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Microbiologia Clínica:
Diagnóstico e Resistência
Antimicrobiana
Legislação e Padronização de Testes de
Sensibilidade a Antimicrobianos
A legislação foi criada com o objetivo de padronizar a interpretação dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos em laboratórios clínicos e de pesquisa. Visa fortalecer a rede laboratorial, tornando essencial a implementação de instrumentos para padronizar a determinação dos perfis de sensibilidade. A legislação busca melhorar a qualidade dos resultados dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos in vitro, para aprimorar a vigilância epidemiológica e clínica. Também visa orientar a prescrição de medicamentos e as medidas de prevenção e controle para impedir a disseminação de doenças infectocontagiosas. As resoluções do Grupo de Trabalho para análise de Metodologias para Testes de Sensibilidade usadas em Laboratórios de Microbiologia (GT-TSA) foram consideradas na elaboração da legislação.
Redefinição das Categorias de Sensibilidade
A categoria "Sensível, dose padrão" (S) é definida quando há alta probabilidade de sucesso terapêutico utilizando a dosagem padrão do agente. A exposição ao antimicrobiano depende de fatores como via de administração, dose, intervalo entre doses, tempo de infusão, distribuição, metabolismo e excreção.
A categoria "Sensível, aumentando exposição" (I) é definida quando há alta probabilidade de sucesso terapêutico porque a exposição foi aumentada ajustando-se o regime de dosagem ou sua concentração no local de infecção. A exposição ao antimicrobiano depende de fatores como via de administração, dose, intervalo entre doses, tempo de infusão, distribuição, metabolismo e excreção.
Contexto da Resistência Antimicrobiana
Na União Europeia, aproximadamente 25.000 pacientes morrem anualmente devido a infecções causadas por bactérias multirresistentes, com custos estimados em cerca de 1,5 bilhão de euros por ano. Existe uma diretriz nacional para a elaboração de programas de gerenciamento do uso de antimicrobianos em serviços de saúde.
Diagnóstico Microbiológico de Infecções do
Trato Respiratório
Faringite
A faringite é a principal infecção do trato respiratório superior, com etiologia predominantemente viral (90%), seguida por Streptococcus e Corynebacterium. Os vírus mais comuns são Adenovirus, Epstein-Barr virus e Coxsackiae, especialmente em crianças. A microbiota normal do trato respiratório superior inclui Streptococcus α-hemolítico (S. mutans e S. salivarius), espécies de Neisseria, membros da família Enterobacteriacea, S. pneumoniae, Staphylococcus coagulase negativa, Haemophilus hemolyticus e leveduras, incluindo Candida albicans.
Coleta e Transporte de Amostras de Orofaringe
Para a coleta, com auxílio de um abaixador de língua, pressionar e rolar um "swab" sobre as tonsilas e faringe posterior, principalmente na área edemaciada adjacente aos pontos com pus ou placas, evitando tocar na língua e/ou bochechas. O meio de transporte específico recomendado é o Meio de Cary-Blair. A amostra deve ser encaminhada ao laboratório em até 12 horas em temperatura ambiente (20 a 25°C).
Procedimentos Laboratoriais para Amostras de Orofaringe
Em caso de suspeita de Corynebacterium, realizar a coloração de Albert- Laybourn e semear em agar sangue acrescido de telurito de potássio ou Loeffler. Rolar o "swab" em uma pequena área da placa de meio de cultura e posteriormente estriar com auxílio de alça bacteriológica em 3 posições. Colônias β-hemolíticas levantam suspeita de Streptococcus do grupo A. Apenas dar seqüência ao teste para os casos de pesquisa de portadores de S. pneumoniae. Também é importante realizar a detecção de portadores de S. aureus e N. meningitidis.
Classificação de Estreptococos
Os estreptococos são classificados de acordo com o padrão de hemólise (α, β e γ) e a classificação de Lancefield, que se baseia em antígenos de superfície nos estreptococos β-hemolíticos. Rebecca C. Lancefield (1895-1981) desenvolveu essa classificação.
Provas de Identificação de Estreptococos
A prova da catalase verifica a presença da enzima catalase, que decompõe a H2O2 em água e O2. Para realizar o teste, retirar com alça bacteriológica uma colônia suspeita, colocar sobre uma lâmina de vidro, adicionar 1 gota de H2O2, homogeneizar e observar a formação de bolhas.
O teste de susceptibilidade à bacitracina verifica a susceptibilidade à bacitracina. Para realizar o teste, retirar com alça bacteriológica uma
Identificação de Patógenos Específicos
Streptococcus pneumoniae
A faixa etária mais acometida por infecção pneumocócica são crianças com idade inferior a 2 anos e idosos com idade superior a 65 anos. A susceptibilidade à optoquina é definida por um halo de inibição ≥ 14mm. O teste de bile-solubilidade verifica se as bactérias são solúveis na presença de sais biliares, em especial o desoxicolato de sódio. A reação de Quellung é utilizada para tipagem sorológica, identificando o entumescimento capsular.
A vacina polissacarídica engloba 23 sorotipos capsulares distintos, cobrindo cerca de 80% das infecções pneumocócicas, mas possui fraca memória imunológica por ser um antígeno timo-independente. A vacina 7-valente é uma vacina conjugada, com conjugação de polissacárides capsulares + proteína carreadora, englobando 7 sorotipos distintos + CRM197, apresentando alta possibilidade de memória imunológica.
Para identificação, retirar com alça bacteriológica uma colônia suspeita, semear em meio de agar sangue e adicionar um disco de papel de filtro impregnado com optoquina, incubar em microaerofilia e observar o halo de inibição (≥ 14mm). O teste de bile-solubilidade é utilizado para diferenciar S. pneumoniae (sensível na presença de sais biliares).
Staphylococcus aureus
É a principal espécie envolvida em infecções humanas, colonizando a nasofaringe de 20-40% dos adultos. Apesar de fazer parte da flora normal, pode produzir infecções oportunistas. Fatores que predispõem a infecção por S. aureus incluem lesões cutâneas (queimaduras) e a presença de corpos estranhos (cateteres e próteses).
Infecções causadas por S. aureus incluem cutâneas (foliculite, impetigo, terçol, furúnculos e carbúnculos), broncopneumonia adquirida em comunidade (com pneumonia viral como fator predisponente), bacteremia (endocardite, osteomielite), meningite e intoxicação alimentar (enterotoxinas estafilocócicas).
As enterotoxinas (A - G) são termoestáveis e resistentes ao suco gástrico, provocando vômitos e diarréia. A TSST-1 está associada à Síndrome do choque tóxico (1978), caracterizada por febre, hipotensão, eritrodermia e vômito. As exotoxinas atuam como superantígenos.
MRSA (Staphylococcus aureus resistente à meticilina) são cepas multi- resistentes com a presença do gene mecA. O teste de susceptibilidade à meticilina é realizado com discos de oxacilina. VISA (Staphylococcus aureus com níveis intermediários de resistência à vancomicina) também são relevantes.
O diagnóstico laboratorial inclui: meio de semeadura primária (Agar sangue), condições de incubação (37°C / aerobiose / 18-24 horas), teste da catalase (catalase positiva), teste da coagulase (coagulase positiva) e Agar
Manitol salgado (meio seletivo e diferencial). O teste de oxidação- fermentação da glicose e o teste de resistência à bacitracina auxiliam na diferenciação dos gêneros Staphylococcus (R) e Micrococcus (S).
O teste de coagulase verifica a habilidade do microrganismo em coagular o plasma pela ação da enzima coagulase. A identificação automatizada também é utilizada.
O teste da coagulase em lâmina (Staph-Test ou plasma de coelho) detecta a coagulase ligada (Fator Clumping). O teste da coagulase em tubo (plasma de coelho) detecta a coagulase livre.
Mycobacterium tuberculosis
Fatores envolvidos na patogenia incluem o advento da AIDS, fatores de higiene precários, desnutrição e stress. Pode atingir vários órgãos, mas principalmente o pulmão. É expelido durante a tosse, sob a forma de aerossóis, sendo inalado por indivíduos suscetíveis, causando a infecção primária (alojamento nos alvéolos pulmonares).
A evolução pode ser: a) infecção latente (cerca de 95% dos casos), assintomática e PPD positivo; b) tuberculose crônica (cerca de 5% dos casos), em indivíduos com fatores de risco. A tuberculose pulmonar é um processo inflamatório de evolução lenta, caracterizado por inflamação crônica, necrose e formação de cavidades no tecido pulmonar.
Identificação de Patógenos e Procedimentos
Laboratoriais
Identificação de Micobactérias
A identificação de micobactérias envolve a coloração de Ziehl-Neelsen, que identifica bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). A técnica de homogeneização do escarro é utilizada para eliminar grumos. O meio de cultura de Lowenstein-Jensen, sólido e à base de ovos, sais, glicerol e fécula de batata, com ou sem antimicrobianos, permite o desenvolvimento de pigmento pela bactéria. Os testes de identificação consideram o tempo e temperatura de crescimento, produção de pigmento, morfologia de colônias e provas bioquímicas.
Identificação de Patógenos em Casos de Diarreia e
Disenteria
A disenteria pode ser causada por E. coli enterotoxigênica (ETEC), que produz toxinas termolábeis (LT-I e LT-II) e termoestáveis (STa e STb), além de toxinas do tipo I ou tipo A-B. A E. coli enterohemorrágica (EHEC) causa colite hemorrágica e é um dos principais agentes de gastrenterites.
Salmonella sp. inclui as espécies S. enterica e S. bongori, divididas em subespécies e sorotipos (aproximadamente 2500). S. typhi e S. paratyphi
As amostras são coletadas por punção venosa. Em adultos, coletam-se 2 a 3 amostras; em crianças, 2 amostras. O volume de sangue é de 8 a 10 mL por punção em cada frasco para adultos e 0,5 a 1mL por punção em frascos pediátricos para recém-nascidos.
Protocolo de Coleta de Hemocultura
Em casos de sepse, osteomielite, meningite, artrite, pneumonia e pielonefrite, coletar 2 a 3 amostras, sem intervalo e intercalar os sítios de punção. Em casos de febre de origem desconhecida e endocardite, coletar 2 a 3 amostras com 15 a 20 minutos de intervalo entre as coletas. Em pacientes em uso de antibióticos, preferencialmente utilizar frascos com inibidores e coletar antes da próxima dose.
Frascos de Coleta para Hemocultura
Metodologias automatizadas utilizam meios de cultura com aditivos para neutralizar e inativar agentes antimicrobianos. Exemplos incluem Bactec (Becton-Dickinson) e BacT-Alert (Bio-Meriex).
Metodologias Automatizadas para Hemocultura
As metodologias automatizadas geralmente têm um protocolo de 5 dias de incubação. Bactec e BacT-Alert são baseados na detecção de CO2 produzido durante o metabolismo microbiano. O ESP System é baseado na detecção de consumo e produção de gases.
Procedimento para Hemocultura Automatizada
Após a coleta, recolocar o frasco no aparelho.
Microrganismos Comuns em Diferentes Infecções
Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae são relevantes em infecções das vias aéreas inferiores. Streptococcus agalactiae e Neisseria meningitidis são relevantes em infecções do sistema nervoso central. Haemophilus influenzae e Enterobacteriacea também são relevantes em infecções das vias aéreas inferiores, assim como BGNNF.
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae é encontrada normalmente no intestino e causa pneumonia lobar. Também está associada a infecções do aparelho urinário, endocardite e vários tipos de infecções pós-cirúrgicas e sepse. K. pneumoniae é responsável por cerca de 10% das infecções hospitalares. A K. pneumoniae produtora de carbapenemase (KPC) é uma bactéria multirresistente com alta taxa de morbimortalidade. Carbapenêmicos são antibióticos de última linha.
Detecção de Bactérias Produtoras de Carbapenemase
(KPC)
Embora análises genotípicas (métodos moleculares) possam ser utilizadas, o padrão-ouro para o diagnóstico de bactérias multirresistentes é a realização do antibiograma.
Etapas para Detecção de KPC
A triagem fenotípica inicial utiliza um disco de meropenem ou ertapenem para identificar possíveis bactérias produtoras de carbapenemase. A confirmação da produção de carbapenemase pode ser feita através do Teste de Hodge, que avalia a capacidade da bactéria de inativar o carbapenêmico, formando uma zona de crescimento em forma de 'hodge'; Blue Carba, que utiliza um meio de cultura que permite a visualização da produção da carbapenemase por meio de uma mudança de cor; e Carba NP, um teste que também visa confirmar a produção de carbapenemase através da detecção de sua atividade.
Normas de Controle de Infecção
É fundamental enfatizar a importância da higienização das mãos para todos os profissionais de saúde, visitantes e acompanhantes; reforçar a aplicação de precauções de contato para profissionais de saúde, visitantes e acompanhantes; enfatizar as medidas gerais de higiene do ambiente; manter o sistema de vigilância epidemiológica das infecções relacionadas à assistência à saúde que permite o monitoramento adequado de patógenos multirresistentes; e fortalecer a política institucional de uso racional de antimicrobianos.
