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Ana cristina martins nogueira conduziu uma pesquisa sobre genes que conferem resistência a inibidores da síntese proteica em enterococcus sp originários do ambiente de suiniculturas. Ela investigou a presença de genes de resistência a aminoglicosídeos, tetraciclinas e antibióticos do grupo mlsb em enterococcus sp. As bactérias enterococcus são frequentemente envolvidas em eventos de disseminação horizontal e acumulam e partilham genes de resistência aos antibióticos, tornando-as boas indicadoras de resistência bacteriana a essas moléculas. O uso indiscriminado de antibióticos como avoparcina como promotor de crescimento animal selecionou fora do ambiente hospitalar a presença de enterococcus sp resistentes aos glicopéptidos, especulando-se que muitos dos erg associados a infecções nosocomiais provenham do nicho animal. A presença de genes de resistência aos antibióticos em enterococcus sp e seus respectivos genes em valores acima dos desejados é uma preocupação em produção animal.
Tipologia: Provas
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Não perca as partes importantes!
ambiente de suiniculturas.‖
Ana Cristina Martins Nogueira
Pesquisa de genes que conferem resistência a inibidores da síntese proteica em Enterococcus sp oriundos do ambiente de suiniculturas.
Universidade Fernando Pessoa Faculdade de Ciências da Saúde Porto, 2010
ambiente de suiniculturas.‖
ambiente de suiniculturas.‖
Ana Cristina Martins Nogueira Pesquisa de genes que conferem resistência a inibidores da síntese proteica em Enterococcus sp oriundos do ambiente de suiniculturas.
Declaração de Originalidade
Confirmo que este trabalho foi por mim realizado na íntegra e que todo o material proveniente de outras fontes foi devidamente referenciado na sua totalidade.
Ana Cristina Martins Nogueira
Monografia apresentada à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de licenciada em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Prof. Doutora Carla Novais
ambiente de suiniculturas.‖
O presente trabalho resultou de uma colaboração da Universidade Fernando Pessoa, Faculdade das Ciências da Saúde, com o REQUIMTE grupo Micro (Faculdade Farmácia da Universidade do Porto).
ambiente de suiniculturas.‖
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a algumas pessoas, sem as quais não teria sido possível realizar o trabalho.
À Universidade Fernando Pessoa, Faculdade das Ciências da Saúde, pelo apoio financeiro que disponibilizou, tornando possível a parte experimental do presente estudo, assim como as instalações e material.
Ao REQUIMTE grupo Micro (Faculdade Farmácia da Universidade do Porto), por toda a colaboração que prestaram para com o presente estudo.
À Prof. Doutora Carla Novais, pela ajuda e disponibilidade que demonstrou em todo o trabalho.
Ao Dr. Ricardo Silva, técnico do laboratório de investigação que me apoiou em alguns momentos da parte experimental do trabalho.
ambiente de suiniculturas.‖
Índice
1. Introdução ........................................................................................................... 1.1. Enterococcus sp: características gerais e importância clínica ...................... 1.2. O ambiente de produção animal como reservatório de microorganismos resistentes aos antibióticos ........................................................................... 1.3. Aminoglicosídeos, Tetraciclinas e Macrólidos, Lincosaminas e Estreptograminas do grupo B ....................................................................... 1.3.1. Mecanismos de acção ............................................................................. 1.3.1.1. Aminoglicosídeos ............................................................................... 1.3.1.2. Tetraciclinas ....................................................................................... 1.3.1.3. Macrólidos, Lincosaminas e Estreptograminas do grupo B ............. 1.3.2. Mecanismos de resistência ...................................................................... 1.3.2.1 Aminoglicosídeos ............................................................................... 1.3.2.2 Tetraciclinas ....................................................................................... 1.3.2.3 Macrólidos, Lincosaminas e Estreptograminas do grupo B .............. 2. Objectivos ........................................................................................................... 3. Material e métodos ............................................................................................. 3.1. Bactérias incluídas no estudo ....................................................................... 3.2. Pesquisa de genes de resistência a Aminoglicosídeos, Tetraciclinas e a Antibióticos do grupo MLSB ....................................................................... 3.2.1 Condições de amplificação ........................................................................ 3.2.2 Visualização dos produtos de amplificação .............................................. 4. Resultados .............................................................................................................
ambiente de suiniculturas.‖
Índice de Tabelas e Figuras
Tabela 1. Sequência nucleotídica dos primers utilizados nas reacções de PCR ...........
Tabela 2. Condições utilizadas para amplificação dos genes que conferem resistência a aminoglicosídeos .........................................................................................................
Tabela 3. Condições utilizadas para amplificação dos genes que conferem resistência às Tetraciclinas ...............................................................................................................
Tabela 4. Condições utilizadas para amplificação dos genes que conferem resistência aos Macrólidos ................................................................................................................
Tabela 5. Distribuição dos genes tet M, tet L, tet S e erm B por isolados com diferentes susceptibilidades às Tetraciclinas e aos Macrólidos ......................................................
Tabela 6. Combinações de genes predominantes nas suiniculturas estudadas ..............
Figura 1: Mecanismo de acção dos aminoglicosídeos ..................................................
Figura 2: Mecanismo de acção das Tetraciclinas ..........................................................
Figura 3: Mecanismo de acção dos MLSB ....................................................................
Figura 4: Incidência dos diferentes genes nas suiniculturas em estudo ........................
Figura 5. Distribuição dos genes observados pelas diferentes espécies ........................
Figura 6. Reacções de PCR representativas da amplificação dos genes obtidos que codificam para a resistência a macrólidos (A), tetraciclinas (B e C) e aminoglicosídeos (D) ......................................................................................................
ambiente de suiniculturas.‖
Lista de abreviaturas
AAD - Adeniltransferases
AAC - Acetiltransferases
APH – Fosfotransferases
ERG - Enterococcus sp resistente aos glicopéptidos
LAP - Leucina Aminopeptidase
MFS - Major Facilitator Superfamily
MLSB - Macrólidos, Lincosamidas e Estreptograminas do grupo B
PCR - Polimerase Chain Reaction
PYR – Pirrolidonil Arilamidase
ambiente de suiniculturas.‖
1.2. O ambiente de produção animal como reservatório de microrganismos resistentes aos antibióticos
O desenvolvimento de resistências aos antibióticos está associado a mutações espontâneas e à transferência horizontal de elementos genéticos móveis e mobilizáveis que possuem determinados genes. Estes eventos conferem variabilidade genética aos microrganismos, vantajosa em ambientes com elevada pressão selectiva (Chopra, I. et al. 2001).
O uso generalizado de antibióticos no ambiente de produção animal, como agentes terapêuticos veterinários, profiláticos ou promotores de crescimento tem, nos últimos 50 anos, seleccionado isolados bacterianos com resistência múltipla. Muitas destas moléculas são mal absorvidas a nível gastrointestinal, sendo excretadas praticamente inalteradas nas fezes. Este fenómeno conduz à sua acumulação no meio ambiente e à contaminação do homem e outros seres vivos (Chee-Sanford, J.C. et al. 2001; Casewell et al, 2002).
Tem sido proposto que os microrganismos resistentes aos antibióticos e/ou os seus elementos genéticos (plasmídeos, integrões, transposões) portadores de genes de resistência podem passar para os humanos através da cadeia alimentar ou por contacto directo com os animais, constituindo este problema um desafio à saúde pública. (Aarestrup, F.M. et al. 2001). Esta preocupação está não só associada a bactérias zoonóticas patogénicas mas também a bactérias comensais como Enterococcus sp e Escherichia coli (Casewell, M. et al 2002). Suínos, aves, bovinos, peixes e outros animais associados à produção intensiva podem ser reservatório de várias famílias e géneros bacterianos ( Enterobacteriaceae , Staphylococcus spp, Salmonella spp., Campylobacter spp., entre outros) e de uma diversidade de elementos genéticos (genes vários, plasmídeos, integrões e transposões) associados à resistência aos antibióticos (Antunes, P. e al 2006; Wegener, H et al. 1999). Por exemplo, em estudos realizados em Portugal com Salmonella verificou-se que os isolados de origem animal possuíam uma maior incidência de resistência aos antibióticos do que isolados de origem humana. Entre estas resistências encontram-se aquelas associadas aos antibióticos tetraciclina, estreptomicina, ampicilina e sulfonamidas. Tal facto não é de surpreender, uma vez que estes antibióticos têm sido muito utilizadas na produção animal em Portugal e em outros países (Antunes, P. et al 2006; Antunes, P. et al 2004; Casewell, M. et al 2002). Outros estudos
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europeus, verificaram que o uso indiscriminado de avoparcina como promotor de crescimento animal, até 1997, seleccionou fora do ambiente hospitalar a presença de Enterococcus sp resistentes aos glicopéptidos (ERG), especulando-se que muitos dos ERG associados a infecções nosocomiais provinham do nicho animal (Wegener, H. 2003; Johnsen, P. et al. 2004; Novais, C. et al 2005; Donabelian, S. et al 2003). Alguns estudos relatam o aparecimento dos mesmos elementos genéticos quer em isolados de animais quer em isolados de humanos. Por exemplo, um clone de Salmonella Typhimurium possuindo um integrão com OXA-30 que confere resistência aos antibióticos β-lactâmicos foi encontrado nestes dois nichos ecológicos (Antunes, P. e al 2004). O mesmo clone de Enterococcus sp com resistência à gentamicina foi observado em isolados de aves para consumo humano e em fezes de humanos saudáveis (Novais, C. et al 2006). Muitos outros exemplos podem ser encontrados na literatura (Donabedian, S. et al 2003; Johnsen, P. et al 2004; Aaerestrup, F. et al 2000).
Vários estudos também evidenciaram o impacto dos antibióticos no meio ambiente, registando-se a presença de várias moléculas (Ex: tetraciclinas, macrólidos, glicopéptideos, aminoglicosídeos), em amostras de águas subterrâneas, solos, vegetação que se encontram nas imediações de ambientes de produção animal (Chee-Sanford, J.C. et al. 2001).
O possível impacto dos antibióticos e das bactérias resistentes na saúde pública, ao longo das últimas duas décadas, impeliu a União Europeia a abolir progressivamente a utilização de antibióticos como promotores do crescimento animal, tendo este processo culminado em Janeiro de 2006 (Regulamento EC nº1831/2003 do Parlamento Europeu).
No entanto, o aumento de infecções verificadas nos animais levou a um aumento da quantidade de antibióticos usada como agentes veterinários. De facto, países como a Dinamarca consumiram 121,1 toneladas de antibióticos na produção animal em 2007, nomeadamente tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrólidos, penicilinas, cefalosporinas de 2ª e de 3ª geração (DANMAP, 2007). O último documento do INFARMED (INFARMED, 2007) também registou em Portugal um consumo de 166287,9 toneladas de antibióticos para uso animal onde se destacam moléculas como a oxitetraciclina, doxiciclina e colistina. Este elevado consumo em diferentes regiões geográficas faz com que ainda possamos encontrar na
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1.3. Aminoglicosídeos, Tetraciclinas e Macrólidos, Lincosamidas e Estreptograminas do grupo B
1.3.1. Mecanismos de acção 1.3.1.1. Aminoglicosídeos Os aminoglicosídeos são antibióticos inibidores da síntese proteica, muito utilizados para o tratamento de infecções graves provocadas por bactérias de Gram positivo (Ex: Enterococcus sp) e de Gram negativo (Ex: Enterobacteriaceae , Pseudomonas ), normalmente em associação com antibióticos anti-parietais. Após atingirem o citoplasma bacteriano, por transporte activo dependente de energia, ligam-se à subunidade 30S ribossomal, induzindo uma alteração da síntese proteica e a criação de proteínas anómalas non sense associadas a uma alteração da permeabilidade celular (Figura 1), o que justifica o seu mecanismo bactericida (Hermann, T. 2007; Osswald, W. et al 2001).
Figura 1 : Mecanismo de acção dos aminoglicosídeos (figura adaptada de pathmicro.med.sc.edu/pptbact2002/Antibioticsmayer.ppt)
Na terapêutica os aminoglicosídeos usam-se, na forma salificada, quer em humanos quer em animais por via endovenosa ou via intramuscular, uma vez que estes em meio fisiológico comportam-se como policatiões, sendo absorvidos em cerca de 1% e penetrando na célula num grau muito diminuído (Sousa, J. 2005).
As moléculas de aminoglicosídeos mais utilizadas na terapêutica de infecções provocadas por microorganismos que lhes são sensíveis são a estreptomicina, neomicina, paromomicina, canamicina e gentamicina (Osswald, W. et al 2001).
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1.3.1.2. Tetraciclinas
Em 1947, foram descobertas as tetraciclinas e desde então esta família de antibióticos é amplamente utilizada no tratamento de um grande leque de microorganismos de Gram positivo e de Gram negativo. A sua capacidade de atingir concentrações terapêuticas dentro das células eucariótas faz com que pertençam ao reduzido número de antibióticos usados no tratamento de microrganismos intracelulares (Ex: Listeria monocytogenes, Chlamydia spp , Rickettsiae) (Sousa, J. 2005). As suas propriedades antimicrobianas, reduzida toxidade, baixo custo e fácil aplicação fazem com que as tetraciclinas sejam largamente consumidas quer em medicina humana quer em veterinária (Chopra, I. et al. 2001). A principal via de administração das tetraciclinas, quer no homem quer em animais, é a via oral, embora em medicina veterinária seja muito utilizadas por via intramuscular (Chopra, I. et al. 2001; Osswald, W. et al 2001).
As tetraciclinas inibem primariamente a síntese proteica bacteriana, actuando com grande afinidade ao nível da subunidade 30S ribossomal (Figura 2). Especificamente impedem a ligação do aminoacil-tRNA com o ribossoma bacteriano evitando o crescimento da cadeia peptídica. O facto de apenas inibirem o crescimento bacteriano faz deles antibióticos bacteriostáticos (Chopra, I. et al. 2001, Sousa, J. 2005; Auto, H. et al 1980).
Alguns exemplos deste grupo de antibiótico são a tetraciclina, oxitetraciclina, clorotetraciclina, doxiclina e minociclina. (Osswald, W. et al 2001).
Figura 2 : Mecanismo de acção das Tetraciclinas (figura adaptada de pathmicro.med.sc.edu/pptbact2002/Antibioticsmayer.ppt)
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Dentro das famílias de MLSB, os macrólidos são os mais consumidos quer em medicina humana quer em medicina veterinária.
Este grupo de antibióticos, a nível humano, é mal absorvido a nível gástrico, por este facto as preparações destes fármacos têm de possuir um revestimento gastroresistente, o que permite a sua dissociação no intestino delgado e posterior absorção. Outra das formas utilizadas para solucionar este inconveniente é a utilização por via oral de formas salificadas (ex: estearatos, succinatos). Em Medicina veterinária, estes antibióticos são maioritariamente administrados por via intramuscular. Os macrólidos mais utilizados são a eritromicina, claritromicina, azitromicina. (Sousa, J. 2005; Auto, H. et al 1980; Osswald, W. et al 2001).
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1.3.2. Mecanismos de resistência São vários os mecanismos de resistência que as bactérias podem adquirir e/ou desenvolver. De uma forma generalizada eles podem ser divididos em:
Naturais
Este tipo de resistências é característico em todas as estirpes da mesma espécie. Por exemplo, a maioria das bactérias de Gram negativo são resistentes a moléculas de elevado peso molecular (ex: vancomicina, daptomicina) uma vez que estas não conseguem atravessar os canais de porina localizados na membrana externa (Auto, H.et al 1980; Sousa, J. 2001).
Adquiridas
É um tipo de resistência bacteriana que aparece apenas em algumas estirpes de uma dada espécie. Estirpes bacterianas que no seu estado selvagem eram susceptíveis a um dado antibiótico e que devido à alteração do seu DNA e/ou à aquisição de determinados elementos genéticos portadores de genes de resistência, deixam de ser susceptíveis aos antibióticos.
As resistências adquiridas devem-se a modificações genéticas por:
o Mutação
Caracteriza-se pela modificação nucleotídica de uma sequência genómica que leva a alterações proteicas e, consequentemente à alteração do alvo do antibiótico ou de canais de transporte.
o Aquisição exógena de DNA (transformação, transdução, conjugação)
Algumas bactérias adquirem elementos genéticos de outras bactérias vizinhas, que lhe transmitem uma porção de DNA com genes que conferem resistência aos antibióticos.
