Análise Automatizada de Reticulócitos: Precisão e Sensibilidade, Slides de Metodologia

Baixe Análise Automatizada de Reticulócitos: Precisão e Sensibilidade e outras Slides em PDF para Metodologia, somente na Docsity!

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

CECILIA EMICA TANAKA MIYAKE

RETICULÓCITOS: DA CONTAGEM MANUAL À CITOMETRIA DE FLUXO

CURITIBA

CECILIA EMICA TANAKA MIYAKE

RETICULÓCITOS: DA CONTAGEM MANUAL À CITOMETRIA DE FLUXO

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de Especialista em Análises Clínicas. Orientador: Samuel Ricardo Comar

CURITIBA

ABSTRACT

The reticulocyte count in peripheral blood provides information about the functional integrity of the bone marrow. It is an important factor in diagnosis, classification and monitoring of the treatment of anemia, in confirmation of the regeneration of bone marrow after chemotherapy or transplantation, and monitoring of the therapy with recombinant human erythropoietin. For the reticulocyte count, the manual technique is taken, since 1940's, as the gold standard, but with the integration of the reticulocyte analysis to global blood cell counts in automated hematology analyzers, in the mid-1990s, more accurate counts could be incorporated as part of hematological evaluation routine. In addition to substantially increase the accuracy and sensitivity of the counts, the automated analysis provides reticulocyte parameters that are not possible by manual methods. Among these parameters stand out the immature reticulocyte fraction (IRF), which has been studied as an early predictor of hematopoietic recovery after bone marrow transplantation, and hemoglobin content (CHr or Ret-He), which has been suggested as an early indication of iron deficiency, because it provides a measure of the availability of this metal to the red cells recently produced by the bone marrow. This study aimed to review the laboratory techniques for enumeration of reticulocytes and clinical application of reticulocyte counts and derived parameters.

Keywords: erythropoiesis, reticulocyte count, maturation parameters.

SUMÁRIO

• 1. INTRODUÇÃO
• 2. CONTAGEM MANUAL
• 3. CONTAGEM AUTOMATIZADA...............................................................................
• 3.1. Parâmetros de maturação e índices celulares
• 3.2. Aplicações clínicas dos parâmetros e índices fornecidos...................................
• 4. CONCLUSÕES
• REFERÊNCIAS

possui a capacidade de produção de hemoglobina, apesar da ausência do núcleo, devido à presença de RNA mensageiro no citoplasma. Por apresentar mitocôndrias também tem certa capacidade de respiração aeróbica (ZAGO, FALCÃO e PASQUINI, 2004). O tempo médio de maturação dos reticulócitos é de cerca de 4 dias, sendo que os três primeiros dias ocorrem na medula óssea e nas últimas 24 horas são liberados para a circulação sanguínea (PIERRE, 2002). No processo final de maturação, os reticulócitos perdem todas as organelas, têm o volume ligeiramente reduzido e adquirem o formato bicôncavo e a coloração citoplasmática própria dos eritrócitos maduros. Neste ponto, cessa a síntese protéica e perdem também qualquer capacidade de metabolismo aeróbico, restringindo-se a metabolização da glicose pela via de Embden-Meyerhoff (geração de ácido lático) e pelo shunt das pentoses (ZAGO, FALCÃO e PASQUINI, 2004). A produção de células vermelhas é estritamente regulada, a fim de manter um hematócrito de 40 a 45%, concentração em que a oferta de oxigênio aos tecidos é ótima (RILEY, BEN-EZRA e TIDWELL, 2001). Aproximadamente 2 milhões de reticulócitos são produzidos a cada segundo, porém a produção pode ser aumentada em cerca de 20 vezes em caso de anemia severa (AN e MOHANDAS, 2011). A contagem de reticulócitos no sangue periférico fornece informações sobre a integridade funcional da medula óssea. Em pacientes com quadro de anemia que apresentam reticulocitose, a eritropoiese na medula óssea mostra-se eficaz e responde às terapias específicas. Entretanto, em pacientes com quadro de anemia que apresentam um número diminuído de reticulócitos na circulação, ou reticulocitopenia, a eritropoiese é ineficaz e pode estar associada a outros fatores. Além de avaliar a evolução desses pacientes, a contagem de reticulócitos promove o monitoramento da regeneração da atividade medular após quimioterapia ou transplante de medula óssea (LEE et al. , 1999). A maioria das técnicas laboratoriais para contagem de reticulócitos são baseadas na detecção de RNA (reticulina) na citoplasma dos reticulócitos. Desde o final dos anos 1940 até o início dos anos 1980, a enumeração de reticulócitos foi realizada através da análise microscópica de extensões sanguíneas coradas pela

coloração supravital. O desenvolvimento de corantes fluorescentes específicos para RNA na década de 1980 possibilitou a utilização de citômetros de fluxo para contagem de reticulócitos com elevada exatidão e precisão. O desenvolvimento de citômetros de fluxo dedicados à enumeração de reticulócitos revelou-se como uma alternativa à microscopia ótica para laboratórios com alto volume de contagens de reticulócitos. A análise por citometria de fluxo proporcionou informações clínicas valiosas que não eram disponíveis pela microscopia de luz. Com a recente incorporação da citometria de fluxo nos analisadores hematológicos, a contagem de reticulócitos assim como parâmetros derivados tornaram-se parte da rotina laboratorial. Análise de reticulócitos com fluorocromo marcados com anticorpos monoclonais contra receptores de superfície de reticulócitos já estão disponíveis para estudos de investigação dos reticulócitos e doenças do erythron (RILEY et al., 2001). Este trabalho teve por objetivo revisar as técnicas laboratoriais de enumeração de reticulócitos e a aplicação clínica da contagem de reticulócitos e dos parâmetros reticulocitários derivados.

2. CONTAGEM MANUAL

A contagem manual de reticulócitos baseia-se na observação microscópica dos restos de RNA ribossomal evidenciados por colorações supravitais. Esta técnica de coloração foi descrita por Brecher em 1949 (BRECHER, 1949) e o termo supravital é utilizado, pois a técnica consiste em corar as células vivas antes de serem fixadas. O corante atravessa a membrana do eritrócito e precipita-se sobre as organelas, formando estruturas reticuladas que permitem a visualização ao microscópio óptico (BAIN, 2004; ZAGO, FALCÃO e PASQUINI, 2004). Geralmente cerca de 1000 eritrócitos são examinados em uma área bem corada e com distribuição celular adequada para que a proporção de reticulócitos seja então determinada.

Contudo, o número de células policromatófilas não deve substituir a contagem de reticulócitos. Dados de um estudo realizado por Crouch e Kaplow (1985) indicam que somente os reticulócitos nos estágios I, II e III de Heilmeyer possuem quantidade suficiente de RNA para produzir policromatofilia, quando coradas com preparações de Romanowski. Assim, a contagem de reticulócitos pode ser subestimada se baseada no número de células com policromatofilia. Apesar de ser a metodologia padrão para contagem de reticulócitos desde o final da década de 1940 (PIVA et al. , 2010), a técnica manual é bastante imprecisa e sofre interferência de vários fatores. A variabilidade inter-observadores na identificação morfológica, o tamanho da amostra (número total de células contadas), variações na coloração e a qualidade da extensão sanguínea constituem as principais fontes de imprecisão na contagem manual de reticulócitos (PIVA et al. , 2010; PIERRE, 2002; (RILEY, BEN-EZRA e TIDWELL, 2001; PIERRE, 2002; PIVA et al. , 2010). É fundamental avaliar um número suficiente de células vermelhas para assegurar que a contagem seja adequada. Piva et al. (2010) citam em seu trabalho o número de células a serem contadas para se alcançar uma imprecisão aceitável em diferentes porcentagens de reticulócitos, de acordo com as especificações do NCCLS-ICSH (Tabela 1). Em rotinas laboratoriais é aceitável um coeficiente de variação de 10%, sendo o tamanho mínimo da amostra de eritrócitos a ser analisada de 1000 células (PIVA et al. , 2010). Para facilitar a contagem e melhorar a precisão da análise manual de reticulócitos, é recomendada a utilização da ocular de Miller. Este instrumento delimita a área de contagem em um quadrado grande, no qual está contido um quadrado pequeno que tem um nono do tamanho do quadrado maior (Figura 1). Os reticulócitos são contados, em cada campo, no quadrado grande, enquanto que os eritrócitos são contados no quadrado pequeno, totalizando vinte campos consecutivos (BAIN, 2004). Utilizando a ocular de Miller o número de eritrócitos contados pode-se reduzir a um nono da quantidade listada na tabela 1. Quando este instrumento é utilizado a porcentagem de reticulócitos é calculada da seguinte forma:

reticulócitos em 20 quadrados grandes x 100 eritrócitos em 20 quadrados pequenos x 9

Tabela 1. Número de eritrócitos a serem contados para se obter uma imprecisão aceitável em várias porcentagens de reticulócitos (H44-A2 citado por Piva et al. , 2010).

Reticulócitos (%)

Número de eritrócitos a serem contados para um coeficiente de variação de 5%

Número de eritrócitos a serem contados para um coeficiente de variação de 10% 1 39.600 9900 2 19.600 4900 5 7.600 1900 10 3.600 900 20 1.600 400 50 400 100

Em geral, a imprecisão é inversamente proporcional ao número de eritrócitos contados e a porcentagem de reticulócitos presentes na amostra. O método descrito no documento H44-A2 do NCCLS-ICSH para contagem manual de reticulócitos tem sido recomendado como o método de referência para avaliar o desempenho analítico de metodologias automatizadas (PIERRE, 2002; PIVA et al. , 2010).

Figura 1. Aparência da ocular de Miller, recomendada para a contagem de reticulócitos.

A contagem de reticulócitos é geralmente relatada na forma de porcentagem, ou seja, reticulócitos pelo total de hemácias examinadas. A porcentagem média normal da contagem de reticulócitos pela microscopia ótica é de 1,0%-1,5%, com 3% sendo o limite superior do normal. A contagem relativa de reticulócitos é

eritropoietina, a contagem de reticulócitos será inadequadamente baixa e o índice de produção de reticulócitos será incorreto.

3. CONTAGEM AUTOMATIZADA

A contagem automatizada de reticulócitos, utilizando corantes fluorescentes RNA-específicos, tornou-se possível na década de 1980 com o desenvolvimento do citômetro de fluxo. Posteriormente, o desenvolvimento de citômetros de fluxo dedicados a contagem de reticulócitos proporcionou uma alternativa à microscopia para laboratórios com um grande volume de amostras (RILEY, BEN-EZRA e TIDWELL, 2001). Em meados da década de 1990, com a integração da análise de reticulócitos às contagens globais de células sanguíneas em analisadores hematológicos automatizados, contagens mais precisas puderam ser incorporadas como parte da rotina de avaliação hematológica (PIVA et al. , 2010). Métodos totalmente automatizados possuem a vantagem de aumentar substancialmente a precisão e sensibilidade das contagens, uma vez que o número de células analisadas é muito maior se comparado ao método manual (cerca de 10 vezes mais), eliminar fontes de imprecisão inerentes à metodologia manual, além de diminuir o tempo de execução. A maior sensibilidade e precisão tornaram possível fornecer contagens confiáveis mesmo em amostras com uma porcentagem muito pequena de reticulócitos, o que não era possível pelo método manual (BUTTARELLO et al ., 2001; PIVA et al. , 2010). A primeira tecnologia disponível para contagem de reticulócitos em analisadores hematológicos foi desenvolvida pela Beckman Coulter Inc. com os equipamentos STKS®, MAXM® e MAXM A/L (RILEY, BEN-EZRA e TIDWELL, 2001). Essas primeiras gerações de analisadores eram semi-automatizadas e utilizavam como corante o azul de metileno novo. Atualmente inúmeros analisadores hematológicos totalmente automatizados estão disponíveis no mercado e, além da contagem absoluta e percentual de reticulócitos, fornecem índices celulares e parâmetros reticulocitários como conteúdo e concentração de hemoglobina, volume,

variação de tamanho e grau de maturação. A tabela 2 fornece detalhes sobre os analisadores automatizados de última geração, totalmente automatizados, e os parâmetros fornecidos.

Tabela 2. Estado da arte das capacidades analíticas de reticulócitos para a maioria dos analisadores hematológicos. Princípios de metodologia, técnicas e parâmetros fornecidos (adaptado de Piva et al ., 2010).

Fabricante Equipamento Método Corante reticulocitáriosParâmetrosfornecidos

Beckman Coulter Inc. UniCel DxH 800 Citometria de fluxo –análise digital utilizando diferentesângulos de detecção de dispersão luminosa, impedância,radiofrequência

Azul de metileno novo IRF, MRV, HLR,RDWR-CV, RDWR- SD, MSCV, LHD, RSF,MAF

Coulter LH 700 series(780, 785, 750) Dispersão luminosa,impedância e condutividade

Azul de metileno novo IRF, MRV, RDWR-CV,RDWR-SD, HLR, MSCV, RSF, MAF Coulter LH 500 Dispersão luminosa,impedância e condutividade

Azul de metileno novo IRF, MRV, MSCV

Abbott CELL DYN Sapphire Detecção de fluorescência

Cyanine (Sybr II) IRF Horiba ABX Pentra DX 120 Tecnologia de impedância e detecçãode fluorescência

Thiazole orange IRF, MRV, RETH%, RETM%, RETL%,IMM%, MFI%, CRC% Siemens ADVIA 2120 Absorbância edispersão luminosa Oxazine 750 IRF, MCVr, CHr,CHCMr, RDWr, HDWr, CHDWr, H-RET%, M-RET%, L-RET% Sysmex XE 5000, XT 4000i Fluorescência edispersão luminosa^ Polymethine^ IRF, Ret-He, RBC-He,Micro-R, Macro-R, LScRBC, HScRBC, DELTA-He, RPI XE 2100, XT 2000i Fluorescência e dispersão luminosa

Polymethine IRF, Ret-He, RPI

IRF: fração de reticulócitos imaturos; MRV: volume reticulocitário médio; HLR: reticulócitos de alta dispersão luminosa; RDWR-CV,SD: amplitude de distribuição dos reticulócitos – coeficiente de variação,desvio padrão; MSCV: volume médio das células vermelhas esferizadas; LHD: baixa densidade de hemoglobina; MAF: fator de anemia microcítica; RETH, RETM, RETL: reticulócitos de alta, média e baixa fluorescência; IMM: reticulócitos imaturos; MFI: índice de fluorescência média; CRC: contagem de reticulócitos corrigida; H-RET, M-RET, L-RET: reticulócitos de alta, média e baixa absorbância; Ret-He: equivalente de hemoglobina dos reticulócitos; RBC-He: equivalente de hemoglobina das células vermelhas; MicroR: fração de células vermelhas microcíticas; MacroR: fração de células vermelhas macrocíticas; LScRBC: fração de células vermelhas de baixa dispersão; HScRBC: fração de células vermelhas de alta dispersão; DELTA-He: equivalente de hemoglobina delta; RPI: índice de produção de reticulócitos.

separar os reticulócitos dos eritrócitos e demais células. Todos estes fatores contribuem para a necessidade de se estabelecer intervalos de referência método- específicos (BUTTARELLO et al ., 2001). A dificuldade de se obter um material de calibração que seja estável ao longo do tempo e que possa ser utilizado por todos os métodos também contribui para a variação dos resultados fornecidos pelas diferentes metodologias disponíveis comercialmente. A utilização de sangue fresco como calibrador, material ideal para a contagem de reticulócitos, possui como limitações: a falta de estabilidade, pois os reticulócitos continuam no processo de maturação, alterando sua concentração ao longo do tempo; a falta de um método de referência universalmente aceito para medida da concentração de reticulócitos; e os procedimentos de calibração que são estritamente dependentes do fabricante e não podem ser facilmente modificados pelo usuário (BUTTARELLO et al ., 2001). Com base nestes dados, compreende-se que seja obrigatória a utilização da mesma metodologia em certas situações clínicas em que a contagem de reticulócitos é utilizada para monitorar pacientes com severa reticulopenia, como nos casos de aplasia medular ou monitoramento de reposta eritropoiética precoce. Nestas situações é crucial um baixo nível de imprecisão e uma metodologia bastante sensível.

3.1. Parâmetros de maturação e índices celulares

Heilmeyer e Westhaeuser propuseram uma classificação dos estágios de maturação de reticulócitos baseada no padrão de coloração supravital, que reflete a quantidade de RNA celular e, portanto, o estágio maturativo. Porém, na prática laboratorial, esta classificação dificilmente é utilizada, devido ao elevado grau de subjetividade na identificação e separação nos graus de maturação propostos e a baixa precisão e reprodutibilidade dos resultados (PIERRE, 2002). Com a automação na contagem de reticulócitos e a disponibilidade de novos corantes e fluorocromos, a separação em graus de maturação se tornou muito mais

precisa e reprodutível. A avaliação do estágio de maturação é baseada na intensidade de fluorescência emitida ou absorção de luz pelo reticulócito, e/ou dispersão luminosa, que é proporcional ao conteúdo de RNA. Apesar das diferentes metodologias, existe uma concordância na classificação do grau de maturação em três estágios: reticulócitos de alta, média e baixa imaturidade (RILEY, BEN-EZRA e TIDWELL, 2001; PIERRE, 2002; PIVA et al. , 2010). A fração de reticulócitos imaturos (IRF) é um termo descritivo recomendado no documento H44-A para substituir o termo anteriormente utilizado, índice de maturação de reticulócitos (RMI). O IRF é definido como a soma das populações de alta e média fluorescência e tem se tornado o termo internacionalmente aceito para indicar a fração mínima de reticulócitos imaturos (PIVA et al. , 2010). Alguns equipamentos fornecem medidas dos índices celulares reticulocitários, entre os principais estão o volume reticulocitário médio (MCVr), variação de tamanho (RDWr) e conteúdo de hemoglobina (CHr ou Ret-He). Dependendo do equipamento utilizado, o conteúdo de hemoglobina do reticulócito recebe denominações diferentes. O CHr (conteúdo médio de hemoglobina do reticulócito) é fornecido pelos analisadores hematológicos ADVIA 120 e 2120 ( Siemens ), e foi aprovado em 1997 pelo FDA ( Food and Drug Administration ) para uso clínico nos Estados Unidos. A partir de 2005, um parâmetro equivalente ao CHr passou a estar disponível, o Ret-He (equivalente de hemoglobina dos reticulócitos) que é fornecido pelos equipamentos XE-2100 e XE-5000 ( Sysmex Corporation, Japão ) (BRUGNARA, SCHILLER e MORAN, 2006). Um estudo realizado por Brugnara, Schiller e Moran (2006) comparou os resultados das determinações de conteúdo de hemoglobina dos reticulócitos fornecidos pelos equipamentos ADVIA 2120 e Sysmex XE 2100, em adultos e crianças, obtendo um bom nível de concordância entre estes parâmetros fornecidos pelos diferentes analisadores (r^2 =0,88).

3.2. Aplicações clínicas dos parâmetros e índices fornecidos

Gonçalo et al. (2011) quando compararam o IRF e a fração de plaquetas imaturas (IPR) com as contagens de neutrófilos e plaquetas.

3.2.2. Diagnóstico precoce de deficiência de ferro

A anemia por deficiência de ferro é uma das doenças mais comuns do mundo e na maioria dos casos é diagnostica pela presença de anemia microcítica hipocrômica e evidência bioquímica de depleção dos estoques de ferro mensurada por marcadores bioquímicos clássicos como ferro sérico, saturação de transferrina e ferritina. Porém, em algumas condições clínicas estes marcadores clássicos podem não fornecer uma evidência precoce ou não se alterar rápido o suficiente para refletir estados transitórios de deficiência de ferro (BRUGNARA, 2003). Estudos recentes sugerem que a determinação do conteúdo de hemoglobina do reticulócito pode fornecer um indicativo precoce de deficiência de ferro, por proporcionar uma medida da disponibilidade deste metal para as células vermelhas recentemente produzidas pela medula óssea (MAST et al. , 2002). No processo de maturação do reticulócito, a concentração de hemoglobina aumenta gradualmente, enquanto o volume celular diminui. Assim, o CHr, produto da concentração de hemoglobina e volume celular, é um parâmetro mais estável do que a concentração reticulocitária de hemoglobina para avaliar a disponibilidade de ferro (MAST et al. , 2002). Mast et al. (2002) analisaram os resultados séricos de CHr, ferritina, saturação de transferrina e VCM de 78 pacientes submetidos a avaliação de medula óssea. Dentre estes testes, excluindo-se pacientes com VCM acima de 100 fL e portadores de distúrbios de série vermelha, o CHr apresentou a maior sensibilidade e especificidade global para predizer a ausência de reservas de ferro medular. A utilidade do CHr também é sugerida como um parâmetro de controle da terapia com eritropoetina humana recombinante (r-HuEPO), utilizada principalmente em pacientes com doença renal avançada (FISHBANE et al ., 1997; BRUGNARA, 2003). O aumento na eritropoiese, induzido pela administração de r-HuEPO, não

consegue ser sustentado pela disponibilidade normal de ferro e uma eritropoiese prejudicada pela diminuição da incorporação de ferro à hemoglobina, chamada deficiência funcional de ferro, pode se desenvolver, necessitando de alteração na dose da eritropoetina ou administração de suplementos de ferro intravenoso (BRUGNARA, 2003). O desenvolvimento desta deficiência de ferro é acompanhada por alterações precoces e significativas no CHr, bem como na resposta a terapia com ferro intravenoso (FISHBANE et al ., 1997; BRUGNARA, 2003).

4. CONCLUSÕES

A contagem de reticulócitos foi realizada durante várias décadas por microscopia de luz, com o uso de um corante supravital (azul de metileno novo), que se liga ao RNA dos reticulócitos. No entanto, a exatidão e a precisão deste ensaio são bastante comprometidas devido ao seu caráter subjetivo e pelo número limitado de células (200-1.000) que são contadas normalmente pelos laboratoristas em um período de tempo razoável. Em contrapartida, técnicas automatizadas de enumeração de reticulócitos são mais precisas, exatas e de baixo custo, uma vez que 30.000 ou mais células podem ser avaliadas com precisão em um período curto de tempo. A automação na contagem de reticulócitos trouxe avanços inegáveis para a avaliação da eritropoiese, na medida em que aumenta a reprodutibilidade e precisão e diminui consideravelmente o tempo de análise para o exame solicitado. A tendência recente de incorporar a análise de reticulócitos nos analisadores hematológicos de rotina fará com que a contagem automatizada de reticulócitos seja cada vez mais comum. No entanto, uma vez que os resultados de análise de reticulócitos automatizados são influenciados pela metodologia analítica, sensibilidade do corante em corar RNA e a capacidade de discriminação entre reticulócitos e eritrócitos do software empregado, intervalos de referência método específicos são necessários. Uma padronização entre as metodologias disponíveis facilitaria a interpretação dos resultados e melhoraria a confiabilidade do exame, principalmente em condições clínicas específicas, como na aplasia medular e