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Biodiversidade, adaptação, enzimas, aplicações biotecnológicas e outros assuntos
Tipologia: Teses (TCC)
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Lyudmila Krasimirova Trilova TRABAJO FIN DE GRADO 20TFG Grado en Biología, Universidad de Salamanca Junio, 2020
ÍNDICE ABSTRACT……………………………………………………….. Pág. 3
1. Biodiversidad de extremófilos…………………………………… Pág 5 ● Categorías de extremófilos ● Distribución de los extremófilos 2. Adaptaciones a ambientes extremos…………………………….. Pág 8 ● Adaptaciones proteicas y otras a los ambientes extremos 3. Extremozimas y potencial industrial……………………………. Pág 14 ● Ejemplos específicos 4. Aplicaciones biotecnológicas y problemas causados por los extremófilos………………………………………………. Pág 17 ● Industria farmacéutica, cosmética y textil ● Industria alimentaria ● Medio ambiente y agricultura ● Medicina ● Ocio ● Radioprotección ● Biocombustibles 5. Conclusiones………………………………………………………. Pág 23 6. Bibliografía……………………………………………………….... Pág 24
processes and discover new more efficient processes, understand better both the origin and the limit of life, but they also have enough potential to produce a huge impact in our future lives, for example, with the development of biofuels. Key words: extremophile - extremozymes - biotechnology - adaptation
1. Biodiversidad de extremófilos
En primer lugar, es importante destacar que los extremófilos son “extremos” desde un punto de vista humano. Se han encontrado en ambientes inhabitables para los humanos, donde no solo habitan sino que crecen y prosperan en esas condiciones extremas, hasta el punto de ser sus nichos preferidos. Los extremófilos no solo pueden sobrevivir y tolerar estas condiciones extremas, también han sido capaces de desarrollar numerosas adaptaciones y evolucionar donde otros organismos no han sido capaces (Coker, 2019).
Existen extremófilos en todos los dominios de la vida. Tenemos extremófilos que pertenecen al dominio Bacteria, como puede ser Psychromonas ingrahamii , muchos ejemplos del dominio Archaea, como Haloferax volcanii, pero incluso tenemos representantes del dominio Eukarya, como pueden ser algunas algas o los conocidos tardígrados. Sin embargo, la gran mayoría son microorganismos procariotas, bacterias y arqueas, como es de esperar al ser los grupos más abundantes. A pesar de que la mayoría aún permanecen desconocidos, los humanos se han beneficiado de estos organismos de muchas formas, y aún así les queda mucho más por ofrecer (Coker, 2019).
● Categorías de extremófilos Los extremófilos existen en un amplio abanico de condiciones ambientales y tienen algunas capacidades metabólicas únicas y/o estructuras físicas para poder sobrevivir. Resulta interesante comprender como estos microorganismos usan varios sustratos y rutas metabólicas para prosperar y sobrevivir (Rampelotto, 2016). En la Figura 1 podemos observar las condiciones a las que están adaptados los diferentes tipos de extremófilos en comparación con los microorganismos mesófilos que conocemos habitualmente (Schröder, 2020). Las condiciones extremas que toleran y resisten son las siguientes :
moderadamente termófila (38-57 ºC), y con una gran tolerancia a arsénico (Horikoshi, 2010).
● Distribución de los extremófilos Los ambientes extremos existentes en La Tierra han aumentado en las últimas dos décadas coincidiendo con el desarrollo económico e industrial de nuestras sociedades, de hecho, aún siguen aumentando. Las razones por las que esto ocurre son muy diversas y pueden ser tanto naturales como provocadas. ¿Dónde se encuentran los ambientes extremos? En la Figura 2 tenemos una representación de la diversidad de ambientes extremos (Merino, 2019).
Figura 2. Representación idealizada de una sección de La Tierra mostrando la diversidad de ambientes extremos y su localización aproximada. Observamos ambientes muy dispares entre sí, desde regiones polares hasta volcanes, desiertos, y profundidades marinas (Merino, 2019).
aridez se puede definir como hiper-árido extremo en ocasiones. Ante estas circunstancias, se produce la formación de lagos salinos con agua estancada, que puede ser otro ambiente extremo.
Estas descripciones incluyen la mayoría de los ecosistemas, que son resultado de procesos naturales a lo largo de un tiempo medido en escala geológica. Sin embargo, en tiempos más recientes, condiciones extremas similares o muy diferentes han sido impuestas como consecuencia del impacto de la actividad humana en el medio ambiente como la minería, la agricultura intensiva... Nuevos ecosistemas extremos se siguen descubriendo e investigando actualmente (Horikoshi, 2010). Este trabajo tiene como objetivo comprender mejor a estos microorganismos un tanto desconocidos que son los extremófilos. Además, pretende revisar trabajos anteriores que evidencian la necesidad de seguir investigando a los extremófilos y así conseguir descubrir el enorme potencial biotecnológico que ofrecen a los humanos, y por supuesto, también evitar los perjuicios que puedan suponer.
2. Adaptaciones a ambientes extremos Cada condición ambiental en particular hace que los organismos adquieran una variedad de adaptaciones, que los hace estables de manera única en ese ambiente concreto. En el caso de los extremófilos es todavía más importante al vivir en condiciones extremas, y por ello han tenido que desarrollar estrategias para evitar el deterioro de sus biomoléculas. Unos de los problemas importantes que pueden tener, es que la fluidez de la membrana disminuye a medida que disminuye la temperatura y que las proteínas se vuelven más rígidas en estas condiciones. Otro problema importante, sería que las
procedente de Thermus thermophilus tiene alteraciones tanto en el núcleo como en los aminoácidos superficiales, lo que hace al pigmento mucho más estable a altas temperaturas. Otro ejemplo lo encontramos en una proteína ribosomal procedente de Thermococcus celer en la que se observó que los residuos aumentaban la capacidad termal de la proteína, mientras que la mutación de las cargas superficiales de la alanina disminuían la capacidad termal.
Una co-adaptación común de los termófilos es a los pH extremos, por lo tanto muchos termófilos van a ser también acidófilos. Sin embargo, esto no tiene porqué cumplirse siempre y un claro ejemplo de ello es Pyrobaculum neutrophilum , una arquea termófila pero no acidófila (Zhang, 2017). Por último, veamos las adaptaciones adicionales a la estabilización de proteínas de un termófilo en concreto, Thermus filiformis. Análisis multi-ómicos permitieron identificar los cambios fisiológicos que seguía este microorganismo buscando la adaptación a la temperatura. Los mecanismos involucrados en la detoxificación de ROS (especies reactivas de oxígeno) por ejemplo, se activan a elevada temperatura para intentar eliminar el exceso de ROS y así disminuir el estrés térmico. Además, Thermus filiformis favorece la síntesis de thermozeaxantinas y thermobiszeaxantinas a elevada temperatura para incrementar la estabilidad de su membrana. El estrés térmico también afecta al metabolismo de carbohidratos. Durante el estrés térmico, T. filiformis redirige el flujo de carbohidrato de la glucólisis a la ruta de las pentosas fosfato para contrarrestar las perturbaciones del estado redox. Además, algunos metabolitos antioxidantes del ciclo TCA (ácidos tricarboxílicos) son acumulados a elevada
temperatura, lo que demuestra que la ruta TCA juega un papel importante en la protección celular contra los ROS en condiciones de estrés (Mandelli, 2017). 2) Halófilos: Viven en medios con condiciones iónicas extremas causadas por la alta concentración de iones de sodio, potasio y otros metales. Como organismos, pueden acumular solutos osmoprotectores, como pueden ser las sales inorgánicas y pequeñas moléculas orgánicas (como por ejemplo aminoácidos y azúcares) en el citoplasma hasta igualar la concentración osmótica externa, y así conseguir evitar el choque osmótico, al exponerse a un medio extremadamente hipertónico. Sin embargo, no es suficiente con evitar el choque osmótico, deben tener proteínas, ácidos nucleicos y otras moléculas capaces de funcionar en esas condiciones. Las adaptaciones más comunes de las proteínas de los halófilos son las siguientes:
I) Crear un potencial de membrana inverso que pueda parcialmente contrarrestar el flujo de protones hacia el interior citoplasmático. Una forma de generar este potencial de membrana inverso es mediante el transporte de potasio. Los transportadores de K+ de tipo ATPasa predominan en el genoma de los acidófilos. II) La membrana celular es muy impermeable a los protones para así retardar el flujo. III) El gradiente de pH se mantiene mediante un exporte activo de protones que realizan los transportadores. IV) Hay una gran cantidad de transportadores secundarios en los genomas acidófilos. Así reducen la demanda energética necesaria para el bombeo. V) Presencia y viabilidad de enzimas y/o compuestos químicos capacidad de secuestrar y unir protones. VI) Análisis comparativo de los genomas sugieren la existencia de una gran proporción de sistemas de reparación de ADN y proteínas en los acidófilos. VII) Los ácidos orgánicos que pueden funcionar como desacopladores en los acidófilos podrían ser degradados por aquellos acidófilos heterótrofos.
Figura 3. A) Adaptaciones de la membrana (I-III): impermeabilidad a H+, exporte activo de H+, y crear un potencial de membrana inverso mediante transporte de K+. B) IV existencia de numerosos transportadores secundarios. C) V Enzimas y compuestos químicos capaces de secuestrar protones. D) VI Sistemas de reparación y proteínas en los acidófilos (Gumulya, 2018).
3. Extremozimas y potencial industrial Desde que comenzó la producción de enzimas de forma masiva y a escala industrial en 1960, los microorganismos han tenido un papel crucial para el descubrimiento y desarrollo de nuevas enzimas para aplicaciones industriales (Sarmiento, 2015). Sin embargo, la síntesis tanto química como enzimática de polímeros, farmacéuticos y diversos productos químicos en la industria requiere procesos, que además de ser costosos, son poco selectivos y producen productos secundarios indeseados. La gran mayoría de las reacciones ocurren bajo condiciones fuertes, incluyendo temperaturas extremadamente altas o bajas, pHs ácidos o básicos, o una elevada salinidad. Las enzimas mesofílicas no suelen ser las más adecuadas para las duras condiciones de las reacciones industriales, ya que no tienen la estabilidad necesaria y son fácilmente desnaturalizadas. En el pasado, el uso de biocatalizadores en reacciones orgánicas solo representaba una pequeña parte del potencial mercado industrial. Existe una clara necesidad de descubrir métodos nuevos (Demirjian, 2001). En la Figura 4 podemos observar el pequeño rango de condiciones de temperatura, pH y concentración, en las que pueden funcionar las enzimas mesofílicas, en comparación con el amplio rango de condiciones que permite la biocatálisis con extremozimas (Elleuche, 2014).
Figura 4. Comparación de las condiciones a las que se puede llevar a cabo la biocatálisis clásica respecto a las condiciones a las que se puede llevar a cabo la biocatálisis utilizando extremozimas (Elleuche, 2014). El descubrimiento de los microorganismos extremófilos y sus enzimas (extremozimas) ha supuesto un gran impacto en el campo de la biocatálisis. Como ya
residuo de lisina de cada monómero. La estructura del núcleo protege los enlaces disulfuro de la reducción. Estas propiedades hacen que la enzima de Thermovibrio resulte adecuada para la captura de dióxido de carbono comercial. 3) Enzima deshalogenasa L-Haloácida de la arquea termofílica Sulfulobus tokadii : La enzima deshalogenasa se ha clonado y sobreexpresado en E.coli y ha sido caracterizada tanto bioquímica como estructuralmente. Las principales aplicaciones de esta enzima son la producción ácido halo-carboxílico quiral y también en biorremediación. Los ácidos halo-carboxílicos quirales son importantes intermediarios en la industria química/farmacéutica. La enzima dehalogenasa de Sulfolobus tiene el potencial para resolver las mezclas racémicas de ácido bromocarboxílico y es capaz de catalizar la conversión de ácido 2-halo-carboxílico en ácidos hidroxialcanoicos, compuestos interesantes para la producción de los PHA, polímeros que se usan para fabricar bioplásticos. 4) Enzima carboxil-esterasa de la bacteria termofílica Thermogutta terrifontis : Las esterasas son enzimas comúnmente usadas en la industria. Esto se debe a su inherente estabilidad en solventes orgánicos y la habilidad de revertir libremente la reacción enzimática de hidrólisis a síntesis mediante la eliminación de agua. Las carboxil-esterasas catalizan la hidrólisis de enlaces éster de substratos hidrosolubles pequeños. Tabla 1. Clasificación de extremozimas y algunas de sus aplicaciones industriales (adaptado de Dumorné, 2017) Tipos Extremozimas Aplicaciones Acidófilos Amilasa, glucoamilasa Producción de almidón Proteasas Alimentación animal para mejorar la digestibilidad Celulasas Eliminar material hemicelulósico del pienso Oxidasas Desulfurización del carbón Alcalófilos Proteasas, celulosa Detergentes, comida y pienso Fermentación de vino y cerveza, elaboración de pan y zumos Halófilos Proteasas Síntesis de péptidos Deshidrogenasas Biocatálisis en medio orgánico Síntesis química asimétrica Psicrófilos Proteasas Detergentes, aplicaciones alimentarias Amilasa Detergentes y pastelería Celulasas Detergentes, pienso y textil
Deshidrogenasas Biosensores Termófilos Lipasa, proteasa Detergentes Producción biodiésel Modificación sabor Amilasas, pululunasas, glucoamilasas, celulasas, xilanasas
Procesamiento de almidón, celulosa, quitina y pectina Hidrólisis de almidón Clarificación de zumos de frutas y verduras Fermentación masa de pastelería Quitanasas Conversión de celulosa en etanol Xinalasas Modificaciones de quitina para alimentación y productos sanitarios Maduración de queso Esterasas Biorremediación, degradación y eliminación de xenobióticos y compuestos tóxicos ADN polimerasas Biología molecular Deshidrogenasas Reacciones oxidativas Manasas Degradación de manosa o gomas
4. Aplicaciones biotecnológicas y problemas causados por los extremófilos Los extremófilos tienen numerosas aplicaciones, pero también causan problemas, como contaminación, corrosión y formación de “biofilms”. Tanto para las aplicaciones como para los problemas, necesitamos conocer los mecanismos de comunicación que usan estos microorganismos para cumplir sus funciones. La comunicación célula a célula (quorum sensing: QS) es esencial para el desarrollo y supervivencia de estos microorganismos en los ambientes extremos en muchos casos. La mayoría de las bacterias confían en el quorum sensing para una expresión génica coordinada a densidades elevadas, que se basa en la producción y detección de moléculas de señalización conocidas como autoinductores. La importancia del QS es ampliamente estudiada en los mesófilos, sin embargo, apenas se conoce como funciona en los extremófilos (Kaur, 2019).
Uno de los problemas que pueden causar los extremófilos es la formación de biofilms termofílicos que causan grandes pérdidas económicas además de contaminación ambiental. Por lo tanto, surge el interés en desarrollar estrategias que interrumpan el quorum sensing del biofilm. Se encontró recientemente, una forma de
puede ser estudiada. Se conseguiría mitigar el daño de la formación de cristales de hielo y promovería el crecimiento en las estaciones con temperaturas frías (Cid, 2016). La restauración de los ambientes contaminados es crucial para el desarrollo sostenible. Los extremófilos pueden ser un importante recurso de biocatalizadores para biorremediación, como el género Pseudomonas (Orellana, 2018). ● Medicina Por ejemplo, se usan proteínas recombinantes anti-congelantes procedentes de Leucosporidium sp. para crio-preservar glóbulos rojos. Proteínas anti-congelantes procedentes de peces se han utilizado también en la ablación de las líneas celulares de tumores subcutáneos en ratas. Aunque solo se ha llevado a cabo a nivel de laboratorio, nos podemos hacer una idea del gran potencial que tienen este tipo de proteínas en la industria médica (Cid, 2016). El agente terapéutico Scytonemin aislado de una cianobacteria marina extremófila Stigonema sp. por Waldo Lake, Oregón y caracterizada como un inhibidor de la proteína serina/treonina kinasa, y muchas otras moléculas de los extremófilos son consideradas de interés para la cura del cáncer y otras enfermedades relacionadas (Kumar, 2010). ● Ocio El uso de Snomax (Telemet, Inc, New York, USA) es una de las aplicaciones más importantes en la industria. Se trata de INPs bacterianas liofilizadas para la producción de nieve artificial. Snomax Technologies cultiva Pseudomonas syringae en un equipo de fermentación. Se congela al microorganismo para obtener como resultado final un derivado, Snomax, una proteína hielo nucleadora muy activa, capaz de convertir gotas de agua salientes de un cañón, en nieve. Si las gotas no contienen un nucleador, la gran mayoría no se transformarían en hielo antes de tocar el suelo (Cochet, 2000) (Telemet). ● Radioprotección Los microorganismos extremófilos y sus nichos son los mejores modelos para obtener moléculas de interés humano para la radioprotección. El INMAS (Institute of Nuclear Medicine and Allied Sciences) está explorando las propiedades funcionales de las biomoléculas procedentes de bacterias radioresistentes, como D. radiodurans , Rubrobacter sp y el alga verde Dunaliella bardawil , para conseguir desarrollar una
biomolécula radioprotectora similar que resulte efectiva en el futuro para humanos. Los estudios desarrollados en INMAS han tenido éxito en animales inferiores que han sido expuestos a radiación gamma. La biomolécula diseñada también fue capaz de proteger los órganos radiosensitivos en modelos murinos. Las probabilidades de supervivencia en ratones irradiados, anteriormente tratados con la droga, se espera que sean mayores comparado con los ratones control (Kumar, 2010). ● Biocombustibles Esta aplicación de los extremófilos, en mi opinión, es la que más atractiva puede resultar. Los biocombustibles pretenden reducir la dependencia de los combustibles fósiles así como reducir la emisión global de gases de efecto invernadero al ambiente. Los biocombustibles, por un lado, son renovables en periodos de tiempo más cortos, y por otro lado, tienen una tasa mayor de octano y combustionan de una forma mucho más eficiente y limpia (Yeoman, 2010). Sin embargo, la producción de biocombustibles de primera generación, basados en la fermentación de la mazorca de maíz y la caña de azúcar, no son ni económicamente ni ecológicamente sostenibles, ya que necesitan grandes extensiones de terreno que compiten con los cultivos de alimentos para consumo humano. Los biocombustibles de segunda generación, que utilizan la lignocelulosa, un compuesto recalcitrante, son mucho más deseables (Tollefson, 2008). En la Figura 5 podemos ver un esquema de los procesos de obtención de biocombustibles (Taylor, 2012). La lignocelulosa consiste en la unión de tres polímeros mayoritarios: celulosa, hemicelulosa y lignina. La unión de las microfibrillas de celulosa resulta en la formación de una gran estructura cristalina. Esta estructura cristalina limita la accesibilidad de las enzimas, y por consiguiente, la eficiencia de la hidrólisis enzimática. Los esfuerzos de investigación de los últimos años, se centran en mejorar la despolimerización de la lignocelulosa, o bien buscar biocatalizadores nuevos. Además, incluye la investigación de enzimas nuevas con actividad específica y menor inhibición por el producto final. Para ser útil a escala industrial, interesa que tengan otras características como por ejemplo, estabilidad térmica o tolerancia a disoluciones que varían en pH, solventes orgánicos, reactivos químicos y oxidativos (Yeoman, 2010). Las enzimas termoestables resultan útiles para la optimización de la deconstrucción de la lignocelulosa a escala de las biorefinerías. Poseen varias ventajas respecto a sus
