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INTRODUÇÃO
FASES DO ENSAIO
Requisição Coleta e identificação da amostra Transporte e armazenamento Erros mais comuns: ✓ Erros no pedido médico; ✓ Falta de identificação da amostra; ✓ Origem ou tipo de amostra não identificada; ✓ Swab seco; ✓ Swab único para múltiplas amostras. Processamento e semeadura da amostra Identificação do patógeno Liberação do resultado
BACTÉRIAS
FORMAS E ARRANJOS
Diplobacilos Estreptobacilos Bacilos Isolados
COLORAÇÃO DE GRAM
1º. Corante primário - violeta de cristal : cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula. 2º. Mordente - solução de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da célula. 3º. Agente Descolorante – álcool, acetona ou ambos: solvente lipídico. 4º. Contrastante – safranina ou fucsina básica: cora o citoplasma de vermelho.
Presença de cocos gram
positivos (corados em roxo)
Presença de bacilos gram
negativos (corados em
vermelho)
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
1 min 1 min Até descorar (10-15s) Chama Bico de Bunsen (3x) 30 seg
COLORAÇÃO
1º. Cobrir as lâminas com fucsina filtrada. 2º. Montar em uma pinça um chumaço de algodão com álcool e acender com fogo. Passar sob a lâmina até emitir vapores visíveis (não ferver o corante). 3º. Marcar 5 minutos após a emissão de vapores. 4º. Inclinar a lâmina em um fio de água para escorrer a fucsina. 5º. Cobrir a lâmina com solução descolorante de álcool-ácido a 3% e deixar por 1 minuto. 6º. Retirar a solução em um fio de água. 7º. Cobrir a lâmina com azul de metileno, esperar 30 segundos e lavar em um fio de água, após isso, deixar a lâmina secando.
MEIOS DE CULTURA
CARACTERÍSTICAS
Não há um meio de cultura universal. Para compor um meio de cultura, é necessário conhecer a fisiopatologia da bactéria. Os meios sólidos imobilizam as células, permitindo-lhes crescer e formar massas isoladas visíveis denominadas colônias. Os meios líquidos (caldos) permitem a recuperação de bactérias após o congelamento, liofilização, etc.
COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
Meios sintéticos Meios complexos Na prática, a maioria dos meios é complexo Sólido Líquido Semi-Sólido Não seletivos Seletivos Diferenciais Transporte Identificação bioquímica Cromogênicos Laminocultivo
HEMOCULTURA
Caldo com peptonas suplementado Maioria contém anticoagulante polianetosulfonato Incubação: 7 dias Antissepsia da pele é muito importante Coletas inadequadas podem levar ao isolamento de microrganismos contaminantes, não relacionados com o processo infeccioso Fazer a coleta na ascensão do pico febril e antes da antibioticoterapia Enviar ao laboratório em 30 minutos Incubação em estufa bacteriológica a 35ºC
Crescimento semelhante a cacho de uvas Aeróbios ou anaeróbios facultativos
PROVAS DE DIFERENCIAÇÃO
Staphylococcus aureus
Colônias douradas Única que produz a enzima coagulase Faz parte da microbiota normal Sensíveis a altas temperaturas Pode sobreviver por longos períodos em superfícies secas Transmissão por contato direto ou roupas contaminadas Médicos: técnicas adequadas de lavagem de mãos. Infecções cutâneas → infecções sistêmicas Toxinas estafilocócicas: ✓ Síndrome Estafilocócica da Pele Escaldada ✓ Síndrome do Choque Tóxico ✓ Intoxicações Alimentares
S. epidermidis e saprophyticus
Coagulase negativa Cocos gram positivos Dispostos aos pares Anaeróbios facultativos Catalase positiva Presença de cápsula Infecções urinárias Dispositivos permanentes (válvulas cardíacas, cateteres, marcapassos, etc.) Bacteremia em pacientes imunocomprometidos Osteomielite
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Meio de cultura: ágar sangue Staphylococcus aureus: cresce no meio ágar manitol Crescem rapidamente em meios de cultura de não seletivos, tanto em condições aeróbias quanto anaeróbias As colônias de S. aureus são acinzentadas a amarelo dourado intenso As colônias de S. epidermidis apresentam coloração de cinza a branca Prova da catalase: formação de bolhas
Prova da coagulase: pode ser feita em lâmina (10-15 segundos) ou em tubo (4 horas); aglutinação → teste positivo; diferencia S. aureus de S. epidermidis e saprophyticus Prova de sensibilidade a novabiocina: feito nos que são coagulase negativa; S. saprophyticus é resistente; realizado a partir de um disco em uma placa.
Streptococcus
CARACTERÍSTICAS
Cocos gram positivos Anaeróbios facultativos Exigências nutricionais complexas (meios enriquecidos no sangue) Fermentação de carboidratos → ácido lático Catalase negativa Parte da microbiota oral Grande transmissão oral Também estão no intestino, trato respiratório e na pele São facilmente extinguidas quando detergentes são utilizados na assepsia Escarlatina Febre reumática Glomerulonefrite Pneumonia pneumocócica
HEMÓLISE
Hemólise incompleta Perda parcial de hemoglobina pelas hemácias, ocorrendo uma zona cinza-esverdeada Ex: Streptococcus pneumoniae Hemólise completa Lise completa das hemácias Ocorre uma zona transparente Ex: Streptococcus pyogenes ou agalactiae. Ausência de hemólise Não causam modificação no ágar sangue Ex: Enterococcus ou não enterococcus
Streptococcus pyogenes
Patógeno mais comum Causa mais comum da faringite bacteriana Cocos esféricos Crescimento ótimo em ágar sangue β-hemólise
PROVAS BIOQUÍMICAS
Com poucas exceções, todos os membros de enterobactérias demonstram as seguintes características: ✓ Fermentação da glicose ✓ Citocromo oxidase negativa ✓ Redução de nitrato a nitrito Produto da degradação do aminoácido triptofano Meio de prova: adicionar reativo de Erlich ou Kovac e observar aparecimento de anel vermelho Meio vertido em tubo de ensaio Em uma série de tubos, semear primeiro o ágar citrato Incubação de 24 horas, aparecimento de cor azul – resultado positivo para utilização de citrato Movimentação por flagelos Objetivo: detectar zona difusa de crescimento a partir da linha de inoculação Shigella e Klebsiella: imóveis
Neisseria
Cocos gram negativas Diplococos Aeróbicos e imóveis Oxidase positiva Maioria produz catalase Fermentação da glicose, lactose, sacarose e frutose Crescimento em ágar chocolate a 22ºC Crescimento em ágar nutriente a 35ºC Oxidase Catalase Motilidade Epidemiologia: ✓ Homem: único hospedeiro natural ✓ Transmissão pessoa a pessoa ✓ Incidência aumentada em crianças menores de 5 anos Diagnóstico laboratorial: ✓ Ágar sangue e LCR ✓ Método alternativo: hemocultura Fisiologia e Estrutura: ✓ Microrganismo fastidioso ✓ Necessita de meios de cultura complexos Diagnóstico Laboratorial: ✓ Microscopia: coloração de Gram e observação de diplococos gram negativos; resultados confirmados por cultura. ✓ Cultura: meio não seletivo (ágar chocolate) e meio
seletivo (ágar Thayer- Martin modificado)
BGN NÃO FERMENTADORES
Oxidase, catalase, motilidade, citrato, ureia, ágar esculina, TSI, etc. Suspeita quando apresenta 1 ou mais das seguintes características: ✓ Ausência de evidências de fermentação de glicose: pH não cai o suficiente para ter viragem de cor; após a incubação: fundo alcalino, característica de Pseudomonas aeruginosa ✓ Reação positiva da citocromo oxidase: a reação de cor é visível após 10 segundos; o desenvolvimento da cor azul indica atividade positiva. ✓ Possível não crescimento em Ágar MacConkey: cresce em ágar sangue Elaborado para estudo de não fermentadores Procedimento: ✓ São necessários dois tubos ✓ Após semear, cobrir um dos tubos com óleo mineral ou parafina e deixar o outro exposto ao ar ✓ Incubar a 35ºC ✓ Examinar diariamente durante vários dias Interpretação: ✓ Produção ácido: cor amarela
COPROCULTURA
CARACTERÍSTICAS
Salmonella, Shigella e alguns sorotipos de E. coli. Amostra ideal é coletada em um quadro diarreico Cary Blair (enviar em até 72 horas após a coleta) Pode ser mantido em temperatura ambiente ou refrigerado
PROCESSAMENTO E SEMEADURA
O uso de caldos de enriquecimento favorece o isolamento de patógenos
Procedimentos adequados de coleta para evitar o isolamento de um “falso” agente etiológico Gotejamento: tubos estéreis com tampa de rosca (de boca estreita preferencialmente) Manobra dos 3 tubos: ✓ Tubo 1: bioquímica (proteínas e glicose) ✓ Tubo 2: microbiologia (coloração de Gram e cultivo) ✓ Tubo 3: imunologia (VDRL, antígenos criptocócicos ou citologia) ✓ É desejável a coleta simultânea de uma amostra de sangue Em caso de o volume coletado ser reduzido e apenas 1 tubo, encaminhar primeiro para o setor de microbiologia (condições estéreis) Liquor Normal ✓ Claro ✓ Não contém mais de 5 linfócitos/ml ✓ Glicose: 45-100 mg/dl ✓ Proteínas: 14- 45 mg/dl ✓ Estéril Meningite Aguda Bacteriana ✓ 500 - 2000 neutrófilos segmentados/ml ✓ Níveis de glicose no LCR diminuem ✓ Aumento de proteínas Tuberculose ou Meningite Viral ✓ 200 - 2000 linfócitos ✓ Predomínio de células mononucleares ✓ Teor de glicose normal ✓ Proteínas ligeiramente aumentadas Transportar as amostras imediatamente ao laboratório Não deve ser refrigerada nem aquecida Amostras com volume superior a 1ml devem ser centrifugadas Sedimento: destinado à bacterioscopia e cultura Sobrenadante: realização das provas de detecção de antígenos bacterianos (CIE) e PCR Bactérias do gênero Haemophilus, Neisseria e Streptococcus são exigentes para seu crescimento A cultura de liquor é direcionada principalmente ao isolamento de bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas, fungos ( Cryptococcus sp.) e micobactérias Cultura em Ágar Sangue e Ágar Chocolate por até 48 horas em temperatura de 35ºC a 37ºC Permitem o isolamento de S. pneumoniae, N. meningitidis e Haemophilus influenzae. Detecção simultânea de três genes na mesma reação:
✓ Gene ctrA: detecta N. meningitidis ✓ Gene lytA: detecta S. pneumoniae ✓ Gene bexA: detecta H. influenzae
RESISTÊNCIA BACTERIANA
ANTIBIÓTICOS
1928 – Descoberta da penicilina Proteínas fixadoras de penicilinas: proteínas existentes na parte externa da membrana plasmática Autolisinas: enzimas que participam da formação do peptideoglicano, abrindo espaços no peptideoglicano, onde são adicionadas novas unidades de NAG e NAM sintetizadas pela célula Antibióticos β-lactâmicos: inibem o crescimento de peptideoglicano, por aumentar a atividade da autolisina (ocorre a lise da célula bacteriana) Ácido clavulânico, subactam e tazobactam: “escudos” das penicilinas Intercalação das moléculas de antibiótico na membrana: desorganização com saída dos componentes celulares e morte da bactéria Ex: polimixinas Aminoglicosídeos e Tetraciclinas (30 seg) Cloranfenicol, Eritromicina, Lincomicina e Clindamicina ( seg) Ao se fixarem, inibem a síntese proteica por diferentes mecanismos Metronidazol: intercala na molécula de DNA, quebrando-a Derivados quinolônicos: inibe a ação das girases (enrolamento/desenrolamento do DNA) Rifampicinas: combina-se irreversivelmente com as RNA- polimerases, bloqueando a transcrição
RESISTÊNCIA BACTERIANA
Eficiência do antibacteriano depende: existência de um alvo, capacidade de atingir o alvo, não ser inativado antes de atingi-lo Bactérias: sensíveis ou resistente Natural: característica da espécie e todas as amostras tem esta propriedade Adquirida: somente parte é resistente
aguardar de 3 a 15 minutos antes de posicionar os discos Colocar os discos na placa com o auxílio de uma pinça Os discos devem ser colocados de modo que fiquem pelo menos 24 mm entre um e outro. Inverter a placa e incubar a 35ºC em aerobiose por 24 horas Sensível, dosagem padrão (S): quando há uma alta probabilidade de sucesso terapêutico utilizando o regime de dosagem padrão do agente Sensível, aumentando exposição (I): quando há uma alta probabilidade de sucesso terapêutico porque a exposição foi aumentada ajustando-se o regime de dosagem ou sua concentração no local de infecção Resistente (R): quando há alta probabilidade de falha terapêutica mesmo quando há aumento da exposição Macrodiluição: ✓ É utilizada como medida quantitativa ✓ Fornece MIC (concentração mínima inibitória) exata a partir do ensaio com 7 - 8 diluições de diferentes antibióticos Diluição em Ágar: ✓ Diferentes concentrações de antimicrobianos são incorporados em ágar ✓ Cada placa terá uma concentração diferente ✓ A menor concentração em que não ocorrer crescimento bacteriano será a MIC ✓ Desvantagens: muito trabalhoso e as placas de ágar não podem ser armazenadas por muito tempo ETEST: ✓ Fitas plásticas com antimicrobianos em gradiente de concentração ✓ Diluição + difusão ✓ Vantagens: MIC real e praticidade ✓ Desvantagens: custo alto e padronização
