UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA, MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS DE
MICROBIOLOGIA APLICADA À
ODONTOLOGIA I
Juiz de Fora
2020
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ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA ..., Notas de estudo de Microbiologia
Tratado de micologia médica. 9ª Edição. 2002. MADIGAN, Michael T. et al. Microbiologia de Brock. 14ª Edição. Artmed Editora,. 2016.
Tipologia: Notas de estudo
2022
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA, MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS DE
MICROBIOLOGIA APLICADA À
ODONTOLOGIA I
Juiz de Fora
SUMÁRIO
Organização: Profa. Ana Carolina M. Apolônio
- DE MICROBIOLOGIA...................................................................................................... NORMAS DE SEGURANÇA PARA TRABALHOS PRÁTICOS NO LABORATÓRIO
- INTRODUÇÃO.................................................................................................................
- USO DO MICROSCÓPIO................................................................................................
- MEIOS DE CULTURA.....................................................................................................
- TÉCNICAS DE SEMEADURA.........................................................................................
- UBIQUIDADE MICROBIANA: IMPORTÂNCIA NA PRÁTICA ODONTOLÓGICA..........
- COLORAÇÃO DE GRAM
- CONTROLE DA MICROBIOTA DAS MÃOS e POPULAÇÃO MICROBIANA
- PROCESSAMENTO DE MATERIAIS E ESTERILIZAÇÃO
- TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE A FÁRMACOS ANTIMICROBIANOS.....
- INTRODUÇÃO AO CURSO PRÁTICO DE MICOLOGIA................................
- MACROMORFOLOGIA DOS FUNGOS....................................................
- MICROMORFOLOGIA DOS FUNGOS......................................................
- ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS ANEMÓFILOS
- ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE DROGAS
- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
desinfetantes), para serem, posteriormente processados. Nunca deixá- los sobre a área de trabalho ou pia.
- Cuidado ao acender o bico de gás (bico de Bunsen). Aproximar, primeiro a chama do bico e em seguida abrir a chave seletora. Mantê-lo aceso somente quando da execução do trabalho. Observar, também, se não há produtos inflamáveis (álcool, éter, acetona, etc) nas proximidades da chama. Durante os trabalhos, manter o bico de gás aceso somente quando necessário.
- As alças, agulhas e espátulas de repicagem devem ser aquecidas ao rubro antes e, após a sua introdução nas culturas. Estes os tubos com cultura deverão ter as suas bocas flambadas após a retirada da rolha e, também, antes de recolocá-la. Nunca coloque a rolha sobre a bancada.
- Os tubos de ensaio e placas de Petri com mios de cultura, inclusive aqueles com crescimento de microrganismos, só poderão ser abertos nas proximidades da chama, para evitar contaminação. Não tocar no meio de cultura com dedos e quaisquer outros objetos. Deixar as placas e tubos abertos o tempo mínimo necessário para realizar a operação (repique) e fechá-lo, imediatamente, após.
- As alças e agulhas de platina, pinças, estiletes, cotonetes, tubos contendo os meios de cultura, reagentes e corantes, etc., devem ser colocados nos suportes apropriados, e nunca nos bolsos do jaleco abandonados sobre a bancada de trabalho.
- Todo o material utilizado nos experimentos, como por exemplo, as placas de Petri e os tubos de ensaio contendo meios de cultura ou soluções, deverão ser devidamente identificados para observações posteriores: disciplina, data, curso, equipe, microrganismo ou material utilizado.
- Antes de qualquer observação microscópica, devem ser verificadas as condições em que se encontra o microscópio. O microscópio deve ser manuseado cuidadosamente. Qualquer dano ou defeito deve ser, imediatamente, comunicado ao professor.
- Após o uso do microscópio, desligá-lo, retirar a lâmina usada e quando for o caso, dispensá-la na cuba apropriada. Limpar as objetivas com
algodão embebido em xilol ou benzina e depois com um algodão seco ou flanela.
- Terminado o trabalho prático, deixar a bancada em ordem.
- Sempre lavar as mãos com água e sabão antes e após terminar o trabalho prático.
Atenção: Cada aula prática deverá iniciar-se com uma explicação e um período de demonstração. O trabalho não deve ser iniciado pelo aluno, até que tenha recebido todas as instruções necessárias.
Agar ao meio), e eventualmente semi-sólida (denominados de meios semi- sólidos, obtidos pela adição de pequena quantidade de Agar ao meio).
Conforme já dito, o estudo morfo-bioquímico-fisiológico dos microrganismos (bactérias e fungos) depende da obtenção de uma grande quantidade de células de microrganismos idênticos (cultura pura), que são obtidos em laboratório pelo isolamento. Para isto, devemos preparar meios de cultura e conservá-los em condições de esterilidade (desprovidos de qualquer forma de vida). Ao introduzirmos neste meio o inóculo teremos o cuidado técnico necessário para que não haja contaminação externa (ambiental). Este procedimento deve ser realizado assepticamente.
Após o inóculo, o meio de cultura com os microrganismos é incubado (colocado para crescer) em atmosfera e temperatura adequadas para o crescimento do microrganismo em estudo.
O crescimento microbiano é identificado visualmente pela turvação quando em meios líquidos e pela formação de colônias quando em meio sólido.
EXEMPLOS DE MATERIAIS UTILIZADOS
PIPETA PASTEUR BASTÃO DE VIDRO
LÂMINA DE VIDRO
PROVETA
BICO DE BUNSEN
ALÇAS BACTERIOLÓGICA
TUBOS DE ENSAIO PLACAS DE PETRI
BEQUER ERLENMEYER
USO DO MICROSCÓPIO
FOCALIZAÇÃO COM OBJETIVAS DE AUMENTO DE 10 E 40X
- O microscópio já se encontra sobre a bancada, coberto com uma capa protetora.
- Ligar a luz do microscópio
- Centrar o microscópio observando a posição da objetiva, do condensador e do diafragma, para se obter um campo bem iluminado.
- Colocar a lâmina preparada na platina do microscópio e com objetiva de 10X em posição de foco, abaixar o canhão do microscópio por meio de parafuso macrométrico até o aparecimento da imagem. Com o parafuso micrométrico, ajustar a sua nitidez.
- Sem mover o canhão e a platina do microscópio, mudar a objetiva de aumento para a de 40X. Se houver necessidade, ajustar a iluminação e o foco.
FOCALIZAÇÃO COM OBJETIVA DE IMERSÃO
- O microscópio já se encontra sobre a bancada, coberto com uma capa protetora.
- Ligar a luz do microscópio.
- Suspender o condensador ao máximo. Abrir todo o diafragma. Verificar se o campo do microscópio está bem iluminado.
- Colocar a lâmina, com uma gota de óleo de cedro sobre o esfregaço na platina do microscópio.
- Baixar o canhão do microscópio de modo a mergulhar a objetiva de imersão no óleo. Suspender o canhão do microscópio por meio de parafuso macrométrico até o aparecimento da imagem e, com o parafuso micrométrico ajustar a nitidez.
TÉCNICA DE SEMEADURA
As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere microrganismos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas.
1- Técnica de Semeadura em Estrias (fig. 1):
O bjetivo - Obter o crescimento do microrganismo no meio de cultura afim de:
Estocar a bactéria;
Estudar seu metabolismo em uma prova “bioquímica”;
Avaliar sua capacidade de crescimento ou não no meio de cultura;
Procedimento – em meio de cultura sólido, inclinado ou em placa, semea-se o microrganismo com auxílio de alça bacteriológica, fazendo estrias na superfície de um ponto (ápice) a outro do meio.
2- Técnica de Semeadura em Picada (fig. 2):
Objetivo - Verificar a motilidade do microrganismo no Agar Semi-Sólido.
Procedimento – Semea-se o microrganismo com auxílio de uma agulha de níquel cromo, fazendo uma picada no centro do meio de cultura penetrando até a metade da sua altura. Após o período de incubação interpretar o resultado:
Bactéria móvel: crescimento por todo meio de cultura.
Bactéria imóvel: crescimento somente no local da picada.
3- Técnica em Semeadura por Esgotamento:
Objetivo - Obter colônias isoladas, o que permite distinguir os diferentes micro- organismos em um material ou cultura microbiana através da sua morfologia colonial.
Procedimento – Semea-se o material ou a cultura microbiana com auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo sequências de estrias na superfície do meio de cultura da placa de Petri (Esgotamento Inicial). Faz-se sequências de estrias de modo a obter o esgotamento do inoculo da alça (estrias do bordo para o centro da placa) e consequentemente permitindo que os microrganismos se desenvolvam formando colônias isoladas. A flambagem da alça, quando se usa alça de níquel-cromo, ou a troca de alça bacteriológica, quando se usa a descartável, entre cada sequência de estrias aumenta a probabilidade de obtenção de colônias isoladas.
Materiais :
- 2 Placas de Petri contendo meio ágar nutritivo;
- Placas de Petri contendo meio ágar sabouraund;
- Hastes de algodão flexíveis e esterilizadas (Zaragatoa ou Swab);
- Estufa;
- Álcool a 70%.
Métodos :
Pesquisa de microrganismos no ar: Identificar a placa com o nome dos executantes e a data. As placas devem ser posicionadas lado a lado em uma superfície com a tampa voltada para cima. A tampa deverá ser retirada das duas placas simultaneamente pra exposição por 5 minutos e 20 minutos no mesmo local. Ao final de 5 minutos uma placa deverá ser fechada e ao final dos 20 minutos a outra placa deverá também ser fechada. Não se deve esquecer da identificação de qual placa foi exposta por qual tempo.
Pesquisa de microrganismos de outros ambientes: passar a haste flexível estéril em utensílios de uso comum como canetas, jalecos, etc. Passar a haste sobre a superfície do meio de cultura, por esgotamento. Em seguida, identificar a placa com o nome dos executantes e a data.
As placas de Agar nutritivo devem ser incubadas a 37ºC durante 3 dias e as de Agar sabouraud à temperatura ambiente por 7 dias.
LEITURA DOS CRESCIMENTOS MICROBIANOS: UBIQUIDADE (MORFOLOGIA MACROSCÓPICA DE BACTÉRIAS E FUNGOS) – LEITURA DA PRÁTICA DE UBIQUIDADE
Introdução : Cada célula ou esporo microbiano, em condições nutritivas favoráveis multiplica-se originando uma população. O meio de cultura sólido (Agar) permite in vitro o crescimento dessas células e esporos. A população
formada na superfície do meio, denominada colônia , pode ser observada a olho nu, macroscopicamente. Essas colônias podem ser analisadas por suas características, que chamamos morfocoloniais , e essa análise consiste de um dos primeiros passos para a classificação taxonômica de um determinado grupo microbiano.
As características avaliadas são:
Tamanho da colônia (para as bactérias e fungos leveduriformes) Puntiformes Pequenas (até 2 mm) Médias (2 a 4 mm) Grandes (acima de 4mm) Observação: Os fungos filamentosos apresentam colônias de tamanho variado sem definição de tamanho e, usualmente, apresentam crescimento ilimitado no meio de cultura. Aspecto Mucóide, cremoso ou butiroso (para as bactérias e fungos leveduriformes) Cotonoso, aveludado, granular ou pulverulento (para fungos filamentosos) Pigmentação Cor do verso – parte em contato com o ar Cor do reverso – parte em contato com o meio de cultivo Superfície Lisa e rugosa Côncava e convexa Uniforme, umbilicada e radiada Bordas Regulares Irregulares Serrilhadas ou dentadas
Anotações:
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MORFOLOGIA MICROSCÓPICA DE BACTÉRIAS E
COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM
Introdução: A morfologia das bactérias é outra característica fundamental para sua classificação e identificação preliminar. Além das formas básicas: cocos, bacilos e espirilos, avaliamos arranjos que são peculiares de cada gênero ou espécie, como cocobacilos, fusiformes, filamentosos, dentre outros. Em condições disgenésicas (culturas velhas, culturas em meios impróprios, culturas na presença de antimicrobianos) certas espécies bacterianas perdem sua morfologia característica e assumem formas bizarras, totalmente diferentes da forma normal. Em algumas espécies bacterianas tais variações da morfologia típica aparecem com grande frequência em função de alterações mínimas das condições de cultivo. São denominadas então de formas pleomórficas.
COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS: As bactérias podem ser observadas de duas maneiras: com e sem coloração.
1- Sem coloração: os microrganismos são observados vivos, podendo ser evidenciada a motilidade.
2- Com coloração: os microrganismos são corados, após serem mortos.
Apesar de quimicamente distintas do meio que as rodeiam, as bactérias são quase incolores, não apresentando contraste suficiente com o meio em que se encontram, o que dificulta sua visualização. A diferença química entre as bactérias e o meio é que nos permite distinguí-las por meio de coloração, pois o corante não reage com o meio externo, tornando-as quando coradas, mais visíveis ao microscópio. Desta maneira poderemos observar suas formas fundamentais, dimensões e arranjos.
A coloração apresenta ainda outras vantagens, pois com a utilização da objetiva de imersão teremos uma maior amplificação da imagem, além de nos permitir o estudo de estruturas da célula bacteriana como: parede celular, endósporos, flagelos e cápsula.
corada por tal método, algumas não o fazem satisfatoriamente, exigindo técnicas especiais de coloração. Elas são as micobactérias, nocardias, espiroquetas, micoplasma, riquétsias e clamídias.
Objetivos
- Corar uma lâmina pelo método de Gram;
- Reconhecer os principais tipos morfológicos bacterianos;
- Observar os principais arranjos das células bacterianas;
- Reconhecer bactérias Gram positivas e Gram negativas ao microscópio;
- Compreender a importância dessa coloração para microbiologia clínica;
- Compreender cada etapa do processo de coloração, bem como a função de cada substância utilizada.
Material
- Meios de cultura contendo crescimento bacteriano
- Lâminas para preparação do esfregaço
- Solução salina
- Alça bacteriológica
- Bico de bunsen
- Bateria de corantes para o Gram
Procedimentos
PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO A PARTIR DE CULTURA PRÉVIA
Limpar uma lâmina de vidro (passar algodão embebido em álcool) Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço, assim como sua procedência. Quando se tratar de uma cultura em meio líquido, com uma alça bacteriológica, tomar uma pequena porção da cultura, observando as
precauções de assepsia, e colocá-la sobre a lâmina espalhando-a para formar um esfregaço fino e uniforme. Quando a cultura for em meio sólido,colocar uma gota de água destilada esterilizada ou salina esterilizada sobre a lâmina e com uma alça bacteriológica, colher uma pequena quantidade de crescimento bacteriano da superfície do agar e suspendê-la na gota de água destilada, espalhando suficientemente para obter um esfregaço fino. Deixar a lâmina secar à temperatura ambiente; Fixar na chama do Bico de Bunsem, cortando a chama por 3x.
Observação: Quando se usar alça bacteriológica de plantina, esta deve ser aquecida ao rubro antes (para não contaminar a cultura bacteriana) e após (para não desprezar contaminada na bancada) o contato com a cultura bacteriana, tomando-se o cuidado de deixá-la esfriar dentro do campo de esterilidade da chama (próximo ao bico de Bunsen).
TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM A) Cobrir o esfregaço bacteriano com cristal violeta, deixar agir dois minutos e verter o corante na cuba. B) Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando- a levemente com água corrente (opcional). C) Cobrir o esfregaço com solução de lugol, deixar por dois minutos e retirar a seguir, lavando com um filete de água. D) Descorar o esfregaço usando uma solução de álcool acetona, rapidamente. E) Lavar com água corrente, imediatamente. F) Cobrir o esfregaço com a Fucsina, deixar por 30segundos e retirar G) Lavar com água corrente H) Secar com papel absorvente
*observar a lâmina: colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado e observar a lamina no microscópio, com objetiva de 100X