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MESTRADO PROFISSIONALIZANTE EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO LEITE E DERIVADOS DISCIPLINA: FÍSICO-QUÍMICA DO LEITE E DERIVADOS Professor: Luiz Carlos Gonçalves Costa Júnior, DSc.
Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais Secretaria de Estado de Agricultura, Pecuária e Abastecimento
QUEIJOS: Avaliação da Proteólise
Método de Kjeldahl
Fundamento Consiste em aquecer inicialmente a amostra contendo nitrogênio com excesso de ácido sulfúrico concentrado até todo o carbono seja oxidado a CO 2. Modificações posteriores usam da adição de catalisadores (cobreII, selênio) para acelerar a oxidação. Sulfatos de potássio ou de cobre são usados para aumentar o ponto de ebulição do ácido sulfúrico, consequentemente resultando em economia de tempo na digestão. Após a digestão, alcaliniza-se o meio com hidróxido de sódio para destilação da amônia (NH 3 ) formada. O gás amônia liberado é recolhido em ácido, o qual é contra titulado ou o sal formado é titulado diretamente. O método de determinação de proteína originalmente proposto por Kjeldahl e modificado conforme exposto acima serve de base para todos os métodos colorimétricos, espectrofotométricos e por reflexão no infra-vermelho (Kjeldahl é método primário).
CUIDADOS BÁSICOS COM O DESTILADOR DE PROTEÍNAS
- Abrir a água;
- Ligar em 220 V;
- Ligar nível para enchimento da caldeira;
- Quando a luz estiver acesa a caldeira estará cheia;
- Desligar o botão do nível;
- Durante a operação entre 5 e 6;
- No final da operação abrir a borracha e esvaziar a caldeira;
- Quando adicionar soda desligar o aquecimento;
Final:
- Desligar o aquecimento;
- Tirar o erlenmeyer.
REAÇÕES OCORRIDAS (MÉTODO KJELDAHL)
- 1ª fase - Digestão: quebra das proteínas:
Em que: H 2 SO 4 (agente oxidante) + calor = quebra das proteínas; e CuSO 4 e K 2 SO 4 = catalisadores, sendo que o segundo evita evaporação do ácido sulfúrico e aumenta o ponto de ebulição dele.
H 3 BO 3 ↔↔↔↔ H 2 O + HBO 2 + indicador (roxo)
(NH 4 ) 2 SO 4 + NH 4 HSO 4 + NaOH →→→→ NH 3 + Na 2 SO 4 + H 2 O
NH 3 + H 2 O + HBO 2 →→→→ NH 4 BO 2 (verde) + H 2 O amônia metaborato de amônio
R-CONH-R + H 2 SO 4 ^ CuSO →→→→^4 (NH 4 ) 2 SO 4 + NH 4 HSO 4 + SO 2 + CO 2 + CuSO 4 + K 2 SO 4 + H 2 SO 4 K 2 SO 4
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Observação: sais de amônio + NaOH = liberação de amônia; e ácido bórico + amônia = formação do metaborato de amônio
NH 4 BO 2 + HCl →→→→ NH 4 Cl + HBO 2 (roxo) + H 2 O ác. ortobórico
FATORES DE CONVERSÃO DAS FÓRMULAS:
- 1,4: 1 mL de NaOH ---------------- neutralizam 14g de N ------------------- por 1000 mL Ci ----------------------------- x g de N --------------------------------- mL
x (g de N) = (Ci x 14 x mL)/
g de N -------------------------------- g de amostra y (% N) ---------------------------------100 g amostra
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compostos que contribuem para o flavor do queijo Cheddar são solúveis em solventes aquosos (ASTON & CREAMER, 1986). O ácido tricloroacético, em concentrações de 2 a 12%, tem sido empregado para separação de peptídeos de média e baixa massa molecular em extratos aquosos dos queijos ou em filtrados obtidos de precipitação em pH 4,5 (FOX, 1989). Os peptídeos solúveis em TCA 12% contêm de 2 a 20 resíduos de aminoácidos, enquanto os peptídeos insolúveis continham de 10 a 65 resíduos. Entretanto, todos os peptídeos contendo menos do que sete resíduos de aminoácidos foram solúveis em TCA, em concentrações de 2 a 12%. A principal característica correlacionada com a solubilidade em TCA 12% foi o aumento na hidrofobicidade superficial acessível dos peptídeos. A hipótese sugere que o TCA, ao interagir com os peptídeos, induz a um aumento na hidrofobicidade superficial acessível (ou decréscimo no potencial de hidratação), que pode levar à agregação por ação de interações hidrofóbicas.
METODOLOGIA - COMPOSTOS NITROGENADOS
1. Fracionamento dos Compostos Nitrogenados Soluções e Reagentes − Citrato de sódio 0,5 mol/L S.R. − Ácido clorídrico 1,41 mol/L S.R. − Ácido tricloroacético 24 % (m/v) S.R.
Vidrarias − Proveta, capacidade 100 mL. − Balão volumétrico, capacidade 100 mL e 200 mL. − Pipeta graduada capacidade 20 mL, intervalo de graduação de 0,1 mL. − Pipeta volumétrica, capacidade 5 mL. − Pipeta volumétrica, capacidade 10 mL. − Funil de vidro. − Béquer, capacidade 100 mL. − Béquer, capacidade 250 mL.
Equipamentos − Balança semi-analítica ou analítica. − Processador de alimentos. − Medidor de pH.
Utensílios − Copo plástico para processador de alimentos, capacidade 500 mL. − Espátula de aço inoxidável. − Funil de vidro, haste longa, ângulo de 60 º, diâmetro de 10 cm. − Haste com base e pinças duplas para bureta. − Haste com base e suporte para funil de vidro. − Papel de filtro quantitativo para precipitados gelatinosos, baixo teor de cinzas, diâmetro de 12,5 cm. − Pipetador de borracha. − Pisseta plástica, capacidade 500 mL. − Termômetro com escala de 0 a 100 ºC, intervalo de graduação de 1 ºC.
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1.1. Técnica de Extração − Picar todo o queijo em pequenos cubos ou retirar uma amostra não inferior a 100 g, preferencialmente com auxílio de uma sonda; − bater em processador de alimentos até formação de uma massa uniforme; − pesar com exatidão, utilizando balança analítica ou semi-analítica, 10 g do queijo triturado, diretamente em um copo de processador; − adicionar 80 mL de água destilada a 40-45 ºC e 40 mL de solução de citrato de sódio 0, mol/L; − bater em processador de alimentos por 7 minutos. Movimentar cuidadosamente o copo do processador para facilitar o desaparecimento da espuma; − transferir quantitativamente a suspensão de queijo para um balão volumétrico de 200 mL, fazendo várias lavagens com pequenos volumes de água destilada; − acrescentar água destilada em quantidade que não ultrapasse a marca de referência do balão volumétrico; − resfriar em água corrente até 20 ºC; − completar o volume com água destilada até a marca de referência do balão volumétrico; e − inverter o balão várias vezes para uniformizar a suspensão.
1.2. Fracionamento para Determinação de Nitrogênio Solúvel em pH 4, − medir exatamente 100 mL da suspensão e transferir para um béquer de 250 mL; − adicionar, com auxílio de pipetador de borracha, 10 mL de solução de ácido clorídrico 1, mol/L S.R.; − aguardar 5 minutos; − acrescentar 15 mL de água destilada; − filtrar através de papel-filtro; e − reservar o filtrado para determinação posterior.
1.3. Fracionamento para determinação de Nitrogênio Solúvel em Ácido Tricloroacético (TCA) 12% − medir exatamente 50 mL da suspensão e transferir para um béquer de 250 mL; − adicionar, com auxílio de pipetador de borracha, 50 mL de solução de ácido tricloroacético 24 % (m/v) S.R.; − aguardar 15 minutos; − filtrar através de papel-filtro; e − reservar o filtrado para determinação posterior.
Método de Kjeldahl
Fundamento O método desenvolve-se em 3 etapas. Na primeira, promove-se a oxidação (digestão) da amostra pelo ácido sulfúrico, a quente, em presença de catalisadores, rompendo a estrutura protéica para a liberação do nitrogênio sob a forma de sais de amônio. O resíduo obtido desta etapa é adicionado, numa segunda fase, de hidróxido de sódio, liberando-se amônia, que é destilada e captada por uma solução de ácido bórico (adicionado de indicadores). Da reação, forma-se metaborato de amônio, o qual será titulado por neutralização com ácido clorídrico, representando a fração nitrogenada que se deseja determinar.
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− anotar os volumes gastos (A) e (B) para as determinações na amostra e na prova em branco, respectivamente.
Resultado − Calcular o teor percentual de nitrogênio total por meio da fórmula abaixo:
% NT =
(A - B) Ci fc 1,
g
× × ×
Sendo: % NT: teor percentual (m/m) de nitrogênio total; A: volume gasto na titulação da amostra; B: volume gasto na titulação da prova em branco; Ci: concentração (mol/L) da solução de ácido clorídrico; fc: fator de correção para a solução de ácido clorídrico; e g: porção alíquota da amostra (10/200 × 5 = 0,25).
Observação − Para preparar a solução de ácido ortobórico com indicador, seguir as seguintes etapas:
Ácido bórico (H 3 BO 3 ) 4% (m/v) S.R. (1 litro de solução):
− pesar 40 g de ácido bórico p.a., em um béquer de 500 mL; − adicionar ao béquer aproximadamente 300 mL de água destilada; − aquecer, agitando com um bastão de vidro, até completa dissolução do ácido; − transferir, quantitativamente, para um balão volumétrico de 1000 mL; − fazer aproximadamente 5 lavagens no béquer, com pequenas porções de água destilada, transferindo para o balão; − completar o volume com água destilada; e − tampar o balão e misturar por inversões.
Indicador misto (100 mL de solução): − pesar 200 mg de vermelho de metila p.a. e 100 mg de azul de metileno p.a. em um béquer de 250 mL; − dissolver os indicadores em 80 mL de etanol 97% (v/v) p.a.; − filtrar para um balão volumétrico de 100 mL, utilizando papel-filtro; − após a filtragem, completar o volume do balão para 100 mL; e − transferir a solução preparada para um frasco, de preferência âmbar.
Observação A mistura ácido bórico com o indicador é preparada adicionando 15 mL de indicador misto a cada litro de ácido bórico 4%.
2.2. Técnica de determinação de Nitrogênio Solúvel em pH 4, − Transferir 5 mL do filtrado para fracionamento do nitrogênio solúvel em pH 4,6 - item 7.1.
- para um balão de Kjeldahl ou tubo de digestão; e − prosseguir conforme técnica descrita em 7.2.1.
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Resultado − Calcular o teor percentual de nitrogênio solúvel em pH 4,6 por meio da fórmula abaixo:
% NS =
(A - B) Ci fc 1,
pH 4,6 g
× × ×
Sendo: % NSpH 4,6: teor percentual (m/m) de nitrogênio solúvel em pH 4,6; A: volume gasto na titulação da amostra; B: volume gasto na titulação da prova em branco; Ci: concentração (mol/L) da solução de ácido clorídrico; fc: fator de correção para a solução de ácido clorídrico; e g: porção alíquota da amostra (10/200 × 100/125 × 5 = 0,2).
2.3. Técnica de determinação de Nitrogênio Solúvel em Ácido Tricloroacético (TCA) 12% − Transferir 5 mL do filtrado para fracionamento do nitrogênio solúvel em TCA 12% - item 7.1.3 - para um balão de Kjeldahl ou tubo de digestão; e − prosseguir conforme técnica descrita em 7.2.1.
Resultado − Calcular o teor percentual de nitrogênio solúvel em TCA 12% por meio da fórmula abaixo:
% NS =
(A - B) Ci fc 1,
TCA 12% g
× × ×
Sendo: % NSTCA 12%: teor percentual (m/m) de nitrogênio solúvel em TCA 12%; A: volume gasto na titulação da amostra; B: volume gasto na titulação da prova em branco; Ci: concentração (mol/L) da solução de ácido clorídrico; fc: fator de correção para a solução de ácido clorídrico; e g: porção alíquota da amostra (10/200 × 50/100 × 5 = 0,125).
