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REVIS√O: FILAMENTOS INTERMEDI¡RIOS
REVIEW: INTERMEDIATE FILAMENTS
Gisele F. Machado^1 ; Florêncio Figueiredo 2
Aluna^1 do Curso de Doutorado, Docente 2 do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. CORRESPONDÊNCIA : Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Campus Universitário - CEP: 14048-900 - Ribeirão Preto - SP.
MACHADO GF & FIGUEIREDO F. Revisão: filamentos intermediários. Medicina, Ribeirão Preto , 29: 104-113, jan./mar. 1996.
RESUMO: Os filamentos intermediários (FIs) têm se tornado objeto de interesse considerável para os biologistas celulares e moleculares. Muitos dados indicam que as proteínas dos FIs fazem parte de uma família multigênica, extremamente, heterogênea. A complexidade dos FIs pode estar relacionada com a sua diversidade de funções dentro das células. O artigo relaciona os principais filamentos intermediários de interesse para estudos sobre embriogênese, fisiologia e patologia dos tecidos de origem animal.
UNITERMOS: Citoesqueleto. Filamentos Intermediários
Medicina, Ribeir„o Preto, 29: 104-113, jan./mar. 1996 REVIS√O
INTRODU«√O
Os filamentos intermediários (FIs) compõem um sistema de estruturas filamentosas, no citoplasma e núcleo de células eucarióticas, diferente dos microfi- lamentos de actina, dos microtúbulos, que são consti- tuintes do citoesqueleto das células de quase todos os vertebrados. Por possuírem o diâmetro entre 7 e 11 nm foram denominados filamentos intermediários, isto é, entre os microtúbulos (20-25 nm) e os microfilamen- tos de actina (5-6 nm). São extremamente insolúveis, de composição protéica, completamente diferente da encontrada nos microfilamentos e nos microtúbulos, e formam uma rede estrutural que conecta as mem- branas celulares, organelas citoplasmáticas e o núcleo^1. Os primeiros relatos, encontrados na literatura, defi- niam 5 tipos de FIs nas células dos vertebrados 2 , dis- tribuídos nos tecidos da seguinte maneira: citoquera- tinas (tecido epitelial), vimentina (tecido mesenqui- mal), desmina (tecido muscular), proteína glial fibrilar ácida astrócitos), neurofilamentos (neurônios).
Atualmente, os FIs se encontram agrupados em 6 subclasses distintas (Tabela I), e segundo^3 , mais de uma classe de FIs pode ser encontrada na mesma cé- lula e o mesmo filamento pode conter mais de um tipo de subunidade protéica 2. Estas variações se tor- nam evidentes quando a composição de um determi- nado filamento intermediário é examinada em dife- rentes tipos celulares ou em diferentes estágios de di- ferenciação de um tipo celular, o que poderia acres- centar à definição de FIs o fato da expressão e a fun- ção dos mesmos ser regulada pelo estágio de desen- volvimento da célula. Os FIs possuem regiões com seqüências que definem o domínio alfa-helicoidal arranjado em forma de mola e responsável pela morfologia semelhante entre todos os FIs.^4 propôs uma estrutura comum para as proteínas dos FIs que consiste de dois domínios homólogos em alfa-hélice que são separados e se es- tendem por cinco domínios variáveis globulares, o que explicaria a semelhança estrutural e a diversidade química e imunológica entre os FIs.
Revis„o: filamentos intermedi·rios.
Todas as classes de FIs possuem algumas pro- priedades comuns como, por exemplo, o fato de to- das serem, relativamente, resistentes à extração em pH 5.5-8.0 e por possuirem tendência a formar filamentos.
Tabela I: Classes de Filamentos Intermediários Classe Filamento
I citoqueratinas ácidas II citoqueratinas básicas III vimetina, desmina, GFAP e periferina IV neurofilamentos, alfa-internexina V lâminas VI nestina
Apesar da possibilidade de se produzir anticor- pos específicos para cada filamento intermediário, demonstrou-se uma proteína de 66 Kd comum a to- dos os FIs de vertebrados e invertebrados 5. Segundo a definição de LAZARIDES 2 , 1982, os FIs compreendem uma complexa classe de proteí- nas que possuem regiões de homologia na seqüência de aminoácidos, bem como extensas áreas de diver- gências entre os mesmos. A existência de áreas, es- truturalmente, homólogas poderiam também permitir a copolimerização de duas ou mais subunidades, como é o caso da vimentina e desmina, vimentina e GFAP e vimentina e várias citoqueratinas. O sequenciamento de proteínas e de cDNA tem mostrado que os FIs são membros de uma grande fa- mília de multigenes que codificam um número variá- vel de seqüências de aminoácidos. São compostos por um domínio amino terminal (“head”), um domínio central (“rod”) e um domínio carboxiterminal (“tail”)^6. A região “rod” é mais conservada e marginada por domínios carboxi e amino-terminais, com seqüência e tamanho variáveis. Uma característica do domínio “rod”, a qual acredita-se ser importante para a forma- ção de grandes estruturas pelos FIs, é a presença dis- seminada de regiões de alfa-hélice com seqüência de sete aminoácidos, que se repetem 7. Um grande número de proteínas, associadas aos FIs, tem sido identificado nos últimos anos^6. Elas for- mam um grupo heterogêneo, fisicamente associadas com os FIs, que aparentemente regulam a organização molecular do citoesqueleto.
CITOQUERATINAS
As citoqueratinas são os FIs característicos das células de origem epitelial. A célula predominante nestes epitélios contém em seu citoplasma abundantes filamentos de 80 Å (8 nm), na forma da feixes, cor- respondendo a cerca de 30 % da proteína total da cé- lula. As citoqueratinas compõem uma família de poli- peptídeos com peso molecular que varia de 40-65 Kd 8. De acordo com o tipo de tecido epitelial, podem exi- bir diferenças no número de subunidades de polipep- tídeos, bem como em seus pesos moleculares 9,10^. Dife- rentes grupos de queratinas são expressos em vários tipos de epitélio escamoso estratificado in vivo^11. Apre- sentam diferenças imunológicas e são originadas por diferentes m-RNA^12. O epitélio escamoso estratificado de órgãos internos (esôfago, língua, boca), que não formam um estrato córneo típico, não são constituí- dos por queratinas de alto peso molecular (63-65K), característicos da camada externa da pele. As citoque- ratinas exibem uma grande diversidade bioquímica e são representadas no tecido humano por 19 polipeptí- deos diferentes 13 que foram numerados de 1 a 19, de acordo com seus pesos moleculares e pontos isoelé- tricos. Estes peptídeos não são expressos, aleatoria- mente, nos epitélios, mas sim, em combinações espe- cíficas para cada tipo celular. Recentemente, identifi- cou-se uma queratina, a CK-20, com peso molecular 20 Kd, que é encontrada nos epitélios gastrointestinal e urinário, e nas células de Merkel 14. Embora as queratinas, dentro de uma mesma espécie e entre espécies diferentes, possam ser distin- guidas imunologicamente, anticorpos produzidos con- tra queratina da epiderme humana e queratina da pele de bovinos mostram reações cruzadas com uma varie- dade de células epiteliais da respectiva espécie e en- tre outras espécies, incluindo o homem, coelho, rato, camundongo, bovinos e anfíbios. Estes anticorpos, também, permitiram a demostração de FIs no cito- plasma de células epiteliais, como os hepatócitos, cé- lulas dos ácinos pancreáticos, e células mioepiteliais. Algumas exceções são relatadas como, por exemplo, as células epiteliais da íris e do cristalino que não pos- suem queratina e sim, vimentina como FI compo- nente do citoesqueleto 2. Expressão de genes que codificam queratina alterada está relacionada com crescimento maligno14,15. Alterações estruturais das queratinas, também, estão associadas a doenças genéticas da pele 16,17.
Revis„o: filamentos intermedi·rios.
dades de polipeptídeos denominados “triplet” de neu- rofilamentos, cujos pesos moleculares foram determi- nados e são, aproximadamente, de 68, 160, 210 Kd. Es- tes pesos variam um pouco, dependendo do sistema de eletroforese usado nos laboratórios. Estes peptídeos po- dem, também, ser denominados NF-L, NF-M e NF-H, res- pectivamente para baixo, médio e alto peso molecular. Outra evidência de que os neurofilamentos eram compostos por três subunidades principais de poli- peptídeos foram obtidas por WILLARD & SIMON, 1981^31 que produziram anticorpo específico para o polipep- tídeo de 210 Kd e conseguiram precipitar os três po- lipeptídeos. Anticorpos produzidos contra qualquer um dos polipetídeos mostram reação cruzada com os demais, o que revela a existência de um determi- nante antigênico comum às três unidades^31 , CZOSNEK et al 1980^32 observaram, também, que cada subunidade era traduzida por um m-RNA. Juntos, estes trabalhos evidenciaram o fato de que as subunidades não são derivados proteolíticos ou produtos de agregação.
PROTEÕNA GLIAL FIBRILAR ¡CIDA (GFAP)
Os filamentos de GFAP foram, inicialmente, isolados de placas de esclerose múltipla 33. Seu peso molecular está em torno de 50 Kd e a proteína está bem caracterizada, quimicamente. A imunohistoquí- mica tem demostrado que ela pode existir em duas formas estruturais, difusa no citoplasma ou em fila- mentos o que corresponde, respectivamente, a formas solúveis e insolúveis em água 34. Esta proteína tem sido demostrada imunoquimicamente em muitos verte- brados, incluindo mamíferos, peixes e aves^35. Da mes- ma maneira que outros FIs, a polimerilização da GFAP é regulada por fosforilação e desfoforilação do domí- nio “head”^36. A GFAP é a subunidade que compõe o princi- pal filamento intermediário, encontrado nos astrócitos do SNC e, portanto, geralmente é utilizado como ex- clusivo marcador destas células 35 , estando presente em astrócitos normais, reativos e neoplásicos. Tam- bém, foi identificada em células de Schwann, células de suporte da pineal, em tanicitos, em células da neurohipófise 37. Durante algumas fases do desenvol- vimento e processos inflamatórios a GFAP, também pode ser expressa por células de epêndima^38 , em célu- las de Müller da retina39,^ BIANCHINI et al, 1992 40 estudaram a expressão de vimentina e GFAP em cul- tura de células de Schwann, de pacientes com dife- rentes neuropatias e controles normais e concluíram
que, longe do contato com os axônios, as células de Schwann sofrem alteração no citoesqueleto, caracte- rizada pelo acúmulo de GFAP. As células da linhagem astrocítica sofrem uma marcada alteração nos FIs que as compõe durante o desenvolvimento 41. Assim, a queratina observada nas células neurectodermais de roedores é substituída por vimentina, depois da formação do tubo neural 42. Pos- teriormente, com o desenvolvimento da glia radial, a vimentina aparece como filamento intermediário im- portante, predominante ou mesmo único 43. Com o amadurecimento da célula, a vimentina e a GFAP se tornam presentes^44 e finalmente em muitos astrócitos do SNC de roedores, principalmente os astrócitos da substância cinzenta, a expressão de vimentina cessa permanecendo apenas a GFAP 45. Estudos metabólicos em cultura revelaram que a GFAP é, ativamente, sintetizada e que a sua reposição é rápida 34. Após injúria, os astrócitos apresentam um aumento do numero de FI, a glia radial, também, reage a estímulos lesivos, porém de maneira mais branda. Em outras condições patológicas como o “Scrapie” 46 , a encefalomielite murina 47 , que envolvem a prolife- ração de astrócitos (astrocitose), também observou-se um aumento da GFAP no citoplasma das células reativas (astrogliose). Recentemente, PENKY et al. (1995)^48 demons- traram que camundongos “knock-out” para GFAP apresentavam desenvolvimento e reprodução normais, e apresentavam astrogliose reativa pós-traumática, sugerindo que a GFAP não é um requerimento obri- gatório para este processo.
L¬MINAS
A lâmina nuclear é uma rede de proteínas que revestem a face nucleoplasmática da membrana nu- clear interna. Ela consiste de uma ou mais proteínas estruturais relacionadas, as lâminas, que possuem um importante papel na organização da estrutura nucle- ar 49,50. As lâminas são, reversivelmente, despolimeri- zadas durante a mitose, provavelmente devido à fosforilação enzimática 51. Todas as lâminas possuem organização estrutural protéica de outros filamentos intermediários do citoplasma 52. Nas células somáticas de mamíferos, foram isoladas três lâminas distintas, A, B e C^51 , e existem algumas evidências da existên- cia de polipeptídeos menores em aves^53. As lâminas de mamíferos diferem apenas na sua porção carboxi- terminal, então, elas podem ter origem no mesmo m-RNA e terem sofrido “splicing” diferencial 52.
GF Machado & F Figueiredo
Estudos realizados por ROBER et al.^54 , em vá- rios órgãos de embriões de camundongos, mostraram que os polipeptídeos A e C que compõem a lâmina nuclear variam de acordo com o estágio de desenvol- vimento e o tipo de tecido. DJABALI et al. 1991^55 obtiveram evidências de que a lâmina B representa um “receptor” nuclear para o domínio terminal da periferina. GLASS 1993^56 et al., determinaram um sítio de ligação das lâminas A e C à cromatina.
PERIFERINA
Em 1978, LIEM 57 et al., descreveram uma pro- teína de 60 Kd, obtida durante o isolamento de neuro- filamentos da raiz de nervos espinhais, que não cor- respondia a nenhuma das subunidades do “triplet” de neurofilamentos. Mais tarde, PORTIER et al. 1984 58 ca- racterizaram uma proteína insolúvel em triton, com 56 Kd, presente em neuroblastoma de camundongos. Esta proteína, também, foi encontrada em vários neu- rônios do simpático, mas não foi encontrada em célu- las gliais ou em homogenados do cérebro ou de algu- mas de suas regiões 58 e por isso foi denominada peri- ferina. Com base na sua capacidade de reagir cruzada- mente com anticorpos anti FIs, na presença de um único resíduo de triptofano na parte central da molé- cula, PORTIER et al.1984 58 propuseram que a perife- rina seria um novo representante da família dos FIs. GOLDSTEIN et al.1991 59 utilizaram anticor- pos anti-NF-L e anti-periferina, em reação de dupla imunofluorescência, e reportaram três populações dis- tintas de neurônios na raiz de gânglio dorsal de ratos. PARYSEK et al 1991^60 et al. demonstraram, com reação de dupla imunofluorescência em nervo ciático, que peri- ferina, NF-L, -M, -H, podem ser encontrados no mes- mo filamento. Então, alguns FIs neurais podem con- ter predominantemente proteínas NF ou periferina, en- quanto que outros podem conter as duas subunidades. MIGHELI 1993^61 et al. relataram aumento dos níveis de neurofilamentos (NF) e periferina em neurôni- os motores da medula dorsal de ratos, após transec- ção. A presença de esferóides ricos em periferina foi associada com regeneração das terminações axonais.
NESTINA
Em 1990 LENDHAL 1988^62 et al. descreveram a seqüência gênica da nestina. Segundo os critérios estabelecidos por STEINERT & ROOP 1988 6 , a nestina possui todas as características para ser classificada
como um filamento intermediário. Entretanto, como há pouca homologia com os outros FIs e ela apresen- ta seqüências de domínios “rod” L12 e L2, a nestina foi integrada em uma nova classe de FIs, a classe VI. Outras características desta classe incluem um domí- nio amino-terminal muito pequeno ou ausente e um domínio carboxi-terminal, excessivamente, longo que possui muitos peptídeos repetidos. A nestina é um dos maiores filamentos intermediários, com peso mole- cular entre 210-240 Kd. Durante o desenvolvimento do SNC, observamos grandes alterações na compo- sição da rede de filamentos intermediários. Segundo JACKSON et al. 1980 63 nos primórdios da embriogênese, as células expressam alguns tipos de citoqueratinas. A nestina é, inicialmente, coexpressa com a vimentina nas “steam cells” do SNC de ratos, e com a diferenciação, a nestina desaparece e um novo tipo de filamento intermediário da classe VI se ex- pressa, a alfa-internexina^7. A alfa-internexina persis- te e só começa a decrescer quando inicia o apareci- mento dos neurofilamentos de alto e médio peso mole- cular (NF-L e NF-M). Finalmente, o neurofilamento de alto peso molecular (NF-H) é observado nos neu- rônios e, ao mesmo tempo a GFAP é observada nos astrócitos^64. Em cérebros adultos normais de humanos, a nes- tina foi detectada em células endoteliais ocasionais 65. Por outro lado, os mesmos autores encontraram ele- vados níveis de nestina em vários tumores primários do SNC , nas células endoteliais ou em células neoplá- sicas. TOHYAMA, 1992 66 et al. detectaram a presença de nestina com imunohistoquímica em tumores neu- rectodermicos primitivos e gliomas malignos e em mui- tos outros tumores, originados no SNC. A expressão transitória da nestina nas células primitivas neuroepi- teliais, nos primórdios da embriogênese, e a sua pre- sença em neoplasias neuroepiteliais sugerem um pa- pel da nestina nos eventos celulares, que precedem o comprometimento das “steam cells” com as linhagens de células do sistema nervoso^66. Diferente do que ocorre no SNC, a nestina no sistema nervoso periférico conti- nua a se expressar, nas células de Shwann, em ratos adultos^67. Este filamento intermediário, também, é obser- vado durante o desenvolvimento embrionário da muscu- latura esquelética, junto com a vimentina e desmina 68.
ALFA-INTERNEXINA
Esta proteína foi denominada alfa-internexi- na, devido a sua provável interação com o citoes- queleto in vivo. A alfa-internexina, marcada com I 125 ,
GF Machado & F Figueiredo
olivo-ponte-cerebelar, doença de Pick 1. Estes cor- púsculos eram ricos em NF-H e existem evidências de que os mesmos se originaram de uma interfe- rência no transporte de neurofilamentos. POLAK & NOORDEN 1 observaram em lesões extensas do SNC associadas a enfartamento, à presença de neurônios com marcação positiva para NF, que apresentavam aspecto bastante incomum. Na revisão realizada por OSBORN & WEBER 1983 77 , foram citadas algumas anomalias relacionadas aos filamentos intermediários (desmina) da muscula- tura esquelética, tais como a miopatia hereditária distal, cardiomiopatias, distrofia neuromuscular congênita
hereditária, miopatia congênita. THORNELI et al.1980, 1983 107,108^ investigaram o possível envolvimento dos filamentos intermediários na patogênese da distrofia muscular. BROCKS et al. 1991^109 , também, fizeram es- tudos sobre a expressão de FIs em uma cepa de ca- mundongos distróficos (ReJ 129 (dy/dy), e obser- varam uma distribuição anormal da desmina que mos- trava-se agregada próximo ao núcleo. Também, em afecções dermatológicas existem trabalhos demonstrando padrões diferentes de ex- pressão de Fis^14 , conforme observado por TOBIN et al. 1992110 , no lúpus eritematoso, e por ISHIDA-YAMA- MOTO et al.1991^111 , na dermatite bolhosa.
MACHADO GF & F FIGUEIREDO F. Review: intermediate filaments. Medicina, Ribeirão Preto , 29:104-113, jan./mar. 1996.
ABSTRACT: Intermediate filaments (IF) has become subject of considerable interest to cell and mollecular biologists. A lot of date indicates that IF proteins constitute an extremely heterogeneous multigene family. This complexity means that IF are functionally diverse component of cells. This paper describes the majors intermediate filaments and their application in some studies linked to embriogenesis, physiology and pathology of animals tissues.
UNITERMS: Cytoskeleton. Intermediate Filaments
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Recebido para publicação em 02/08/ Aprovado para publicação em 25/01/
