ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA ..., Notas de aula de Bioquímica

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ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA

BIOQUÍMICA

Prof:..........................................

INDICE

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

AULA PRÁTICA Nº 01

-Técnicas de Laboratório

AULA PRÁTICA No. 02 -Cromatografia de Aminoácidos em papel

AULA PRÁTICA No. 03

• Propriedades das Proteínas

AULA PRÁTICA No. 04 -Propriedades das Enzimas

AULA PRÁTICA No. 05 -Identificação de Carboidratos

AULA PRÁTICA No. 06

• Fermentação Alcoólica

AULA PRÁTICA No. 07 -pH, Tampões

AULA PRÁTICA No. 08

• Extração e Caracterização de Lípideos

AULA PRÁTICA No. 09

• Pesquisa Quantitativa dos constituintes químicos do Leite

AULA PRÁTICA No. 10

• Constituinte do Ovo

f) Relatório – deverá ser preenchido logo após o término de cada trabalho prático, no laboratório. A presença do aluno só será computada depois do relatório ter sido examinado e visado pelo professor responsável.

E - MATERIAL RECEBIDO E SUA LIMPEZA

1. Para a execução de cada trabalho prático as bancadas de estudantes receberão o material relacionado no roteiro.
2. O aluno não deverá utilizar o material de seus colegas, sobretudo quando eles estiverem ausentes.
3. Cada bancada é responsável pela manutenção da ordem em seu lugar e conservação de seu material de trabalho.
4. No caso de inutilização de algum material recebido, o estudante deverá dar conhecimento ao professor responsável, a fim de ser providenciada a sua substituição.
5. O aluno não deverá jogar fora o material que julga inutilizado, pois às vezes o mesmo poderá ser recuperado.
6. Terminados os trabalhos, o estudante deverá proceder à limpeza de seu material, deixando inteiramente limpos e em condições de ser utilizado novamente. Somente será dado o visto no relatório após a observação desta recomendação.
7. A limpeza da vidraria deverá ser procedida imediatamente após o seu uso. Quando necessário, empregar sabão. Em seguida, lavar abundantemente com água corrente e água destilada. O material é posto para secar espontaneamente, e no caso dos tubos de ensaio, os mesmos devem ficar emborcados no respectivo suporte.

F - REAGENTES

1. Para cada trabalho prático haverá à disposição dos estudantes uma provisão dos reagentes relacionados no roteiro
2. Imediatamente após o uso, cada reagente deverá ser colocado, para que possa ser utilizado por outro colega, na prateleira acima das mesas ou em seu lugar próprio.
3. Devem ser tomados os seguintes cuidados com os vidros de reagentes e as soluções neles contidas a fim de se evitar contaminações: a) não trocar as rolhas; b) não introduzir pipetas nas soluções padrões. Deve-se transferir um pouco da solução (volume aproximado ao que vai ser gasto) para um tubo de ensaio ou um béquer limpo de onde se pipetará a quantidade indicada. c) não restituir ao frasco original as soluções retiradas em excesso. d) caso seja autorizado, pipetar diretamente do vidro do reagente, usar sempre uma pipeta limpa.

G - EXECUÇÃO DOS TRABALHOS PRÁTICOS

1. Todos os trabalhos práticos devem ser executados com atenção rigor técnico e disciplina.
2. A inobservância de qualquer dos requisitos enumerados no item anterior pode introduzir erros que invalidam, parcial ou totalmente, o trabalho realizado. Isto significa desperdício de tempo, reagentes e material.
3. Para que o aluno alcance a eficiência desejada é necessário que tenha conhecimento prévio do trabalho prático a ser executado e seja pontual, assíduo e ordeiro.
4. Cálculos e anotações devem ser efetuadas no próprio guia de trabalhos práticos.

H - PREVENÇÃO DE ACIDENTES

1. Trabalhar sempre protegido por avental.
2. Não fumar dentro do laboratório.
3. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira antes de ter à mão a chama que deve acendê-lo.
4. Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter, etc) nas proximidades de uma chama.

5. Os reagentes tóxicos ou corrosivos, como alcalis ou ácidos fortes e concentrados não deverão ser pipetados, porém medidos em cilindros graduados ou, em alguns casos, em buretas.

I - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Durante este curso de laboratório o estudante tem a oportunidade de travar contato com algumas técnicas empregadas não só em análise de constituintes de líquidos fisiológicos, como também na pesquisa. Ao mesmo tempo, o estudante fica a par de alguns princípios teóricos suficientes apenas para uma compreensão e interpretação dos resultados experimentais. Para um conhecimento mais aprofundado da teoria e de outros métodos de dosagens, o estudante poderá consultar:

1. COOPER, T.G.; The Tools of Biochemistry. New York: John Willey & Sons. 1977. 423p.
2. VILELA, G.G.;BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1973. 552p.
3. WHARTON, D.C. McCARTY, R.E., Experiments and Mthods in Biochemistry. New York: The MacMillan Company. 1972. 350p.

COMO ESCREVER UM RELATÓRIO?

Deve conter uma breve introdução teórica sobre o assunto a ser estudado no laboratório. É importante que esta introdução não seja uma cópia de livros e, principalmente, da apostila, mas sim, represente o que o aluno assimilou sobre a teoria envolvida no assunto estudado. Os dados obtidos nas experiências realizadas no laboratório devem ser mostrados de forma clara. Junto aos resultados, deve vir uma discussão sobre os erros obtidos, a eficiência dos métodos utilizados etc, e a conclusão referente ao experimento. A bibliografia utilizada deve ser mencionada em um capítulo à parte. Um esquema de relatório é mostrado abaixo:

I - Introdução teórica. II - Objetivos da Aula. III - Resultados e conclusões. IV – Bibliografia.

Bibliografias

NOME DO(S) AUTOR(ES) Título da obra. Edição. Local da Publicação: Nome da Editora, Ano da publicação número de páginas ou volume da obra. Exemplo:

VILLELA, G. G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e experimentos de Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1973. 552p.

D – INTERPRETAÇÃO

1. Na parte I aprende-se: a técnica de pipetar soluções incolores e coradas; a preparar uma série de soluções de reagentes de volume conhecido e de concentrações diferentes; a técnica de misturar soluções em tubos de ensaio; a correlacionar altura de líquido no tubo de ensaio com o volume do mesmo, o que é útil para testes qualitativos.
2. Na parte II aprende-se: a técnica de diluir uma solução de concentração conhecida; a forma pela qual se completa o volume num balão volumétrico; a técnica de misturar soluções em balão volumétrico. Esta técnica é utilizada no preparo ou na diluição de soluções de concentrações definidas (molar, normal, etc.).
3. Na parte III aprende-se: como usar corretamente uma bureta, minimizando as causas de erro como deixar bolhas de ar no seu interior; e fazer transferências de volumes exatos, o que é aplicado para medida de reagentes tóxicos ou corrosivos, como soluções de cianeto ou ácidos concentrados; que volumes medidos em provetas são menos exatos que os medidos em bureta, fonte de erro que deve ser evitada.
4. Na parte IV aprende-se: a usar adequadamente um bico de gás; a aquecer líquidos em tubos de ensaio, observando-se o volume contido no mesmo, que não deve ser superior a metade da capacidade do tubo; a seguir as regras de segurança a fim de se evitar acidentes e perda de material. Não se deve deixar ferver até evaporação completa do líquido. Geralmente a primeira ebulição é suficiente.

E - PROCEDIMENTO

I - EMPREGO DE PIPETAS GRADUADAS

1. Treinar a técnica de pipetar usando água destilada. Observar: a leitura do menisco (solução incolor parte inferior do menisco) se faz ao nível do olho; não se sopra a pipeta; no fim do escoamento toca-se a ponta da mesma na parede interna do recipiente; mantêm-se sempre a pipeta na posição vertical. Mede-se a quantidade de 1íquido escoado, por isto deve-se partir sempre da marca zero.
2. Completar as tabelas dadas no relatório (item F1).
3. Transferir para o béquer uma quantidade de solução corada um pouco maior do que a que se vai utilizar. Transferir água destilada para o erlenmeyer.
4. Marcar 20 tubos de ensaio, de mesmo diâmetro e altura para cada série, de 1 a 5, de 6 a 10, de 11 a 15 e de 16 a 20
5. Usando a pipeta graduada de 1 ml ao 0,01, pipetar alíquotas da solução corada (ler o menisco na parte superior) para os respectivos tubos, seguindo o esquema do relatório (item F-1 série A).
6. Lavar a pipeta com água comum e água destilada.
7. Utilizando a mesma pipeta, adicionar água destilada de modo a se completar o volume final da pipeta em questão (1 ml).
8. Misturar bem os dois líquidos, sem inversão.
9. Observar e correlacionar a altura do líquido contido nos tubos com o seu volume. Registrar em cm na tabela correspondente.
10. Repetir as operações 5 a 8 com as outras pipetas graduadas (itens F-1 séries B e D).

II - EMPREGO DE PIPETA VOLUMÉTRICA E BALÃO VOLUMÉTRICO

1. Medir com pipeta volumétrica 10 ml da solução corada.
2. Transferir esta alíquota para um balão volumétrico de 100 ml.
3. Adicionar cerca de 80 ml de água destilada.
4. Completar cuidadosamente o volume com água destilada até a marca (parte inferior do menisco), empregando pipeta ou pisseta.
5. Misturar bem invertendo o balão pelo menos 10 vezes. Conservar a solução para uso posterior. 06. Ler a interpretação.

07. III - OPERAÇÃO COM BURETA E PROVETA

1. Lavar a bureta segundo as instruções do item B.
2. Transferir para a bureta, com o auxílio do funil, uma pequena porção da solução preparada acima. Remover o funil. Enxaguar a bureta e escoá-la totalmente. Repetir a operação.
3. Encher novamente a bureta com a solução de modo que o líquido ultrapasse a marca zero. Remover o funil.
4. Retirar as bolhas de ar da extremidade inferior e acertar o menisco em zero (a altura do olho).
5. Transferir sucessivamente alíquotas de 1,00 - 2,50 - 5,65 - 10,38 ml para tubos de ensaio. Fazer as leituras a altura do olho para evitar erro de paralaxe.
6. Acertar o menisco para o próximo número inteiro e transferir 20,00 ml da solução para a proveta.
7. Confrontar o volume transferido da bureta (20,00) com o marcado na proveta. Registrar.
8. Ler a interpretação.

IV - OPERAÇÃO COM BICO DE GÁS

1. Colocar cerca de 5 ml de água destilada em um tubo de ensaio.
2. Aquecer a água na chama de gás com agitação até a primeira fervura, empregando a pinça para segurar o tubo de ensaio. Observar: agitação contínua do tubo para evitar projeção do líquido; nunca manter a boca do tubo dirigida para si ou seu colega.
3. Ler a interpretação.

F - RELATÓRIO

Responder o relatório. Lavar todo o material recebido. Apresentar o relatório ao professor responsável.

1. Esquema que deve ser preenchido e seguido no item F.

Série A Tubos

Pipeta de 1,00 ml Série B Tubos

Pipeta de 2,00 ml

Solução corada (ml)

H 2 O (ml) Solução corada (ml)

H 2 O (ml)

1 0 1,00 1 0 2, 2 0,26 0,74 2 0,53 1, 3 0,40 0,60 3 1,00 1, 4 0,55 0,45 4 1,55 0, 5 0,80 0,20 5 1,80 0,

Série C Tubos

Pipeta de 1,00 ml Série D Tubos

Pipeta de 2,00 ml

Solução corada (ml)

H 2 O (ml) Solução corada (ml)

H 2 O (ml)

1 0 5,0 1 0 10, 2 1,7 3,3 2 2,4 7, 3 2,5 2,5 3 4,0 6, 4 3,0 2,0 4 6,3 3, 5 4,2 0,8 5 8,0 2,

2. Dar as características do material que encontrou em seu lugar, principalmente quanto a vidraria: tipo de graduação, capacidade e temperatura de calibração. a)___________________________________________________________ b)___________________________________________________________ c)___________________________________________________________

AULA PRÁTICA No. 02

CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS EM PAPEL

A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

No final desta aula prática o estudante deverá saber:

1. Preparar um sistema adequado para a execução experimental de cromatografia de aminoácidos.
2. Fazer a aplicação de aminoácido no papel de filtro.
3. Executar com precisão as operações necessárias à cromatografia ascendente.
4. Revelar um cromatograma.
5. Identificar aminoácidos de um cromatograma calculando seu Rf.
6. Ordenar solventes empregados em cromatografia de aminoácido baseado em sua polaridade.
7. Definir coeficiente de partição, fase móvel, fase fixa.

B - MATERIAL NECESSÁRIO

 tubo de ensaio de 25 x 200 mm com uma rolha de cortiça com percevejo.  papel de filtro Whatman no.1, em tiras de 17 x 170 mm.  tubos capilares  1 forro de papel.  lápis e régua  estufa a 90o^ – 100 o^ C  1 placa de Petri

C - REAGENTES

 Mistura de três amino-ácidos padrões (+ 0,2 M)  Mistura de amino-ácidos desconhecidos (+ 0,2 M)  Solvente: mistura butanol - ácido acético - água (4:1:5)  Revelador: solução de ninhidrina 0,25% em acetona.

D - INTERPRETAÇÃO

Cromatografia é uma técnica de grande importância na bioquímica moderna por permitir a separação, identificação e até dosagem de misturas que são de difícil resolução, como por exemplo: amino-ácidos, glúcides, ácidos graxos, assim como todos os seus derivados ou polímeros. 01.Princípio - A distribuição (partição) das substâncias (solutos) ocorre entre a fase aquosa estacionária e a fase solvente em movimento. O soluto move-se na direção do fluxo do solvente a uma velocidade que dependerá da sua atração, seja pela fase aquosa estacionária POLAR, seja pela fase orgânica (apolar) implica numa velocidade maior de migração.

2. Suportes - O sistema de soluto e solvente necessita de um suporte inerte, que variará com o objetivo da cromatografia. Pode-se utilizar papel de filtro, resinas e sais inorgânicos.
3. Tipos - Há várias formas de se efetuar uma cromatografia, donde os diversos tipos, de acordo com: a) suporte usado: papel, camada fina (silica gel), coluna e troca iônica (resinas e sais inorgânicos). b) fluxo do solvente: ascendente mono - e bidimensional, descendente mono- e bidimensional; disco. Adota-se geralmente as bidimensionais para os casos em que há acúmulo de solutos num único local na monodimensional.
4. Fatores - A migração do soluto é influenciada por: seu peso molecular, tipo de suporte, temperatura ambiente, sistemas de solventes, pH, polaridade, ação capilar, tempo de corrida, quantidade de soluto, etc.

5. 5. Identificação - são vários os métodos para identificar e até dosar os componentes de mistura cromatografada. Sua aplicação dependerá apenas do objetivo proposto e do tipo da cromatografia adotado. No caso da cromatografia em papel, deve-se fazer uma revelação. Isto é, aplica-se sobre o cromatograma um reagente que dê com o soluto uma reação corada, tornando-o portanto visível. No caso dos amino-ácidos emprega-se como revelador uma solução de ninhidrina que dá um produto azul com todos eles, exceto a prolina, cuja mancha é amarelada. No caso de se desejar fazer uma determinação quantitativa deve-se localizar a mancha e eluir a mesma.
6. Índice - Quando se realiza uma cromatografia em papel obtém-se um índice adicional que é característico para cada substância, desde que se fixe as condições da técnica. Este índice, Rf (ratio front) é dado pela relação existente entre a distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo solvente, a partir do ponto onde foi colocada a mistura. O Rf deverá ser sempre maior que zero. Se for igual a zero ou a 1, significa que a substância ou não se moveu, ou migrou com o solvente. Nestes casos, deve-se então modificar o sistema de solventes. Devido aos fatores mencionados acima, é aconselhável correr-se sempre que possível um padrão em paralelo com as misturas.

E - PROCEDIMENTO

IMPORTANTE: Em todas operações abaixo evitar tocar no papel de filtro com os dedos. Contaminações aparecerão, como manchas que prejudicarão o resultado da cromatografia. As bancadas de estudantes deverão executar as duas partes (I e II) em paralelo.

I - CROMATOGRAFIA DE AMINO-ÁCIDOS PADRÕES

1. Em uma das extremidades de tira de papel de filtro, a uma distância de 25 mm traçar a lápis uma linha transversal como referência para o ponto de origem.
2. Tocar com a ponta do tubo capilar contendo a mistura de três amino-ácidos padrões, o meio da linha transversal traçada (ponto de origem), deixando escoar um pouco da mistura, evitando que o mesmo se espalhe por uma área maior de 5 mm. Secar.
3. Repetir a mesma operação por duas vezes, tendo o cuidado de secar a mistura depositada antes do toque seguinte. Os três toques colocarão 2,5 a 20 l de mistura a ser cromatografa.
4. Fazer uma dobra na extremidade do papel de filtro contrária é quela onde foi feita a aplicação da amostra. Fixar a tira de papel de filtro na face inferior da rolha de cortiça por meio de um percevejo, de modo que a dobra se localize sobre o seu diâmetro.
5. Tampar o tubo de ensaio com a rolha fixada à tira de papel de filtro, tendo o cuidado de não deixar que a tira permaneça em contato com a parede interna do tubo.
6. Mergulhar a tira de papel de filtro no solvente + 1,5 cm, evitando que o ponto de aplicação da mistura permaneça em contato com o solvente.
7. Esperar o tempo suficiente para a frente do solvente chegar até + 1,5 cm da rolha.
8. Retirar a tira de papel de filtro da rolha e tampar novamente o tubo.
9. Marcar imediatamente a lápis o ponto atingido pela frente do solvente.
10. Secar a tira de papel de filtro na estufa a 90-100o^ C.
11. Revelar o cromatograma. Para isto mergulhar rapidamente a tira de papel de filtro em uma placa de Petri contendo o revelador.
12. Secar a estufa a 90-100o^ C.
13. Calcular os Rf. Para isto observar a figura abaixo

Rf =

A

B

II - CROMATOGRAFIA DE AMINO-ÁCIDOS DESCONHECIDOS

1. Repetir todo o procedimento anterior usando agora uma mistura de amino-ácidos desconhecidos.

AULA PRÁTICA No^03

PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS

A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

No final desta aula prática, o estudante deverá saber:

1. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento das propriedades das proteínas.
2. Definir os termos: desnaturação e precipitação salina.

B - MATERIAL NECESSÁRIO

1- Tipos de ensaio  - Pinça para tubos de ensaio  Pipetas graduadas: 1 ml, 2 ml, 10 ml  Papel de filtro  Funis de vidro  Espátula  Bequeres  1 termômetro

C - REAGENTES

Solução de albumina de ovo a 0,5% em tampão acetato de sódio a 0,025 M, pH = 4,5.

 Solução de glicina a 2%  Solução de ácido tricloroacético a 2%  Solução de ácido pícrico a 5%  Solução de cloreto férrico a 1%  Solução saturada de (NH 4 ) 2 SO 4  leite  Solução de gelatina  Tampão acetato de sódio pH 6,0; 4,7 e 3,  álcool etílico a 95%  NaOH 2N  Solução de HCl 2N  Espátula  Solução de CuSO 4 1%

D - INTERPRETAÇÃO

1. Neste procedimento verifica-se a desnaturação das proteínas pelo calor. A intensidade de desnaturação pode ser observada através da reação das proteínas aquecidas a diferentes temperaturas, com o Biureto (que contém CuSO 4 e NaOH): polipeptídeos contendo mais que 2 ligações peptídicas reagem com o Biureto formando compostos coloridos, enquanto os aminoácidos não reagem com o Biureto.
2. São reagentes alcalóides: ácido pícrico, ácido fosfomolíbdico, ácido tricloroacético, ácido ferrocianico, ácido sulfosalicílico e outros. Os ânions destes ácidos combinam-se com as proteínas que possuem carga positiva, formando sais insolúveis. (As proteínas apresentam-se carregadas positivamente quando estão em meio mais ácido em relação ao seu ponto isoelétrico (pH < pI).

3. Proteínas quando colocadas em solução de pH situado no lado alcalino ao seu ponto isoelétrico (pH > pI) estão carregadas negativamente e combinam-se com cátions de metais pesados formando proteinatos insolúveis.
4. Neste procedimento estamos fracionando as proteínas pela remoção da fase sólida de uma ou mais frações deixando outras na fase líquida, por adição de um sal neutro. As proteínas que ficaram no precipitado e aquelas que passaram no filtrado são testadas neste procedimento pelo reagente de Biureto.
5. As proteínas tem solubilidade mínima no pH correspondente ao seu ponto isoelétrico. Entretanto, a gelatina mesmo no pH do PI é parcialmente solúvel. Desta maneira, para melhor visualizar a precipitação no pH isoelétrico da gelatina, acrescenta-se um agente que compete com a proteína pelo solvente, num processo semelhante ao "salting-ou". Naturalmente, a maior precipitação é observada no pH correspondente ao pH isolétrico, devido a maior afinidade proteína-proteína.

E - PROCEDIMENTO

1. Desnaturação pelo calor

• Tomar 4 tubos de ensaio e numerá-los 1, 2, 3, 4. A cada um dos 4 tubos adicionar 4 ml de solução de albumina de ovo a 1% em tampão acetado de sódio 0,025 M pH = 4,5.
• Aquecer cada um dos tubos durante dois minutos nas seguintes temperaturas. (veja primeiro a observação) Tubo 1 – 100 oC Tubo 2 – 80 oC Tubo 3 – 60 oC Tubo 4 – 40 oC

Observação: Para conseguir as diversas temperaturas, proceda do seguinte modo:

Aqueça 250 ml de água até a ebulição. Nesta temperatura, aqueça o tubo 1. Após aquecer o tubo 1, adicione água fria até atingir 80oC(use termômetro); aqueça então o tubo 2. Adicionar água fria até atingir 60oC; aqueça o tubo 3. Adicionar água fria até atingir 40oC, aqueça o tubo 4. Filtrar no tubo utilizando papel de filtro pré-umidecido em água. Retirar de cada tubo 0,3 ml e fazer a reação de biureto do seguinte modo: A cada tubo contendo 0,3 ml adicionar 1 ml de NaOH 2N e, gota a gota, CuSO 4 a 1% (ler a interpretação).

2. Precipitação pelos agentes dos alcalóides 2.1.Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos tubos adicionar 3 ml de ácido tricloroacético a 2% observar se ocorre precipitação 2.2.Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina, e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos tubos de ensaio colocar 2 ml de NaOH 2N. Adicionar 3 ml de ácido tricloroacético a 2%. Observar se ocorre precipitação. 2.3.Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos 2 tubos adicionar 1 ml de ácido pícrico. Observar se ocorre precipitação (ler a interpretação).
3. Precipitado de proteínas pelos Sais de Metais Pesados 3.1. Em 2 tubos de ensaio separados adicionar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo. Adicionar, gota a gota, solução de cloreto férrico a 1%. Verificar a formação de precipitação. 3.2. Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos 2 tubos adicionar 2 ml de HCl 2N. E gota a gota, solução de FeCl a 1%. Observar se ocorre precipitação. (ler a interpretação).
4. Precipitação Salina

AULA PRÁTICA No^04

PROPRIEDADES DAS ENZIMAS

A - OBJETIVOS ESPECIFICOS

No final desta aula prática o estudante deverá saber:

1. Manipular experimentalmente soluções de enzimas.
2. Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidades.
3. Manipular reações catalizadas por enzimas com a finalidade de determinar semi- quantitativamente a influência da concentração de enzima, da temperatura e do pH na atividade enzimática.
4. O significado das operações e reações realizadas.

B - MATERIAL NECESSÁRIO

 pipetas graduadas de 1 ml  tubos de ensaio e suporte  banho maria a 37o^ C e banho de gelo  1 bico de gás  1 termômetro  algodão  1 espátula  1 béquer de 200 ml  3 béqueres 100 ml  suporte de pipeta  pinça de tubo de ensaio  conta-gotas

C - REAGENTES

 Éter ou parafina  Solução de sacarase (levedo de padaria 1g%)  Solução de sacarose a 1%  Solução de amido a 5%, 0,5%  Reagente de Benedict  Lugol

D – INTERPRETAÇÃO

A saliva contém uma enzima digestiva chamada amilase salivar que hidrolisa amido e glicogênio até maltose (dissacarideo redutor). A sacarase é também uma enzima digestiva presente no suco intestinal que hidrolisa a sacarose até glicose e frutose (monossacarideos redutores). Na pesquisa I, observa-se a propriedade "especificidade enzimática", isto é, a sacarase não hidrolisa o amido e a amilase salivar não hidrolisa a sacarose. Os resultados obtidos na pesquisa II mostram que as enzimas são termolábeis, isto é, perdem sua atividade quando aquecidas a altas temperaturas. A pesquisa III demonstra que quanto maior é a concentração da enzima maior é a intensidade de hidrólise evidenciada pela maior quantidade de redução de cobre. O 4o^ e 5o^ tubos funcionam como controles.

Com a pesquisa IV é constatada a influência da temperatura sobre a atividade das enzimas.

A pesquisa V mostra a influência do pH na atividade enzimática. Todas as enzimas possuem um pH ótimo, cuja atividade é máxima. No caso de pepsina este pH é em torno de 1,5.

E – PROCEDIMENTO

Coletar 1 ml de saliva e adicionar 9 ml de H 2 O destilada.

I - ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA

1. Colocar respectivamente em quatro tubos de ensaio numerados:  1 o^ - 1 ml de sacarase 1% + 1 ml de sacarose a 1%  2 º^ - 1 ml de sacarase 1% + 1 ml de amido a 5%  3 º^ - 1 ml de saliva + 1 ml de sacarose a 1 %  4 º^ - 1 ml de saliva + 1 ml de amido a 5%
2. Deixar ` temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos.
3. Adicionar, em seguida, a cada um dos tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.
4. Observar os resultados notando em quais tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).

II - TERMOLABILIDADE

1. Colocar respectivamente em dois tubos de ensaio numerados. 1 o^ - 1 ml de sacarase + 1 ml de H O destilada. Ferver e resfriar. 2 o^ - 1 ml de sacarase + 1 ml de H O destilada.
2. Adicionar a ambos os tubos 1 ml de sacarose a 1%.
3. Incubar os dois tubos em banho maria a 37oC por 10 minutos.
4. Adicionar aos 2 tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.
5. Observar os resultados notando em que tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).

III - INFLUÊNCIA EM CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

1. Colocar respectivamente em 5 tubos de ensaio numerados: 1 º^ - 0,2 ml de sacarase + 0,8 ml de H O destilada + 1 ml de sacarose a 1%. 2 º^ - 0,5 ml de sacarase + 0,5 ml de H O destilada + 1 ml de sacarose a 1%. 3 º^ - 1,0 ml de sacarase + 1,0 ml de sacarose. 4 º^ - 1,0 ml de H O destilada + 1,0 ml de sacarose. 5 º^ 1,0 ml de sacarase + 1,0 ml de H O destilada.
2. Adicionar aos 5 tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.
3. Observar os resultados notando em que tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).

IV - INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Numerar 4 tubos de ensaio e desenvolver as seguintes técnicas:

Tubos Amido 5% (ml) Água Destil. (ml) Enzima (ml) Temperatura para Incubação 1 2,5 2,5 - 30 – 37 oC 2 2,5 2,0 0,5 30 – 37 oC 3 2,5 2,0 0,5 0 – 10 oC 4 2,5 2,0 0,5 70 – 100 oC

Agitar os tubos e incubá-los nas respectivas temperaturas durante 15 minutos. Adicionar 2 gotas de lugol em cada tubo e agitá-los virogorosamente. Observar os resultados.

AULA PRÁTICA No. 05

IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS

A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

No final desta aula prática o estudante deverá saber:

1. Executar testes qualitativos para reconhecimento de glúcides. 02.O significado dos seguintes testes: iodo, Benedict, Seliwanoff, Molish. 03.Aplicar os testes acima para identificar três glúcides desconhecidos.

B - MATERIAL NECESSÁRIO

 tubos de ensaio e suporte  1 bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca  1 pinça para tubo de ensaio  1 bastão de vidro fino  lâmina e microscópio

C - REAGENTES

 Soluções padrões de glúcides (ver relatório)  Soluções de 3 glúcides desconhecidos,  Solução de lugol: 0,5 g iodo metálico, 1,0 g iodeto potássio, dissolvidos em 100,0 ml de água  Regente de Benedict: 17,3 g sulfato de cobre, 173,0 g citrato de sódio e 100,0 g carbonato de sódio anidro dissolvidos em 1.000,0 ml de água  Reagente de Seliwanoff: 0,05 g ressorcinol dissolvidos em 100,0 ml HCl + 6 N.  Solução alcoólica de alfa-naftol a 1%  H 2 SO 4 concentrado.

D – INTERPRETAÇÃO

Este experimento pode servir de modelo para caracterizá-1o dos constituintes de material biológico por meio de um conjunto de reações qualitativas. Pelo sistema de identificação e eliminação progressiva pode-se dizer, ao final do trabalho prático, quais foram os glúcides fornecidos dentre os seguintes: glicerose, glicose, frutose, lactose, manose, sacarose e amido, por exemplo.

1. O teste de iodo serve para diferenciar homopolissacárides dos outros glúcides. Os homopolissacárides, do tipo amido, formam com o iodo um complexo (produto de adsorção) colorido. Pela coloração resultante pode-se identificar, por exemplo: azul-amido; avermelhado-glicogênio; roxo avermelhado-dextrinas, incolor-inulina.
2. O teste de Benedict serve para diferenciar glúcides redutores de não redutores. Glúcides que tenham 1 carbono anomérico livre dão reações positivas, pois podem sofrer oxidação. A solução de Benedict contém um complexo de citrato e cobre. Em presença de açúcar redutor o Cu+2^ (azul) é reduzido a Cu+, que é menos solúvel em solução alcalina, e precipita sob a forma de Cu 2 O (amarelo ou vermelho). O açúcar, por sua vez, é oxidado, quebrado e polimerizado na solução.
3. O teste de Seliwanoff serve para diferenciar cetoses (por exemplo: frutose, sacarose) de aldoses (glicose, lactose).

Cetoses, quando em solução ácida e aquecimento, formam composto 4- Hidroximetil furfural que reage com o resorcinol (reagente de Seliwanoff) dando um produto de cor vermelha, cuja estrutura não é bem conhecida.

H 2 SO 4  composto vermelho Açúcar 

As Soluções concentradas de Aldoses também dão reação positiva, porém a velocidade da reação é pequena. Assim, corre-se um padrão contendo cetose (frutose, por exemplo) para, se fazer um controle do tempo de formação do produto colorido.

4. O teste de Molish serve para diferenciar açúcares de 5 ou mais átomos de carbono dos de menor número de átomos de carbono. Os de maior número de carbono (5 ou mais), sob a ação desidratante ao H 2 SO 4 , transformam-se em furfural ou Hidroximetil furfural. Estes reagem com os fenóis (no caso, o -naftol) dando origem a um composto marron-avermelhado. Para o bom êxito desta reação é necessário que o tubo de ensaio esteja bem seco e que haja a menor agitação possível.

E - PROCEDIMENTO

Para esta unidade prática o estudante deverá preparar antes de começar a mesma o quadro geral de reações de glúcides que consta no Relatório. Quando houver dúvida num resultado de reação, deve- se realizar o mesmo teste empregando a solução do glúcide padrão suposto. Não há necessidade de se medir com pipetas os reagentes fornecidos. Usar gotas, considerando que 1 ml = 20 gotas. Para as Soluções de glúcides desconhecidas, tomar volumes aproximados.

I - TESTE DE IODO

1. Colocar em tubo de ensaio + 1 ml da solução de glúcide a ser identificado.
2. Adicionar 1 gota da solução lugol. O aparecimento de coloração azul, indica reação positiva.
3. Ler a interpretação.

II - TESTE DE BENEDICT

1. Colocar em tubo de ensaio + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.
2. Adicionar 1 ml do reagente de Benedict e misturar.
3. Aquecer, com agitação e diretamente, na chama. Deixar em ebulição por + 1 minuto.
4. Observar a solução. A mudança de coloração (azul para verde até vermelho tijolo) e/ou formação de precipitado (cor de tijolo) indica reação positiva.
5. Ler a interpretação.

III - TESTE DE SELIWANOFF

1. Colocar em um tubo de ensaio + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.
2. Colocar em um tubo + 0,5 ml da solução de frutose (C = controle).
3. Acrescentar a cada um dos tubos 1 ml de reagente de Seliwanoff e misturar.
4. Colocar os tubos num banho de água em ebulição.
5. Observar periodicamente. No momento em que a coloração do tubo C ficar vermelha, retira-se os tubos do banho.
6. Comparar o tubo D com o controle. O aparecimento da cor vermelha indica reação positiva.
7. Ler a interpretação.