Técnicas de Preparação de Esfregaços de Sangue e Feces para Exame Microscópico, Notas de aula de Parasitologia

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MANUAL DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO

PARASITOLÓGICO

EXAME PARASITOLÓGICO DO SANGUE

HEMOSCOPIA

Obtenção do sangue A- Da micro-circulação superficial. Finalidade : Preparação de esfregaços em lâminas ou outros processos que usem pequenas quantidades de sangue. Material : Lanceta Algodão ou gaze Álcool 70% iodado Local da punção : Ponta do dedo anelar esquerdo ou lóbulo da orelha. Em crianças pequenas, punciona-se a polpa do grande artelho.

Técnica de punção : Limpar, massageando o local com álcool iodado, deixando secar espontaneamente. Puncionar firmemente com a agulha ou lanceta. Repetir a operação caso não atinja a profundidade desejada (2 a 3 mm). Desprezar a primeira gota de sangue, aproveitando as seguintes para fazer o esfregaço.

B- Do sangue venoso. Finalidade : Colhem-se, quando for necessário usar, volumes da ordem de mililitros. Material : Seringa descartável com dimensão adequada à quantidade de sangue a ser colhido. Agulha com calibre e comprimentos adequados.

MÉTODOS E TÉCNICAS UTILIZADOS NO DIAGNÓSTICO DE

PARASITOS DO SANGUE

Diferentes espécies de protozoários e helmintos em diferentes estágios de desenvolvimento são identificadas no sangue periférico humano. Assim

podem ser encontrados protozoários comoT. cruzi, P. vivax, P. falciparum, P.

malariae, B. bigemina e espécies de filárias (helmintos) como:W. bancrofti,

M. ozzardi, O. volvulus.

Parasitas como os tripanossomos e as filárias podem ser visualizados vivos devido à suas motilidade, deste modo para a pesquisa destes parasitas pode-se fazer o exame a fresco que consiste na coleta de uma gota de sangue que é colocada entre lâmina e lamínula. A técnica do microhematócrito, também permite a observação de parasitas vivos e é indicada nos casos de baixa parasitemia.

Esfregaços de sangue e coloração de parasitas do sangue.

A identificação de todos os parasitas sanguíneos pode ser feita usando- se dois tipos de esfregaços de sangue: esfregaço em camada delgada ou a gota espessa. No esfregaço de camada delgada a distorção do parasita é mínima (vantagem), mas há a desvantagem de ter que examinar muitos campos para se encontrar parasitas quando estes estão em pequeno número. Na gota espessa, apesar da distorção das formas parasitárias a probabilidade de detecção de parasitas aumenta porque a quantidade de sangue a ser examinada é cerca de três ou quatro vezes maior do que o esfregaço e a área examinada (1cm^2 ) menor. Esfregaços de sangue ou gota

espessa, com sangue capilar, devem ser feitos com gota de fluxo espontâneo e não contaminado com álcool. Estas técnicas são utilizadas para a pesquisa e o diagnóstico dos parasitas da malária, tripanossomos, microfilárias, babésias, tripanossomas e

Leishmania chagasi.

Esfregaço em camada delgada

Esta técnica é a mesma empregada na Hematologia; consiste na distensão seguida da secagem de uma gota de sangue obtido por punção da polpa digital ou do sangue venoso. Fixar com álcool metílico e corar com Giemsa ou Leishman.

Gota espessa

Esta técnica deve ser usada quando os parasitas são pouco abundantes porque as chances de encontrar os parasitas aumentam, pois em vez de examinar uma gota de sangue, são colhidas e examinadas três a quatro gotas que ficam estiradas em uma pequena área. Podem-se fazer várias gotas espessas em uma lâmina de vidro que, depois de secas são mergulhadas em água destilada ou filtrada para que as hemácias sejam lisadas, tornando a gota mais transparente. Deixa-se secar a lâmina, fixa-se com álcool metílico puro e leva-se para corar com Giemsa. A gota espessa é a técnica utilizada na rotina diagnóstica da Malária, é muito útil principalmente nos casos onde a parasitemia é baixa.

Técnica do Microhematócrito

CORANTES

Os derivados do Romanowsky são os mais utilizados; Destes os mais comuns são o Giemsa e o Leishman.

Giemsa (solução estoque) Azur II eosina 0,30g Azur II 0,08g Glicerina P.A. 12,50 ml Álcool metílico P.A. 37,50 ml Esta solução pode ser preparada em laboratório ou adquirida pronta. Ao usá-la, esta deve ser diluída em água da seguinte forma: três gotas de corante-estoque para cada 2 ml água.

Leishman O corante de Leishman é uma mistura de azul de metileno e eosina em pó, que pode ser adquirido no comércio. Azul de metileno e eosina (pó) 0,15g Álcool metílico P. A 100 ml.

Para preparar o corante, o pó é dissolvido em álcool metílico agitando-se freqüentemente, durante três dias. Devem-se guardar ambos os corantes (Giemsa e Leishman) em vidros âmbar e mantê-los em ambiente escuro. Para a confecção de esfregaço (em camada delgada e gota espessa) devem-se utilizar lâminas de vidro limpas e desengorduradas

Esfregaço em camada delgada Uma pequena gota de sangue é colocada próximo de uma extremidade da lâmina; com auxílio de outra lâmina (segurar por cima com a mão direita), em ângulo de 30º, colocada adiante da gota, o sangue vai se espalhar pela superfície de contato das duas lâminas. Com suavidade e rapidez deslizar esta segunda lâmina para frente de modo a espalhar o sangue até o fim da lâmina. Deixar secar ao ar. Fixar e corar.

Esfregaço em gota espessa Colher 2 a 3 gotas de sangue em uma lâmina. Utilizando o canto de outra lâmina, espalhar o sangue numa camada circular com 15 mm de diâmetro. Deixar secar ao ar por uma noite. Colocar a lâmina com a gota espessa num recipiente com água para a desemoglobinização (lise) das hemácias. Com a ruptura das hemácias a cor vermelha da hemoglobina desaparece da mancha de sangue e dá lugar a uma área esbranquiçada. Retirar a lâmina com cuidado e deixar secar. Fixar e corar.

Fixação do material e coloração Existem vários fixadores disponíveis, porém o mais utilizado é o álcool metílico. Para a fixação deve-se cobrir a lâmina com álcool metílico (PA) e deixar fixando por um minuto. Em seguida cobrir o esfregaço com corante Giemsa diluído, deixando-o agir por 30’ minutos. Escorrer o corante e lavar em água corrente; deixar secar e examinar em microscópio.

6- Deixar secar bem, fixar e corar com Giemsa. 7- Examinar com objetiva de imersão.

Técnica da filtração em membrana de policarbonato

Este é um método muito sensível porque permite o exame de pequenos volumes de sangue periférico e a total recuperação das microfilárias quando presentes em infecções leves.

1. Colher o 1 ml de sangue com EDTA, heparina ou citrato de sódio.
2. Diluir o sangue com solução salina tamponada* na proporção 1: 10
3. Montar a membrana de policarbonato (13 ou 25 mm de diâmetro e poros de 3 a 5 μm) em um suporte de filtro apropriado,
4. Filtrar a suspensão com ou sem bomba a vácuo
5. Em seguida lavar o filtro com salina tamponada (10 ml)
6. Lavar novamente, agora, com água destilada, para promover a lise das hemácias que ficaram retidas no filtro
7. Remover o material retido na membrana e colocá-lo em uma lâmina de vidro fazendo um esfregaço.
8. Deixar secar, fixar com álcool metílico por 2 minutos e corar com Giemsa.
9. Examinar no microscópio.

Solução salina tamponada* Cloreto de sódio 8,0 g Hidrogeniofosfato dissódico heptaidratado 2,17 g Diidrogeniofosfato de potássio anidro 0,20 g

Cloreto de potássio 0,20 g Água destilada deionizada q.s.p. 1.000 ml Esterilizar em autoclave e armazenar a 4º C.

EXAME PARASITOLÓGICO DAS FEZES

1- Receber as fezes em recipiente adequado. 2- As amostras devem ser correta e completamente identificadas com: o nome do paciente; idade, número de identificação do laboratório; hora da colheita e hora da chegada da amostra ao laboratório. As instruções, sobre a coleta de fezes devem ser claras e passadas ao paciente. É importante verificar se o paciente as entendeu, pois é na coleta adequada que se inicia a qualidade do exame parasitológico. 3- Para um trabalho rotineiro em Parasitologia é recomendável que se realize três exames parasitológicos. 4- Todos os parasitas observados devem ser relatados pelo nome científico, incluindo gênero e espécie, quando possível, e o estágio que estão. Determinados elementos celulares (GV, GB ou outras células), fungos ou cristais de Charcot-Leyden devem ser assinalados de modo semiquantitativo como: poucos cristais, moderados ou muitos. Também, deverão constar os métodos executados e a consistência das fezes. 5- Fezes líquidas devem ser examinadas dentro de 30 minutos; semi-sólidas dentro de 1 hora e formadas dentro de 24 horas. Se o exame for realizado depois de 24 horas a amostra deve ser mantida em preservadores/conservadores tais como: formol a 10%, álcool polivinílico (APV);

intestinal e, usado na preparação de esfregaços permanentes corados, principalmente, com a hematoxilina férrica. Como na sua fórmula contém HgCl 2 (cloreto de mercúrio-II, bicloreto de mercúrio ou cloreto mercúrico), deve-se tomar cuidado ao manusear esta solução pois é tóxica para o homem e o meio ambiente. Os frascos contendo este fixador deverão ser etiquetados como VENENO. Para a preparação do fixador são utilizados os seguintes reagentes: Cloreto de mercúrio-II, Álcool etílico a 95%, ácido acético glacial e glicerina.

Preparação das soluções A, B e C

A. Solução aquosa saturada de cloreto de mercúrio-II Cloreto de mercúrio-II 110g Água destilada deionizada 1.000 ml Preparar o bicloreto de mercúrio dissolvendo em água destilada quente. Aqueça em banho Maria até dissolver o sal, após o resfriamento filtre e estoque em recipiente de vidro com tampa esmerilhada.

B. Solução estoque Solução A 600 ml Álcool etílico a 95% 300 ml

C. Solução fixadora* Solução estoque(B) 100 ml Ácido acético glacial 5 ml *Adicionar a solução fixadora imediatamente antes do uso.

3. Fixador Álcool Polivinílico (APV) O PVA (EVANOL) é uma resina solúvel em água que é incorporada ao fixador de Schaudinn; utilizada para conservar e transportar fezes líquidas. O pó APV age como um adesivo para o material fecal e é um excelente preservador de trofozoítos e cistos ao quais são conservados durante anos.

Preparação do fixador APV segundo Burrows ( Burrows, R.B. Improved preparation of polyvinyl alcohol-HgCl 2 , fixative used for fecal smears. Stain Technol. 42: 93-95 , 1967). Fixador de Schaudinn 93,5 ml Ácido acético glacial 5 ml Glicerina 1,5 ml APV pó 5g

Misture, em um recipiente de vidro (boca larga), o fixador, o ácido acético e a glicerina adicionando lentamente sem agitação o APV pó. Cubra o recipiente com papel alumínio ou com a tampa de placa de Petri. Deixe a mistura em repouso de 18 a 24 h para que o APV fique embebido pelos líquidos. Em seguida, aqueça a solução lentamente até 75ºC. Uma vez atingida a temperatura remova o recipiente do aquecimento e agite até obter completa homogeneização da mistura. Em cerca de 30 segundos obtém-se uma solução viscosa clara, levemente esbranquiçada. Estoque a solução APV em frasco plástico com tampa de rosca ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada. A proporção adequada é usar, aproximadamemte, três partes do fixador para uma parte de fezes.

fixação dos organismos com a preservação de suas características morfológicas. Acetato de sódio 1,5 g Ácido acético glacial 2 ml. Formol 37% a 40% 4 ml Água destilada 92 m Estocar a solução em frasco plástico com tampa de rosca ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada. Para preservar a amostra fecal misturar uma parte de fezes com três partes de fixador.

EXAME MACROSCÓPICO

Procedimentos 1- Observar a consistência da amostra. Fezes moles ou líquidas sugerem a possível presença de trofozoítos de protozoários intestinais. Cistos de protozoários são encontrados com mais freqüência em fezes formadas. Ovos e larvas de helmintos podem ser encontrados tanto em fezes líquidas quanto em fezes formadas. 2- Examinar a superfície da amostra para observar a presença de proglotes de tênias, ancilostomídeos ou oxiúros adultos, por exemplo. 3- Examinar a amostra fecal com auxílio de um palito (sorvete) para verificar a presença de outros helmintos adultos. 4- Examinar as fezes quanto à presença de sangue e/ou muco. a) sangue fresco (vermelho vivo) indica hemorragia aguda no trato intestinal. b) muco sanguinolento sugere ulcerações e uma porção desse material deve, de preferência, ser examinada, ao microscópio, para a procura de trofozoitos.

Os vermes adultos, quando encontrados, devem ser imediatamente examinados e identificados. As tênias são identificadas especificamente pelo exame das proglotes grávidas. As proglotes devem ser fixadas em formol a 10% e depois clarificadas por imersão em glicerina ou solução de lactofenol (1:1).

EXAME MICROSCÓPICO

Permite a visualização de trofozoitos, cistos e oocistos de protozoários e de ovos e larvas de helmintos. É recomendável, quando se tratar de fezes diarréicas ou disentéricas, o emprego dos seguintes procedimentos: a) exame direto a fresco para observação dos movimentos dos trofozoitos, b) seguido de feitura de esfregaço de fezes com coloração permanente para observação morfológica dos trofozoítos, especialmente, de amebas e giárdias.

O exame de fezes pode ser quantitativo ou qualitativo. Os métodos quantitativos são aqueles nos quais se faz contagem de ovos para avaliação da carga parasitária. O mais conhecido é o de Stoll, mas, o mais empregado atualmente é o de Kato-Katz. Os métodos qualitativos são os mais utilizados para a demonstração da presença das formas parasitárias. Freqüentemente o número das formas parasitárias é pequeno, assim é necessário recorrer a processos de enriquecimento dessas formas para concentrá-las.

No momento de uso adicionar 2,5 ml de ácido acético para cada 50 ml.

2- Alúmen de ferro (sulfato de ferro amoniacal) a 2,5% Triturar os cristais de alúmen de ferro em Graal e diluir aos poucos com água destilada. Completar o volume. Essa solução mordente deve ser preparada fresca imediatamente antes do uso e estocada à temperatura do refrigerador.

3- Solução de hematoxilina a 0,5% a) Solução estoque de Hematoxilina a 10%. Hematoxilina (cristal) 10 g Álcool a 95% (v/v) 100 ml

Diluir a hematoxilina em pequenas quantidades no álcool e acrescentar a água destilada. Deixar a solução maturar durante seis semanas antes de diluir para uso. Após este tempo o corante apresenta uma coloração de vinho do Porto ou marrom alaranjada forte. Estocar em frasco âmbar com tampa esmerilhada.

b) solução corante de hematoxilina a 0,5% Solução estoque de Hematoxilina amadurecida 5 ml Água destilada deionizada 95 ml Esta solução diluída a 0,5 % não é estável e deve ser preparada quando o seu uso for necessário.

4- Álcool-salicilato

Álcool absoluto P.A. 100 ml Salicilato de metila (xilol) 100 ml

Coloração Técnica (segundo Correia e cols, 1984).

1. Filtrar as fezes, conservadas em Schaudinn ou SAF, em gaze dobrada quatro vezes.
2. Transferir cerca de 2 ml para um tubo e centrifugar por um minuto a 1.500 rpm.
3. Desprezar o sobrenadante, acrescentar solução salina a 0,85%, homogeneizar e centrifugar novamente.
4. Repetir a operação até obter um sobrenadante límpido
5. Desprezar o sobrenadante e acrescentar, ao sedimento, duas gotas de soro humano inativado.
6. Misturar bem e fazer esfregaços finos sobre lamínulas. A lamínula deve ser presa a um suporte de borracha pequeno (pode ser utilizada a borracha que serve de rolha) por meio de um entalhe, para facilitar o manuseio e a identificação do material. Desta forma, é possível a coloração de várias amostras ao mesmo tempo. Para manusear as lamínulas usam-se pinças de madeira, pois o fixador de Schaudinn ataca metais.
7. Sem deixar secar o esfregaço, colocar a lamínula com o esfregaço voltado para baixo, em uma placa de Petri contendo o fixador de Schaudinn com 5% de ácido acético por 10 minutos.
8. Passar a lamínula com o esfregaço voltado para cima para as placas de Petri subseqüentes, contendo os seguintes reagentes: a) álcool 70% (para retirar o excesso de fixador) 2 minutos