Regulação do Ca2+ intracelular em células musculares esqueléticas: Papel do cADPR | Notas de estudo Bioquímica

REGULAÇÃO DO Ca²+ NO MÚSCULO ESQUELÉTICO POR UM SEGUNDO

MENSAGEIRO DERIVADO DE NAD DURANTE E APÓS UM PROTOCOLO

DE FADIGA.

Gustavo Manzanares*¹, Paulo Guimarães Gandra¹.

¹- Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual, IB; UNICAMP

RESUMO

A estimulação das células musculares esqueléticas resulta no aumento da concentração de Ca2+ livre

intracelular ([Ca2+]i), que é liberado do retículo sarcoplasmático. O aumento do [Ca2+]i, acaba por

desencadear o processo de contração e geração de força. Ao término do estímulo, a [Ca2+]i retorna para

valores de repouso devido a ação da bomba de Ca2+ do retículo sarcoplasmático. Alterações na regulação

do [Ca2+]i podem estar associadas ao desenvolvimento da fadiga e da perda da função do músculo em

condições patofisiológicas. Recentemente foi observado que a contração do músculo induz o aumento da

formação de ADP-ribose cíclico (cADPR) um composto que pode regular o [Ca2+]i (o cADPR é um segundo

mensageiro de Ca2+ derivado do NAD+). Existem evidências de que o cADPR pode aumentar o [Ca2+]i e a

atividade da bomba de Ca2+ do retículo sarcoplasmático. Porém, o papel do cADPR na regulação do [Ca2+]i

durante um período de estimulações sucessivas do músculo ainda não é conhecido. A hipótese central deste

projeto é que o cADPR é importante para regulação do [Ca2+]i em células musculares esqueléticas durante

e após um período de atividade contrátil. Para testar esta hipótese nós já conseguimos obter células

musculares intactas isoladas do músculo de camundongos. Estas células vêm se mostrando viáveis e

responsivas a estimulação elétrica. Nós estamos carregando estas células com um marcador fluorescente de

Ca2+ para realização da medida da [Ca2+]i em tempo real, durante e após a estimulação das células isoladas

(single cell), por microscopia de fluorescência. O próximo passo deste projeto será tratar as células com um

antagonista de cADPR e analisar a dinâmica de variação de [Ca2+]i durante e após um protocolo de

estimulação elétrica que induz a fadiga. Nós esperamos que os resultados obtidos poderão trazer

informações importantes para o entendimento de como o cADPR regula a função do músculo. O

entendimento do papel do cADPR no músculo poderá ser especialmente relevante para condições em que

os níveis de NAD+ ou de cADPR podem estar alterados, como no envelhecimento e em tratamentos

farmacológicos com potencial de alterar a formação de cADPR.

Palavras-chaves: Músculo esquelético, Cálcio, NAD

1. INTRODUÇÃO

A prescrição do exercício físico para a prevenção e combate de doenças crônicas, para

a melhora da qualidade de vida e promoção da saúde no envelhecimento é cada dia mais

recorrente1,2. O entendimento dos mecanismos que regulam o processo de contração do

musculo esquelético é de grande importância para o desenvolvimento de estratégias que

melhorem a função do músculo e a capacidade ou tolerância ao exercício. Os íons de

Ca2+ possuem papel central no processo de contração do músculo esquelético. O aumento

concentração intracelular de Ca2+ livre ([Ca2+]i) é necessário para que ocorra a exposição

do sítio de ligação da actina, o que permite que ocorra a ligação entre actina e miosina (as

proteínas contráteis) e consequentemente a contração. Em condições de repouso a [Ca2+]i

é baixa. Quando o músculo é estimulado a contrair o Ca2+ é liberado do retículo

sarcoplasmático, aumentando o [Ca2+]i. Em um protocolo de estimulações repetidas a

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REGULAÇÃO DO Ca²+^ NO MÚSCULO ESQUELÉTICO POR UM SEGUNDO MENSAGEIRO DERIVADO DE NAD DURANTE E APÓS UM PROTOCOLO DE FADIGA. Gustavo Manzanares¹, Paulo Guimarães Gandra¹.* ¹- Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual, IB; UNICAMP RESUMO A estimulação das células musculares esqueléticas resulta no aumento da concentração de Ca2+^ livre intracelular ([Ca2+]i), que é liberado do retículo sarcoplasmático. O aumento do [Ca2+]i, acaba por desencadear o processo de contração e geração de força. Ao término do estímulo, a [Ca2+]i retorna para valores de repouso devido a ação da bomba de Ca2+^ do retículo sarcoplasmático. Alterações na regulação do [Ca2+]i podem estar associadas ao desenvolvimento da fadiga e da perda da função do músculo em condições patofisiológicas. Recentemente foi observado que a contração do músculo induz o aumento da formação de ADP-ribose cíclico (cADPR) um composto que pode regular o [Ca2+]i (o cADPR é um segundo mensageiro de Ca2+^ derivado do NAD+). Existem evidências de que o cADPR pode aumentar o [Ca2+]i e a atividade da bomba de Ca2+^ do retículo sarcoplasmático. Porém, o papel do cADPR na regulação do [Ca2+]i durante um período de estimulações sucessivas do músculo ainda não é conhecido. A hipótese central deste projeto é que o cADPR é importante para regulação do [Ca2+]i em células musculares esqueléticas durante e após um período de atividade contrátil. Para testar esta hipótese nós já conseguimos obter células musculares intactas isoladas do músculo de camundongos. Estas células vêm se mostrando viáveis e responsivas a estimulação elétrica. Nós estamos carregando estas células com um marcador fluorescente de Ca2+^ para realização da medida da [Ca2+]i em tempo real, durante e após a estimulação das células isoladas ( single cell ), por microscopia de fluorescência. O próximo passo deste projeto será tratar as células com um antagonista de cADPR e analisar a dinâmica de variação de [Ca2+]i durante e após um protocolo de estimulação elétrica que induz a fadiga. Nós esperamos que os resultados obtidos poderão trazer informações importantes para o entendimento de como o cADPR regula a função do músculo. O entendimento do papel do cADPR no músculo poderá ser especialmente relevante para condições em que os níveis de NAD+^ ou de cADPR podem estar alterados, como no envelhecimento e em tratamentos farmacológicos com potencial de alterar a formação de cADPR. Palavras-chaves: Músculo esquelético, Cálcio, NAD

1. INTRODUÇÃO A prescrição do exercício físico para a prevenção e combate de doenças crônicas, para a melhora da qualidade de vida e promoção da saúde no envelhecimento é cada dia mais recorrente1,2. O entendimento dos mecanismos que regulam o processo de contração do musculo esquelético é de grande importância para o desenvolvimento de estratégias que melhorem a função do músculo e a capacidade ou tolerância ao exercício. Os íons de Ca2+^ possuem papel central no processo de contração do músculo esquelético. O aumento concentração intracelular de Ca2+^ livre ([Ca2+]i) é necessário para que ocorra a exposição do sítio de ligação da actina, o que permite que ocorra a ligação entre actina e miosina (as proteínas contráteis) e consequentemente a contração. Em condições de repouso a [Ca2+]i é baixa. Quando o músculo é estimulado a contrair o Ca2+^ é liberado do retículo sarcoplasmático, aumentando o [Ca2+]i. Em um protocolo de estimulações repetidas a

liberação de Ca2+^ do retículo durante a estimulação é progressivamente diminuída, isto resulta em uma diminuição na amplitude do transiente de [Ca2+]i durante a contração muscular, levando a uma menor geração de força e portanto no desenvolvimento de fadiga (figura 1). Durante o desenvolvimento da fadiga, também ocorre um acúmulo do [Ca2+]i de repouso (a [Ca2+]i no momento em que a célula não está contraindo) que irá resultar em uma diminuição da taxa de relaxamento do músculo (figura 1). O Ca2+ também pode regular a resposta adaptativa ao exercício. Nesse sentido, vem sendo proposto que um pequeno aumento do [Ca2+]i de repouso após o exercício pode funcionar como um sinal que resulta em aumento da capacidade oxidativa e resistência a fadiga do músculo^3. Já grandes aumentos na concentração do [Ca2+]i de repouso podem estar associados ao “overtraining” e desenvolvimento de miopatias4,5. A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) funciona como uma coenzima em reações redox centrais para o metabolismo energético celular6,7. O NAD também pode regular a expressão de genes importantes para o metabolismo oxidativo e a função de células satélites no músculo^8. Segundos mensageiros de Ca2+^ derivados de NAD vem sendo mostrado regular o [Ca2+]i em diferentes tipos celulares 9,10.Porém, o papel desses segundo mensageiros de Ca2+^ derivados do NAD na função do músculo esquelético ainda não é claro. Como os níveis de NAD+^ estão diminuídos no músculo no envelhecimento e distrofias11,12, enquanto que terapias visando o aumento dos níveis de NAD+^ vem sendo cada vez mais estudadas, o entendimento do papel de segundo mensageiros de Ca2+ derivados de NAD pode ser importante para o entendimento de como a variação dos níveis de NAD podem afetar a função do músculo^13. O cADPR (adenosina difosfato-ribose cíclico) é um dos segundos mensageiros de NAD mais conhecidos9,10,14. O cADPR ativar diretamente ao canal de rianodina (RYR1), ou se ligar a bomba de Ca2+^ do retículo sarcoplasmático (SERCA) aumento assim sua atividade^15. Independente da sua atuação é notável que a formação de cADPR foi mostrada estar aumentada no músculo durante a estimulação elétrica ( in vitro ) e após o exercício ( in vivo ) sugerindo que o cADPR pode ser importante para regulação da contração muscular15,16. Em um estudo com células musculares esqueléticas isoladas (fibras musculares), o tratamento com um antagonista de cADPR resultou em menor amplitude de [Ca2+]i durante uma única contração tetânica submáxima e durante um período de estimulação contínua submáximo 17. Durante um protocolo de estimulação que induz a fadiga, o [Ca2+]i de repouso (o valor de [Ca2+]i enquanto a fibra não está contraindo) aumenta progressivamente18,19^ (ver Figura 1). O aumento do [Ca2+]i de repouso pode resultar de uma diminuição da captação da atividade da SERCA, o que causa uma diminuição da taxa de relaxamento da fibra de até ~2.5 vezes, que é característico do processo de desenvolvimento de fadiga18,19. A diminuição da captação de Ca2+^ pela SERCA durante o desenvolvimento da fadiga pode resultar de diminuições no pH intracelular18,19. Uma das perguntas que este projeto visa responder é se o aumento da formação de cADPR durante um período de estimulação que induz a fadiga é importante para regular a atividade da SERCA e do [Ca2+]i durante e após um período de atividade contrátil repetitiva. A hipótese central deste projeto é que o cADPR, um segundo mensageiro de Ca2+ [Ca 2+ ]i tempo [Ca2+]i repouso (pré-estimulação) [Ca2+]i repouso (pós-estimulação) [Ca2+]i pico (durante uma contração) Figura 1 - Exemplo de medida do [Ca2+]i em uma fibra muscular esquelética isolada durante um protocolo de estimulação elétrica que induz a fadiga. Repare o aumento do [Ca2+]i de repouso e a diminuição progressiva da amplitude do [Ca2+]i durante o protocolo de fadiga. Dados obtidos no lab. do Dr Hogan (University of California-San Diego).

gravidades que elaboramos para manutenção da qualidade das células (imagem 2). O fluxo de ~3ml/min de Tyrode’s se mostrou ideal para a perfusão. Para estimular as fibras eletrodos de platina, conectados a um estimulador elétrico, devem ser posicionados a 5 mm de distância das fibras. A princípio estávamos observamos resposta contrátil apenas quando utilizamos ~25 V. Como uso de voltagens altas resulta em eletrólise que pode ser prejudicial para as células, nós fizemos ajustes nos protocolos de isolamento e perfusão das fibras que resultaram em melhora da sua viabilidade e contratilidade. A melhora dos procedimentos de obtenção das fibras, permitiu a estimulação das fibras com voltagens menores (~8 a 15V). Nós ainda pretendemos melhorar a estimulação utilizando um novo estimulador recentemente adquirido. 2.3.Medidas de [Ca2+]i As medidas de Ca2+^ estão sendo realizadas no instituto de Biologia da Unicamp em um laboratório satélite do Laboratório Nacional de Estudos do Cálcio Celular. Para isso as fibras são incubadas com o um marcador fluorescente de Ca2+^ (INDO-1 AM), por cerca de 30 min a 60 min. A câmara contendo a fibra já carregada com INDO- 1 é posicionada sobre o estágio de um microscópio de fluorescência invertido, conectado a um sistema de fotometria que inclui um monocromador (fonte de luz), filtros e um tubo fotomultiplicador (PMT) para detecção dos sinais de fluorescência (RatioMaster, PTI Horiba). Os sinais de fluorescência são adquiridos através do software Felix GX (Photon Technology International, PTI) e analisados para determinação da variação da concentração de [Ca2+]i. Para realização das medidas de [Ca2+]i durante a estimulação, nós otimizamos as condições de carregamento das células intactas com o marcador fluorescente de INDO-1 AM. Apesar de já estarmos conseguindo carregar as células com o marcador de Ca2+, nós também estamos otimizando este processo através da adição de um detergente (pluoronic F-

na solução de carregamento. 2.4.Incubação com antagonista de cADPR Este projeto ainda está em andamento e o tratamento das fibras isoladas com o antagonista de cADPR ainda será realizado. Para isso as fibras serão incubadas por 10 minutos com o composto antagonista de cADPR, 8-Bromo-cADPR (100 M; Cayman Chemical)^17. As fibras tratadas com 8-Bromo-cADPR serão comparadas com fibras controle que serão mantidas incubadas somente com solução de Tyrode’s nas mesmas condições e pelo mesmo período que as células tratadas com o antagonista de cADPR. A medida da [Ca2+]i por microscopia de fluorescência será realizada em tempo real durante a realização do protocolo de estimulação^19 –^21. Os valores de [Ca2+]i de repouso serão determinados antes do protocolo de fadiga, entre cada contração realizada durante o

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7 1 1. 5 2 2. 5 3 3. 5 Raz ão de fluoresc ência (indo-1) Raz ão de fluoresc ência (indo-1) Raz ão de fluoresc ência (indo-1) Tempo (s) Tempo (s) Tempo (s) Figura 4 - Exemplo de sinal de fluorescência de uma fibra muscular esquelética isolada estimulada com trens de A) 20 Hz; B) 50 Hz; C) 100 Hz. Como esperado há aumento da razão de fluorescência de indo- 1 indicando maior [Ca2+]i conforme a frequência de estimulação é aumentada. Ajustes na preparação experimental ainda são necessários para diminuir o ruído e melhorar o sinal obtido. (Esta fibra demonstrou a variação esperada dos sinais de fluorescência do indo-1; diminuição da emissão a 485 nm e aumento da emissão a 410 nm durante a estimulação).

protocolo de fadiga e 5, 10, 15, 30 minutos após o término da estimulação^19 –^21. A taxa de decaimento [Ca2+]i durante a fase de relaxamento de cada contração será utilizada para estimar a atividade da SERCA^23. Os valores de [Ca2+]i pico durante as contrações tetânicas também serão obtidos ao longo do protocolo de estimulação.

3. CONCLUSÕES As condições experimentais para testar a nossa hipótese, de que o cADPR formado no músculo é importante para regular o [Ca2+]i no músculo durante e após um protocolo de estimulação que induz a fadiga, já estão praticamente todas definidas. Nós estamos conseguindo obter células musculares esqueléticas isoladas intactas viáveis e responsivas à estimulação elétrica. Além disso, estamos conseguindo carregar as células com o marcador fluorescente de Ca2+^ INDO-1 AM. No momento estamos retomando as atividades no laboratório após as suas interrupções devido a pandemia do COVID-19. Os estudos sobre os efeitos do tratamento de células musculares esqueléticas com um antagonista de cADPR sobre o [Ca2+]i durante e após um período de atividade contrátil repetitiva irão ajudar a definir se o cADPR endógeno, é um fator importante para regular a função do músculo durante a contração. 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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