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PIV - produção in vitro passo a passo
Tipologia: Slides
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Não perca as partes importantes!
Definição
Colheita de oócitos
1. In vitro (ovário de abatedouro) baixo melhoramento genético Coleta (2h): garrafa térmica com boca grande com solução de acondicionamento, bequer com água p/ t°c Solução de acondicionamento: Antibiotico + antimicotico
1. In vitro (ovário de abatedouro) baixo melhoramento genético Slincing ou fatiamento Bequer com 5 ml de meio de recuperação (recuperação = DMPBS + Alb + PENI + Hepa + HEPES e SBF), pegar ovário com pinça na medula, condiciona em cima do bequer e corta com bisturi e lâmina, folículos abertos em cima do bequer com meio oocitos vão cair e depois lavar com meio o ovário em cima do bequer.
2. In vivo + melhoramento genético devido escolher animal TUGA – aspiração guiada por ultrassonografia transvaginal Laparotomia Laparoscopia - LOPU Aplicar protocolos de superovulação – (N0) p4 intravaginal e 36h antes de tirar aplica PGF2-alfa associado com FSH ou eCG (N9) e no N11 tira o dispositivo Laparotomia: retira na hora da colheita, com animal na maca, primeiro aspira os folículos de baixo para cima, devido o sangue. Depois lava-se o útero e ovário com soro com heparina. Laparoscopia: usa-se câmera, pinça e tubos. É um
Procurar oócitos
1. Material – placa petri de plástico de quatro poços ou tampa riscada, para ajudar achar estruturas com lupa
Fecundação in vitro FIV 1 – Escolher sêmen: fresco, congelado ou refrigerado 2 - Melhor genética: valor agregado ao embrião 3 – Vantagem de usar sêmen congelado- descongelado: 4- Sêmen cong-descong.: pega palheta com pinça hemostática, palheta no ar por 10s e mergulha no banho maria a 37°C por 20s a 25s, enxuga palheta, pega eppendorf e corta o vidante, verte semêm a 37° e fazer avaliação se está vivo, coloca 5ml, lâmina com lamínula no microscópio em objetiva de 100, avaliar MIP e vigor. Por fim usa-se percoll e swin up. Percoll Swin up
Fecundação in vitro FIV
1. Percoll: percoll é viscoso vem 100%, centrifuga refrigerada, colocado em um tubo falcon com duas ou três [ ], a maior ficando no fundo do tubo (45% e 90%) e na parte superior o sêmen. Primeiro coloca 45% e com pipeta adiciona 90% no fundo, sêmen por cima e centrifuga a 700G por 15 min, despreza sobrenadante e resuspende com 1ml de meio FIV uma segunda centrifugação, que tem como finalidade remover os polímeros do percoll por 500G e 5min, por fim coloca mais meio até completar 2ml. depois da seleção de espermatozoides é feito a concentração para que fique em 1x10^6/ml a gota terá 500ul e 500.000 sptz/ml Formula: C0 x v0 = Cf x Vf 100% x v0 = 45 x 500
Capacitação espermática 1- proteína de membrana – ajudam a nadar em linha reta, mas precisam ser removidos, no trato feminino é feito pelos líquidos e glicoaminos, caso contrario o sptz não conseguiram se acoplar nos receptores zp2 e zp3. 2 - Reação acrossomal – abertura do acrossoma para liberar enzimas hidroliticas, responsáveis por conectar o sptz ao oócito, as enzimas quebram as células de cumulus 3 - capacitação – meio: SOF + antibiótico + capacitante heparina e incubar por 1h, pH 7,2 a 7,4 e msom de 240 a 280 e depois coloca na gota de FIV
Contagem de sêmen 1- para definir concetração: solução salina formolizada, câmara de newbauer e sêmen puro, porporção de 1/ 2 – Concentração deve ficar 1x10^ 3 – prepara placa ou poço para FIV, coloca sptz na quantidade calculada e deixa na incubadora por (18 a 22h) a 38°, 5% de CO2 e 99% de umidade.
Fazer desnudamento: retirar células de cumulus podem secretar substancias maléficas por pipetagem por vortex: 50ul de meio e vortexar por 2 minutos, depois lava células e depois finalmente vão para o cultivo in vitro.
Cultivo in vitro CIV 1- transformar presumível zigoto em blastocisto 2- placa de poços (400ul de meio + 100ul de óleo) ou em gotas (50ul de meio), é necessário meio de cultivo + óleo mineral e não podem se misturar 3- incubar em estufa: 5% de CO2, 5% de O2, 90% de N2, elementos que ajudam no metabolismo do meio que é rico em aminoácidos essenciais e não essenciais 4- o cultivo deve demorar uns 7 dias 5- fazer fiinding-alimentação: trocar meio de 2 a 3 dias, tirar metade do meio e repor com um novo e não deixar as células intoxicarem (amônia) 6- deve-se encontrar: 7 dias embriões de 2,4 e 8 células (bloqueio) e descarte pq não chegaram a blastocisto 7- tapete: células da tuba uterina para ajudar no desenvolvimento e embrião por cima (co-cultivo é caro)
OBS.: 1X10^ Cálculos de concentração espermática CE= ______C________ 1/B x N/25 x 1/ Cálculo de volume CEi x vi = CFf x Vf C= total da contagem dos espermatozoides B= fator de diluição ex.: 1: N= números de quadrantes contados 10^