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Este documento detalha o processo de preparação de amostras biológicas para análise por microscopia eletrônica de transmissão (met). O texto aborda as etapas de lavagem, fixação, metalização, desidratação, corte e coloração dos cortes, além de fornecer informações sobre materiais e ferramentas necessários para cada etapa. O documento também discute a importância de certos fatores, como a compatibilidade entre soluções tampão e agentes fixadores, e oferece dicas sobre como manipular reagentes especiais para garantir sua qualidade.
Tipologia: Teses (TCC)
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Rio de Janeiro
Relatório técnico apresentado ao Curso Técnico em Biotecnologia do Instituto Oswaldo Cruz Orientadora: Suzana Côrte-Real Faria Coordenadora de área: Suzana Côrte-Real Faria Laboratório: Laboratório de Biologia Estrutural Coordenadores do Curso: Paulo Roberto Soares Stephens Dário Eluan Kalume Rio de Janeiro
No final do século XIX, os cientistas se depararam com as limitações da microscopia de luz, pois sua resolução estava condicionada pelo comprimento de onda das radiações visíveis ao olho humano. Uma microscopia alternativa que pudesse oferecer mais informações e com maior qualidade foi desenvolvida anos depois utilizando elétrons acelerados, os elétrons de alta energia podem associar-se a comprimentos de onda muito mais baixos do que aqueles apresentados pelas radiações luminosas que compreendem a luz visível. De Broglie, em 1925, mostrou o dualismo onda-partícula e, por conseguinte, que o comprimento de onda de um elétron é a função de sua energia. “A energia pode ser comunicada a uma nova partícula carregada por meio de um campo elétrico acelerador. Assim, sob uma voltagem suficientemente grande, por exemplo, 50 10 kV, elétrons de comprimento de onda extremamente curto (λ=0,005Å) e, portanto, de poder de resolução potencialmente alto como uma fonte de iluminação, podem ser produzidos. ” (DE BROGLIE, 1925) Historicamente, a microscopia eletrônica teve seu início com o trabalho de M. Knoll (1935), descrevendo a concepção do microscópio eletrônico. Anos depois, o microscópio eletrônico de transmissão (MET) foi introduzido como instrumento de pesquisa por volta de 1950 e sua utilização trouxe contribuições marcantes ao conhecimento humano, ao mostrar detalhes jamais antes visualizados na área biológica e de ciência de materiais. As especificações desses equipamentos convencionais oferecem barreiras para a análise de amostras biológicas, uma delas é que estes não podem ter a presença de água no interior de sua coluna. Sendo assim, as amostras biológicas para serem analisadas precisam passar por diversos procedimentos para adaptá-las às condições do microscópio eletrônico. Para microscopia eletrônica de transmissão: 1- o material biológico deve estar incluído em material resistente ao aquecimento provocado pela passagem do feixe de elétrons; 2- o material deve ter espessura ideal de 60 a 90 nm; 3- o material deve ter contraste para ser observado.
“Depois de fixados os espécimes biológicos podem suportar melhor os traumáticos eventos impostos pelo M.E., ou seja, o extremo vácuo e o intenso aquecimento provocado pelo feixe de elétrons”. (ALVES, 2004, p.18) O Glutaraldeído é um excelente fixador e um dos mais empregados, devido a sua capacidade de penetração e incorporação irreversível nas estruturas proteicas, o que estabiliza as estruturas. Em cada sítio reativo para a fixação, várias moléculas do fixador são aderidas, o que oferece ótima preservação da ultraestrutura. A pós-fixação com tetróxido de ósmio funciona como uma segunda fixação, sendo um agente com oito grupamentos ativos os quais reagem com lipídeos, proteínas, ácidos nucléicos e polissacarídeos, resulta em uma trama tridimensional que estabiliza a estrutura da célula. A pós-fixação é necessária porque o glutaraldeído não é um bom fixador de lipídeos e o tetróxido de ósmio ainda é capaz de contrastar a região interna da célula, devido a sua capacidade de espalhamento dos elétrons. “Antes de realizar as etapas de ponto crítico durante o processamento para o MEV e de inclusão em resina para o MET é necessário retirar toda a água do sistema biológico, o que deve ser feito de maneira gradual. Modificações bruscas podem levar ao colapso das finas projeções citoplasmáticas, afetando a estrutura celular. Após a fixação, o material deve ser bem lavado, com tampão caso o fixador seja tamponado ou com água caso não o seja, iniciando-se em seguida a desidratação com banhos sucessivos de concentrações crescentes de um agente adequado que substitua a água e a elimine do espécime. Os agentes desidratantes mais usados são o etanol e a acetona.” (GROSS; PIRES; FERNANDES, 2014) ”A secagem final da amostra para observação no MEV será feita sobre condições tais que por ela não passe um menisco de transição de fases evitando as forças resultantes da tensão superficial. Isto é obtido na câmara de ponto crítico (em inglês CPD-Critical Point Dryer, no caso um BalTec CPD 030), geralmente utilizando-se dióxido de carbono como agente de troca. Sabe-se que para cada fluido, existe uma condição de temperatura e pressão característica, em que as fases líquida e gasosa do fluido não podem coexistir; esta combinação corresponde ao ponto crítico do fluido.” (GROSS; PIRES; FERNANDES, 2014) “O espécimen seco precisa ser montado de modo adequado no suporte porta- amostras do MEV, ou, stub, ajustando-se a melhor orientação em relação o feixe de
elétrons e ao coletor. Vários tipos de adesivos podem ser usados nesta montagem: cola de prata coloidal, fita adesiva dupla face, esmalte de unha contendo carbono coloidal, etc.” (DE SOUZA; et al, 2015, p.57) A última etapa do processamento para o MEV é a cobertura metálica. “Visa prover ou aumentar a condutividade da superfície da amostra, bem como aumentar a emissão de elétrons desta, através de uma fina camada metálica (até 20-30 nm de espessura).” (DE SOUZA; et al, 2015, p.57) “O processo mais eficaz de deposição é através de um sistema de evaporação conhecido como “sputtering”. Neste, o metal é removido do alvo (eletrodo negativo ou catodo do sistema), por bombardeamento com íons pesados de argônio; os átomos de ouro são ejetados e se depositam na forma de um filme contínuo sobre todas as reentrâncias e proeminências da superfície da amostra.” (DE SOUZA; et al, 2015, p.58) Os Microscópios Eletrônicos de Varredura convencionais, em sua maioria, operam com a interação amostra-feixe de elétrons ocorrendo em alto vácuo. O equipamento pode utilizar de diversos sensores acoplados para captar os sinais gerados por essa interação eletrônica e transformá-los em informação (imagem ou gráfico, por exemplo). “Na microscopia eletrônica de varredura os sinais de maior interesse para a formação da imagem são os elétrons secundários e os retroespalhados. À medida que o feixe de elétrons primários vai varrendo a amostra estes sinais vão sofrendo modificações de acordo com as variações da superfície. Os elétrons secundários fornecem imagem de topografia da superfície da amostra e são os responsáveis pela obtenção das imagens de alta resolução, já os retroespalhados fornecem imagem característica de variação de composição.” (MALISKA, p.4) “Após a desidratação, o espécime a ser analisado em MET deve ser incluído em um material que permita a posterior obtenção de cortes ultrafinos. Este material deve apresentar boa estabilidade quando submetido ao feixe eletrônico e permitir uma contrastação adequada. Várias substâncias são utilizadas como agentes de inclusão, sendo as resinas as mais conhecidas.” (GROSS; PIRES; FERNANDES,
“As resinas epóxi sob os nomes comerciais de EPON 812, EPIKOTE, EMBED ou POLYBED são equivalentes, e largamente usadas atualmente. A resina básica é
ou azul de metileno e ao serem analisados em um microscópio de luz permitem selecionar uma pequena área de interesse em uma vasta região do material emblocado para serem realizados cortes ultrafinos. O bloco é debastado novamente de modo a restringir a sua face a apenas o tamanho que abranja a região de maior interesse. Os cortes ultrafinos são recolhidos por aderência com grades feitas de cobre, níquel ou ouro de diâmetro padrão de 3 mm e sofrem contrastação com acetato de uranila e citrato de chumbo. Figura 2 - Alguns tipos de grades com granulações diferentes. Fonte: Suzana Cortê- Real. “Amostras biológicas, caracteristicamente, possuem pouco contraste devido aos elementos predominantes em sua composição serem de número atômico baixo. Para intensificar o contraste dos cortes ultrafinos, os cortes são incubados em soluções de sais de metais pesados que reagem com os componentes celulares. ” (DE SOUZA; et al, 2015, p.47) O acetato de uranila reage com vários componentes celulares, especialmente ácidos nucléicos devido a tendência do acetato de uranila de precipitar na presença de fosfato, já o citrato de chumbo apresenta um comportamento de precipitar próximo a superfícies com pH ácido.
Após as grades serem lavadas e secarem a temperatura ambiente, elas são cuidadosamente posicionadas no suporte do MET, e analisadas no equipamento. “O fundamento do MET consiste na geração de um feixe de elétrons, o qual é transmitido através de uma amostra suficientemente fina (transparente ao feixe). Os feixes resultantes da interação com a amostra combinados através da lente objetiva vão trazer informação interna do material analisado como morfologia, estrutura cristalina, defeitos etc.” (MENDONZA OLIVEROS, 2012, p.50)
Descrever, discorrer e realizar os procedimentos de processamento de amostras biológicas para microscopia eletrônica, desde os processos iniciais de fixação do material até a análise no microscópio eletrônico 2.1.1 Objetivo específico Demonstrar o domínio prático e teórico adquirido das técnicas de processamento de material biológico para a microscopia eletrônica. 2.2 METODOLOGIA Acompanhamento de técnicos de laboratório que possuem conhecimento e experiência na área durante a realização das etapas de processamento da amostra. Comparação entre protocolos estabelecidos como referência pelo laboratório/plataforma ou adaptados pela experiência do técnico, e utilizando variações que busquem melhor adequar uma amostra com suas particularidades.
Após a lavagem inicial, o material é transferido para tubos de centrifugação e sedimenta após ser submetido a centrifugação à 4500 rpm por 10 minutos para que o material concentrado seja exposto a um reagente (MET) ou é mantido em placa de petri para ser coberto pela solução fixadora (MET). Com uma pipeta pasteur cobre- se o material com 2,5% de glutaraldeído diluído em 0,1M de tampão cacodilato de sódio (pH 7,2) à 4°C (armazenado em geladeira), a fixação do material deve ser realizada imediatamente antes ou depois da morte dos espécimes. O material concentrado em tubos deve ser resuspendido junto da solução fixadora por meio de um agitador do tipo vortex. O material é mantido na geladeira por uma hora. O material que está no tubo é concentrado e o sobrenadante desprezado. Após, realiza-se 3 lavagens com 6 mL do tampão cocadilato + 3,5% de sacarose no sistema resuspender, concentrar, desprezar sobrenadante e iniciar nova lavagem. Ao final adiciona-se quantidade de pós fixador tetróxido de ósmio a 1% em 0,1 M de tampão cacodilato de sódio + 0,8% Ferrocianeto + 5 mM CaCl2 à 4°C o suficiente para cobrir a amostra, 400 μL são suficientes para material concentrado em tubos de centrifuga. Embala-se os tubos ou a placa de petri com papel alumínio O material embalado é mantido na geladeira por uma hora. Figura 4 – Papel alumínio que foi usado para acondicionar da luz, tubos com material em processo de pós fixação. Fonte: Lorran Faria.
Para a amostras destinada ao MEV, concentra-se o material e despreza-se o sobrenadante. Após, realiza-se 3 lavagens com 6 mL do tampão cocadilato + 3,5% de sacarose no sistema já realizado anteriormente. O material deve atender a condição de ter sido cultivado sob lamínulas de vidro com tamanho correspondente aos stubs ou foi aderido em pequenas quantidades nessas lamínulas usando um revestimento de poli-L-lisina, as lamínulas, posteriormente, são aderidas nos stubs usando cola com propriedades condutoras. Essas lâminas são organizadas em um porta amostra de 4 cavidades cilíndricas, próprio para o equipamento de ponto crítico, o porta amostra com as laminas é inserido dentro de um Becker de altura e área da base superiores ao porta amostra. Figura 5 – Esquema para registro e orientação do técnico ao realizar a desidratação de muitos códigos (materiais diferentes). Fonte: Lorran Faria.
Becker e o posiciona dentro da câmara, adiciona-se etanol 100% até atingir a marcação na parede interna da câmara, a tampa da câmara é fechada e pressiona- se o botão COOL, aguarda-se até que a temperatura esteja abaixo de 0°C no visor à direita do equipamento, pressiona-se FILL, e aguarda-se que a pressão atinja marca entre 700 e 800 na tela à esquerda do equipamento, marca-se o cilindro (para fins de controle de volume dele), aguarda-se período por volta de 40 minutos, quando o aparelho marcar 0 de pressão, temperatura próxima a 40°C e botão VENT ligado fecha-se o cilindro de CO2, desliga-se o equipamento, condensador e filtro de linha, abre-se a câmara da tampa e retira-se o porta amostras com uma pinça, o porta amostras é colocado em um Becker, fecha-se a tampa da câmara. Figura 7 - Equipamento que realiza o ponto crítico, um AUTOSAMDRI-815. Fonte: Lorran Faria.
Figura 8 – Cilindro de CO2 com marcado com a quantidade usos para o controle da qualidade e disponibilidade do reagente. Fonte: Lorran Faria. De posse dos stubs (suportes de materiais do MEV), retira-se com uma pinça o porta amostras do Becker, e aos poucos deve-se retirar as lamínulas e os anéis que as acomodam e separam no porta amostra calmamente para não danificá-las. Com fita adesiva dupla face adere-se as lamínulas nos stubs e cobre-se metade das lamínulas da face do material com a fita, a fita é retirada e junto dela parte do material daquela região é retirado, a região da fita com material aderido é colocado sobre o stub e cortado até apenas a face do stub, os stubs com o material são pressionados em um pedaço de isopor até estarem com pelo menos metade de suas alturas no isopor, o isopor é colocado em um pote com sílica-gel e transportado para o metalizador.
Figura 10 – Sílica gel autoclavada. Fonte: Lorran Faria. Abre-se a câmara do equipamento retirando-se a tampa, retira-se pela parte externa a proteção de vidro da câmara, a depositando sobre papel toalha na mesa, com uma pinça posicionar os stubs sobre a placa metálica do aparelho, o equipamento é remontado, liga-se o aparelho (botão POWER), o tempo do metalizador é ajustado para dois minutos, pressiona-se os botões PAUSE e SET ao mesmo tempo, aguarda-se que pressão no interior da câmara atinja valor inferior a 0,1 mbar, pressiona-se START, deve-se manter a corrente em 30mA (em caso de oscilação ajustar utilizando o botão localizado no lado esquerdo na parte de trás do aparelho), ao termino dos dois minutos pressiona-se POWER, a válvula localizada em cima da tampa é puxada preenchendo câmara com ar, abre-se a câmara, com uma pinça retira-se os stubs que são devolvidos ao isopor, antes de fechar o aparelho limpa-se a parte interna do vidro com papel toalha e o aparelho é fechado. Figura 11 - Equipamento que realiza a metalização com partículas de ouro, um CRESSINGTON SPUTTER COATER 108. Fonte: Lorran Faria.
O material para ser analisado no MET deve atender a condição de ter sido transferido para um tubo de centrifuga, após a lavagem do material pós fixado, o material é desidratado gradualmente, adiciona-se acetona 30% até completar 6 mL no tubo contendo o material, centrifuga-se os tubos à 4500 rpm por 10 minutos, descarta-se o sobrenadante e adiciona-se acetona 50%, a desidratação segue no sistema resuspender, concentrar, desprezar sobrenadante e adicionar acetona mais concentrada. O processo é repetido até que se chegue na acetona 100%, ao final o material deverá ter passado pela acetona 30%, 50%, 70%, 90%, 100% pelo menos uma vez, a desidratação com acetona 100% é repetida mais duas vezes, descarta- se a acetona, com uma pipeta de plástico aplica-se resina diluída 1:1 em acetona 100%, resuspender-se o material, armazena-se o material em geladeira até o dia seguinte (overnight), os tubos são centrifugados à 4500 rpm por 10 minutos, retira- se metade da resina presente no tubo(sem retirar o material) e transfere-se para microtubo, o material presente no tubo com resina é transferido para capsulas BEEM, transfere-se resina do microtubo para as capsulas BEEM o suficiente para que a preencha quase completamente, as capsulas BEEM são colocadas em microtubos e são centrifugadas em centrifuga de microtubos a 6000 rpm por 5 minutos quantas vezes forem necessárias ate o material ficar concentrado no centro do fundo da capsula, com uma pipeta de plástico de abertura menor retira-se cuidadosamente a resina em volta do material que está dentro de capsula (descarta- se a resina), adiciona-se cuidadosamente resina pura aos tubos até quase preencher as capsulas, insere-se nas paredes internas da capsula uma tira de papel com o código de identificação da amostra, as capsulas fechadas são colocadas em suporte e vão para forno de polimerização à mais de 60 °C por 72 horas.
