. O sorgo é separado em duas categorias com relação a quantidade de taninos: sorgo alto e baixo tanino. Segundo GARCIA et al. (2004), entre os alimentos alternativos, o sorgo destaca-se como capaz de reduzir os custos de forma significativa na alimentação de aves. Os autores não verificaram diferença entre os coeficientes de digestibilidade da proteína bruta obtida para a dieta de sorgo alto tanino comparada com o sorgo baixo tanino. O grupo tratado com milho apresentou melhores resultados para os parâmetros avaliados. Em outro trabalho, GARCIA et al. (2005) afirmam que apesar da maior parte do sorgo produzido atualmente no Brasil possuir baixo tanino, em algumas regiões (Sul e Nordeste), há necessidade do cultivo de variedades com alto teor de tanino pela susceptibilidade do grão ao ataque de pássaros. Os autores avaliaram dietas com milho e farelo de soja, sorgo com alto tanino e farelo de soja e sorgo com baixo tanino e farelo de soja e o desempenho, o rendimento de carcaça e medidas gastrintestinais de frangos. Concluíram, que ao utilizar sorgo com alto tanino (cultivar AG3002 com 1,89 g/kg de tanino) e sorgo com baixo tanino (cultivar SAARA com 0,49 g/kg) em substituição ao milho não houve efeito para desempenho e rendimento de carcaça, vísceras e medidas de intestinos (comprimento e peso relativo). Anteriormente, NUNES et al. (2001) observaram que ao substituir o milho pelo sorgo em dietas de frangos, houve atrofia na mucosa do íleo e encurtamento das vilosidades, resultando em distorção de sua arquitetura, edema no tecido conectivo das vilosidades, hiperplasia e hipertrofia das células de goblet (secreção de muco), além de hipertrofia da glândula parótida. Em eqüinos, OLIVEIRA et al. (2007) realizaram estudo para avaliar o efeito nutritivo de grãos secos ou ensilados de sorgo de baixo e alto conteúdos de tanino e a cinética do trato digestório. Os valores de digestibilidade da proteína bruta para as dietas contendo grãos de sorgo de baixo teor de tanino (seco ou ensilado) e grãos ensilados de alto conteúdo de tanino foram superiores aos da dieta com grãos secos de sorgo de alto nível de tanino. Demonstra o efeito benéfico da ensilagem na desativação dos taninos, evitando que se liguem à proteína da dieta. GOLLCHER et al. (2010) compararam o valor nutritivo de silagens de grãos de sorgo de baixo e alto teor de tanino na alimentação de equinos.
Concluíram que a utilização da silagem de grãos de sorgo com baixo tanino é um alimento alternativo promissor nas formulações das dietas de eqüinos. Para diminuir os efeitos deletérios ocasionados por taninos nas dietas, além do processo de silagem, alguns tratamentos estão sendo pesquisados. PEREIRA FILHO et al. (2003) avaliaram o tratamento da silagem de jurema-preta ( Mimosa tenuiflora. Wild) com hidróxido de sódio e a interferência na concentração de taninos. A concentração de tanino total na MS do feno de jurema-preta diminui linearmente com o aumento de hidróxido de sódio na solução alcalina utilizada no tratamento químico, reduziu em até 27% o teor de tanino.
2.2.1 Caracterização química e classificação
Saponinas são glicosídeos de esteróides ou de terpenos policíclicos. É uma estrutura com caráter anfifílico, parte da estrutura com característica lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra hidrofílica (açúcares). Essa característica determina a propriedade de redução da tensão superficial da água e suas ações detergentes e emulsificante (SCHENKEL et al., 2001). São classificadas de acordo com o número fundamental da aglicona, e também, pelo seu caráter ácido, básico ou neutro. Assim, quanto a aglicona, denominam-se saponinas esteroidais e saponinas triterpênicas.
Figura 4 – Ácido glicirricínico, um triterpeno pentacíclico FONTE: SIEDENTOPP (2008).
2.2.3 Propriedades biológicas
As saponinas são substâncias derivadas do metabolismo secundário das plantas, relacionados, principalmente, com o sistema de defesa. São encontradas nos tecidos que são mais vulneráveis ao ataque fúngico, bacteriano ou predatório dos insetos (WINA et al., 2005), considerando-se parte do sistema da defesa das plantas e indicadas como “fitoprotetoras” (PIZARRO, 1999). Essa atividade seria devido a interação com os esteróis da membrana (FRANCIS et al., 2002). O comportamento anfifílico das saponinas e a capacidade de formar complexos com esteróides, proteínas e fosfolipídeos de membranas possibilitam ações biológicas variadas. Vale ressaltar a ação sobre membranas celulares que pode alterar a permeabilidade ou até mesmo levar à destruição (SCHENKEL et al., 2001). Relacionadas com essa ação sobre membranas, estão as atividades hemolíticas, ictiotóxica e molusquicida. A irritação causada nas mucosas é relata por alguns autores como fator que impede o desenvolvimento de aplicações práticas. ÁLVARES (2006), verificou a tendência de diminuição nos parâmetros sanguíneos de hemácias e hematócrito após a adição de extrato de Yucca schidigera na ração de cães adultos. Porém, ainda permancendo dentro dos valores de referência. Não houve alterações significativas em outros parâmetros sanguíneos avaliados (proteínas totais, proteínas plasmáticas totais, albumina, globulina, ALT, AST, fosfatase alcalina, uréia, creatinina, colesterol). A capacidade de ligação das saponinas com esteróis (colesterol como principal objeto dos estudos) têm sido investigados principalmente na medicina humana. Atividades hipocolesterolemiante são relatadas. O mecanismo da ação poderia ser explicado pelo aumento da excreção do colesterol por formação de complexo com as saponinas administradas por via oral, ou pelo aumento da eliminação fecal de ácidos biliares com maior utilização do colesterol para síntese dessas substâncias. Outra proposta, leva em consideração as propriedades irritantes das saponinas. Com a formação dos complexos entre as saponinas e o colesterol
das membranas das células da mucosa intestinal, ocorreria uma esfoliação com perda da função e redução da área de absorção (CHEEKE, 1996). FERREIRA et al. (1997) executaram ensaio in vitro para verificar o efeito de saponinas presentes na erva-mate com ácidos biliares e colesterol. A partir dessas observações, concluíram que há diminuição desses ácidos e aumento da sua eliminação, e, portanto, parte do colesterol da corrente sanguínea seria desviado para suprir sua carência na bile. As saponinas são importantes para a ação de drogas vegetais, destacando-se as tradicionalmente utilizadas como expectorantes e diuréticas (SIEDENTOPP, 2008). Entretanto, o mecanismo de ação dessas drogas não está bem elucidado. Alguns autores argumentam que a irritação no trato respiratório aumentaria o volume do fluido respiratório e reduziria sua viscosidade. Outra possibilidade seria relacionada a sua tensão superficial originando, menor viscosidade e maior facilidade de expulsão do muco. A atividade diurética é atribuída à irritação do epitélio renal causada pelas saponinas (SCHENKEL et al., 2001). Entretanto, em pesquisa realizada por DINIZ (2006), as saponinas triterpênicas reduziram o fluxo urinário em ratos. O mecanismo provável seria a aumento da reabsorção de água nos túbulos renais, já que foi verificado aumento na atividade das ATPases renais. Outros empregos destacados são como adjuvantes para aumentar a absorção de medicamentos pelo aumento da solubilidade ou interferência nos mecanismos de absorção e, como adjuvante para aumentar a resposta imunológica. As saponinas mais utilizadas como adjuvantes são Quil A e seus derivados QS-21, isolados da casca de Quillaja saponaria Molina. São capazes de estimular o sistema imune e as torna ideais para uso em vacinas de subunidades, vacinas contra patógenos intracelulares, e vacinas terapêuticas (Ex: câncer). No entanto, saponinas Quillaja têm inconvenientes graves, como alta toxicidade, efeito hemolítico indesejável e instabilidade na fase aquosa que limita seu uso como adjuvante na vacinação (SUN et al., 2009).
