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Um estudo sobre a importância dos receptores adrenérgicos β1 e β2 na termogênese induzida pelo frio e na obesidade em camundongos. O estudo compara animais selvagens e genéticamente modificados com deficiência de receptores adrenérgicos β1 e β2, tratados com dieta padrão ou hipercalórica. Os resultados mostram que a ausência de um ou ambos os receptores altera a termogênese e a obesidade desses animais.
Tipologia: Slides
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Candidato(a): Cintia Bagne Ueta.
Título da Tese: Papel dos receptores adrenérgicos β 1 e β 2 na termogênese facultativa.
Orientador(a): Profª Dra. Cecília Helena Azevedo Gouveia.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada a .............../................./................., ( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome: ................................................................................................... Instituição: .............................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome: ................................................................................................... Instituição: .............................................................................................
Presidente: Assinatura: ............................................................................................ Nome: .................................................................................................. Instituição: .............................................................................................
Dedico este trabalho aos meus pais, em quem eu sempre me inspirei e que foram fundamentais para que eu pudesse me tornar a pessoa que sou hoje.
A Deus, pai, fonte de amor, por ter me abençoado e me dado sabedoria;
À Profa. Dra. Miriam Oliveira Ribeiro, que me orienta desde a minha iniciação científica, pelos valiosos ensinamentos, pela dedicação e amizade, por ter acreditado no meu potencial, por ter me dado a oportunidade e o prazer de trabalhar neste importante projeto;
Ao Prof. Dr. Newton Sabino Canteras, que me acolheu no programa de pós-graduação, a fim de que eu pudesse realizar meu mestrado pelo departamento de anatomia;
À Profa. Dra. Cecília H. A. G. Ferreira, por me aceitar como aluna, por ter permitido a utilização de seu laboratório para a realização de alguns experimentos e pelo auxílio no encaminhamento de meu projeto à FAPESP;
À Profa. Dra. Patrícia Brum, que gentilmente forneceu os animais para que esse projeto fosse realizado;
Ao Prof. Anselmo Moriscot, por ter permitido a utilização de seu laboratório para o desenvolvimento do PCR.
À Profa. Maria Luiza Barreto de Chávez, pelos preciosos ensinamentos de anatomia humana e por ter permitido o uso de seu laboratório para a realização de alguns experimentos;
Aos meus colegas do Mackenzie, por toda a ajuda e pelos momentos de descontração e amizade;
Aos meus colegas da USP que tiveram paciência de me ensinar e que se tornaram grandes amigos: Tatiana Fonseca, Cris Costa, Eduardo Beber, Fátima Freitas, Beatriz Amorim, Luciane Capelo e Marcelo Christoffollete. Obrigada por toda ajuda, dedicação e momentos de descontração;
A todos do departamento de anatomia, que, de alguma forma, me ajudaram na realização projeto;
À minha irmã querida Gizela, pelo carinho, pela amizade e pela paciência de ouvir sobre o meu projeto mesmo sem entender o assunto;
Ao João Bosco, por todo amor, dedicação, paciência e ajuda;
Aos meus pais, Elizabeth e Ademar, que, com amor e dedicação, sempre me incentivaram e me ajudaram a lutar pelos meus objetivos;
À FAPESP, pelo financiamento do projeto e pela bolsa de estudos.
UETA, C.B. Papel dos receptores adrenérgicos β 1 e β 2 na termogênese facultativa. 2009. 72f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.
O tecido adiposo marrom (BAT), principal sítio de termogênese facultativa, é ativado pela liberação de noradrenalina (NE) pelo Sistema Nervoso Simpático, que se liga aos receptores adrenérgicos β 1 , β 2 e β 3 expressos nos adipócitos marrons. Animais com nocaute das três isoformas de receptor adrenérgico β (TKO) são obesos e sensíveis ao frio, demonstrando que estes receptores estão envolvidos na manutenção do peso corporal e na regulação da temperatura central. No entanto, ainda não é claro qual o papel de cada isoforma nestes processos. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel das isoformas β 1 e β 2 na mediação da termogênese facultativa induzida pela dieta e na termogênese induzia pelo frio. Para tanto, camundongos com nocaute para o receptor adrenérgico β 1 (KOβ 1 ) e camundongos com nocaute para o receptor β 2 (KOβ 2 ) foram tratados com dieta hipercalórica por 22 semanas. Os resultados obtidos mostram que os animais KOβ 1 e KOβ 2 tratados com dieta hipercalórica não desenvolvem obesidade mais severa do que os animais selvagens, como comprovado pela medida de peso corporal e determinação da composição corporal. Porém não são capazes de aumentar o consumo de oxigênio induzido pela dieta, sugerindo que esses receptores apresentam papel relevante nessa resposta fisiológica. Essa resistência ao desenvolvimento da obesidade sugere que os receptores β 1 e β 2 não medeiam a termogênese facultativa induzida pela dieta, embora haja a possibilidade de existirem mecanismos compensatórios nesses animais. Por outro lado, a presença do receptor β 1 é exigida para termogênese induzida pelo frio, uma vez que os camundongos KOβ 1 são sensíveis ao frio e a capacidade termogênica do BAT desses animais em reposta à NE é bastante reduzida quando comparados com animais selvagens. A ausência do receptor β 2 não piora a resposta dos animais ao frio sugerindo que essa isoforma não esteja envolvida na termogênese induzida pela dieta ou pelo frio. Em conclusão, este estudo indica que o receptor adrenérgico β 1 é fundamental na termogênese induzida pelo frio, mas não na termogênese induzida pela dieta. Além disso, é provável que a termogênese induzida pela dieta seja regulada por mecanismos distintos da termogênese induzida pelo frio.
Palavras Chaves : Receptores adrenérgicos β. Nocaute. Termogênese facultative. BAT.
UETA, C.B. Role of adrenergic receptor β 1 and β 2 in diet- or cold-induced thermogenesis.
Brown adipose tissue (BAT) is the main site of facultative thermogenesis and is activated by signaling of β 1 , β 2 e β 3 adrenergic receptors by norepinephrine (NE) released by Sympathetic Nervous System. Previous studies have shown that animals with knockout for all β adrenergic receptor (TKO) are obese and cold intolerant. These data indicates that these β adrenergic receptors are involved in the development of obesity and body temperature regulation. Nonetheless, it is unclear the role of each isoform in these process. Therefore, the purpose of this study was to evaluate the role of isoforms β 1 and β 2 in mediate diet-induced thermogenesis and cold-induced thermogenesis. For that, knockout mice for the adrenergic receptor β 1 (KOβ 1 ) and knockout mice for the adrenergic receptor β 2 (KOβ 2 ) were fed with high fat diet for 22 weeks. The results obtained showed that the animals KOβ 1 and KOβ 2 treated with high fat diet did not develop more severe obesity when compared to wild type animals, as evidenced by the measure of body weight and determination of body composition. However, they were unable to increase the oxygen consumption induced by diet, suggesting that these receptors have important role in this physiological response. This resistance to the development of obesity suggests that β 2 and β 1 isoform do not mediate diet- induced thermogenesis, although there is a possibility that there are compensatory mechanisms in these animals. These results suggest that the adrenergic receptors β 1 and β 2 do not mediate the facultative thermogenesis induced by diet. Furthermore, the presence of the β 1 receptor is required for cold-induced thermogenesis, since the KOβ 1 mice are sensitive to cold and BAT thermogenic response is significantly impaired when compared to wild type animals. The absence of β 2 receptor does not worsen the response of animals to cold, suggesting that this isoform is not involved in the diet- or cold-induced thermogenesis. In conclusion, this study indicates that the β 1 isoform of the adrenergic receptor is critical in the cold-induced thermogenesis, but not in diet-induced thermogenesis. Moreover, it is likely that the diet-induced thermogenesis and cold-induced thermogenesis are regulated by different mechanisms.
Key-words: β adrenergic receptor. knockout. Facultative thermogenesis. BAT.
Figura 16. Níveis plasmáticos de colesterol dos camundongos C57 e KOβ 1 tratados com dieta padrão ou com dieta hipercalórica..................................................................
Figura 17. Níveis plasmáticos de triglicérides dos camundongos C57 e KOβ 1 tratados com dieta padrão ou com dieta hipercalórica..........................................................
Figura 18. Níveis plasmáticos de colesterol dos camundongos FVB e KOβ 2 tratados com dieta padrão ou com dieta hipercalórica.........................................................
Figura 19. Níveis plasmáticos de triglicérides dos camundongos FVB e KOβ 2 tratados com dieta padrão ou com dieta hipercalórica..........................................................
Figura 20. Exposição ao frio dos camundongos C57 e KOβ 1 ..................................................
Figura 21. Queda da temperatura corporal após 3 horas de exposição ao frio dos camundongos C57 e KOβ 1 ...............................................................................
Figura 22. Exposição ao frio dos camundongos FVB e KOβ 2 ...............................................
Figura 23. Queda da temperatura corporal após 3 horas de exposição do frio dos camundongos FVB e KOβ 2 ..............................................................................
Figura 24. Consumo de oxigênio dos camundongos C57 e KOβ 1 durante exposição a diferentes temperaturas.......................................................................................
Figura 25. Consumo de oxigênio dos camundongos FVB e KOβ 2 durante exposição a diferentes temperaturas.......................................................................................
Figura 26. Delta da temperatura do BAT após infusão de NE nos camundongos C57 e KOβ 1 .......................................................................................................................
Figura 27. Delta da temperatura do BAT após infusão de NE nos camundongos FVB e KOβ 2 .......................................................................................................................
Figura 28. Delta da temperatura do BAT após infusão de Dobutamina nos camundongos C57 e KOβ 1 .............................................................................................................
Figura 29. Delta da temperatura do BAT após infusão de Dobutamina nos camundongos FVB e KOβ 2 ...........................................................................................................
Figura 30. Níveis de RNAm do receptor adrenérgico β 2 no BAT de camundongos C57 e KOβ 1 tratados com dieta padrão ou hipercalórica..................................................
Figura 31. Níveis de RNAm do receptor adrenérgico β 3 no BAT de camundongos C e KOβ 1 tratados com dieta padrão ou hipercalórica................................................
Figura 32. Níveis de RNAm do receptor adrenérgico β 3 no BAT de camundongos FVB e KOβ 2 tratados com dieta padrão ou hipercalórica.................................................
Lista de Tabelas
Tabela 1. Sequências dos primers para PCR em tempo real...................................................
CL-316,243- agonista seletivo para a isoforma β 3 DNAc - ácido desoxirribonucléico complementar RNA - ácido ribonucléico RNAm - ácido ribonucléico mensageiro PCR - reação de Polimerização em cadeia TRβ- receptor de hormônio tireoideano β TRα - receptor de hormônio tireoideanoα T3- hormônio triiodotironina GTT - teste de tolerância a glicose ITT - teste de tolerância a insulina H + - próton hidrogênio
1.1 Termogênese
A geração de calor pela queima de calorias está envolvida em vários vários processos fisiológicos, incluindo a regulação da temperatura corporal, metabolismo, peso corporal e balanço energético. Animais homeotérmicos apresentam significativa ineficiência termodinâmica na utilização da energia metabólica que resulta na liberação de calor e se valem dessa ineficiência intrínseca a fim de manter sua temperatura corporal constante (BIANCO, 2005). A quantidade de calor liberado por um organismo em repouso, não realizando digestão e a termoneutralidade (~28° C para seres humanos adultos), pode ser calculada a partir da medida do calor perdido para o ambiente (calorimetria direta) ou através do consumo de oxigênio (calorimetria indireta). É chamada de termogênese obrigatória (SILVA, 1995). O gasto energético de repouso aumenta de forma significativa em resposta a mudanças ambientais ou comportamentais, tais como alterações na temperatura ambiente e/ou ingestão de alimentos. A capacidade dos mamíferos de aumentar a liberação de calor sob demanda é chamada de termogênese facultativa, também chamada termogênese química ou adaptativa (para revisão ver LOWELL e SPIEGELMAN, 2000).
1.1.1 Tecido adiposo marrom e UCP-
O BAT é o mais importante sítio de termogênese química ( non-shivering thermogenesis ) presente em pequenos mamíferos durante todas as idades e em seres humanos principalmente nos primeiros meses de vida (CANNON e NEDERGAARD, 1985; HIMMS-HAGEN, 1985; NICHOLLS e LOCKE, 1984). Recentemente, no entanto, foi demonstrado que seres humanos adultos também podem apresentar tecido adiposo marrom com todas as características morfológicas e fisiológicas descritas no órgão adiposo de pequenos mamíferos, apresentando-se principalmente na região supraclavicular e cervical, com regulação similar a dos roedores. (CINTI, 2006; NEDERGAARD et al , 2007). A relação entre superfície e volume (S/V) no corpo humano é inteiramente diferente dos pequenos mamíferos e, desta forma, a termodispersão é significativamente menor em humanos que em roedores, o que justificaria a reduzida necessidade do BAT em humanos adultos. No entanto, a atividade do BAT em humanos
adultos pode desempenhar um importante papel no metabolismo (NEDERGAARD; BENDTSSON; CANNON, 2007). A identificação de tecido adiposo marrom em humanos abre um grande leque de possibilidades no tratamento da obesidade. A compreensão dos mecanismos que regulam a atividade desse tecido em humanos pode resultar em formas de estimular o gasto energético e, consequentemente, reduzir o peso corporal. Uma possibilidade seria a ativação seletiva dos receptores adrenérgicos β 3 que são expressos no BAT e no WAT, mas não em outros tecidos. A descoberta de uma droga altamente seletiva para essa isoforma, ocasionaria a estimulação da lipólise sem causar os efeitos indesejáveis dos outros receptores adrenérgicos β 1 e β 2.
1.1.2 Mecanismo de ação dos receptores adrenérgicos β no BAT
O mecanismo bioquímico pelo qual o BAT gera calor envolve a expressão da proteína desacopladora, a UCP-1, presente no interior da membrana mitocondrial (CANNON et al , 1982; NICHOLLS e LOCKE, 1984). A estimulação do BAT se dá pelo Sistema Nervoso Simpático (SNS), através da liberação de noradrenalina (NE). No adipócito marrom maduro, a NE interage com diferentes subtipos de receptor adrenérgico que estão associados com a ativação de diferentes vias de sinalização. A estimulação dos receptores adrenérgicos β ativa a proteína G estimulatória, com consequente amplificação do AMPc e ativação da PKA. A PKA, por sua vez, ativa a lipase hormônio sensível (LHS) que quebra os triglicerídeos das células adiposas, liberando glicerol e ácidos graxos. Esses ácidos graxos servem como substrato para o ciclo de Krebs, com consequente liberação de hidrogênios que são carreados pelas flavoproteínas na forma reduzida (NADH e FADH 2 ) e bombeados pela cadeia respiratória para o espaço intermembranoso mitocondrial, criando um gradiente de prótons. Esses prótons podem retornar a matriz mitocondrial pela ATPase com consequente síntese de ATP. No BAT a UCP-1 constitui uma via alternativa ao retorno desses prótons para a matriz mitocondrial, onde os ácidos graxos deslocam o nucleotídeo GDP da UCP-1 (desacoplamento) e a energia do gradiente eletroquímico é dissipada na forma de calor aquecendo o corpo (Figura 1). Para compensar essa liberação de prótons, a célula aumenta o consumo de oxigênio para manter a síntese de ATP pela célula (JANSKÝ, 1995; LOWELL e SPIEGELMAN,
