Prática de Cultura Microbiológica: Preparação e Observação de Colônias, Slides de Microbiologia

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Microbiologia Médica e Imunologia I

Manual dos Trabalhos Práticos de Laboratório

Maria Cristina Queiroga

Marta Laranjo

Título: Microbiologia Médica e Imunologia I-Manual dos Trabalhos Práticos de Laboratório Autores: Maria Cristina Queiroga Marta Laranjo ISBN: 978 - 972 - 778 - 154 - 6 Edição: 1ª Edição (fevereiro 2020)

• Introdução
• 1 - Ubiquidade Microbiana............................................................................................................ - Introdução - Material - Protocolo experimental - Questionário..........................................................................................................................
• 2 - Métodos de Sementeira........................................................................................................... - Introdução - Material - Protocolo experimental - Questionário........................................................................................................................
• 3 - Observação Microscópica de Bactérias.................................................................................. - Introdução - Material - Protocolo experimental - Questionário........................................................................................................................
• 4 - Propagação de Bactérias Aeróbias - Introdução - Material - Protocolo experimental - Questionário........................................................................................................................
• 5 - Isolamento de Bactérias Aeróbias - Introdução - Protocolo experimental
• 6 - Identificação de Bactérias Aeróbias - Introdução
  • 1. Bacilos Gram-negativo
    • Material
    • Protocolo experimental
  • 2. Cocos Gram-positivo
    • Material
    • Protocolo experimental
    • Interpretação dos resultados dos APIs
    • Questionário........................................................................................................................
• 7 - Identificação Molecular de Bactérias - Introdução - Objetivo
  • Extração de DNA
    • Material
    • Protocolo experimental
  • Reação em Cadeia da Polimerase ( PCR )
    • Material
    • Protocolo experimental
  • Eletroforese em Gel de Agarose
    • Introdução
    • Procedimento Experimental
• 8 - Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos - Introdução - Material - Protocolo experimental - Interpretação dos antibiogramas - Questionário........................................................................................................................
• 9 - Propagação e Isolamento de Bactérias Anaeróbias - Introdução - Material - Protocolo experimental - Questionário........................................................................................................................
• 10 - Quantificação de Populações Bacterianas - Introdução
  • Contagem do Número de Microrganismos Viáveis Totais
    • Material
    • Protocolo experimental
  • Determinação do Número Mais Provável de Coliformes
    • Material
• BIBLIOGRAFIA

Introdução Nas aulas práticas de Microbiologia Médica, através do desenvolvimento dos trabalhos práticos, os alunos aprendem baseados na experiência hands-on , como é recomendado pela European Association of Establishments for Veterinary Education (EAEVE). Estas aulas conferem competências técnicas e científicas aos estudantes, assim como competências comunicacionais de nível científico, adequadas à comunicação de conhecimentos médicos. Este manual é constituído pelas fichas de trabalho das aulas práticas da unidade curricular “Microbiologia Médica e Imunologia I”. As fichas são guias de procedimentos a utilizar nas aulas práticas laboratoriais. No final de cada protocolo, são apresentadas perguntas chave sobre a matéria da aula. Devem responder às perguntas em casa e, no início aula seguinte, cada aluno expõe as suas respostas, seguindo-se uma discussão com todos os alunos e o docente. Nesta altura, o docente corrige cada pergunta, para que fiquem esclarecidos. Aconselha-se que escrevam no manual a resposta certa. Bom trabalho.

ü Com uma zaragatoa fazer uma recolha num dos elementos do grupo (boca, nariz, orelha, couro cabeludo) e mergulhá-la num dos tubos de meio líquido.

4. Incubar as placas invertidas e os tubos na estufa a 37 º C durante 24h.
5. Após o período de incubação, examinar as placas e os tubos, anotando: ü O número e diferentes tipos de colónias que se desenvolveram nos meios sólidos ü O grau e tipo de turvação dos tubos com meio líquido
6. Observar o aspeto das diferentes colónias relativamente a: ü dimensão (diâmetro, expresso em milímetros) ü forma (circular, oval, lenticular, irregular, rizoide, ...) ü margem (inteira, ondulada, lobada, ...) ü elevação (plana, elevada, convexa, ...) ü superfície (lisa, rugosa, ondulada, granulosa, baça, brilhante, ...) ü características óticas (opaca, translúcida, opalescente, iridescente, ...) ü consistência (seca, mucoide, pulverulenta, ...) ü cor (branca, amarela, esverdeada, ...

Questionário

1. O que é uma colónia bacteriana? O que é uma unidade formadora de colónia (UFC)?
2. Qual a importância e significado prático da ubiquidade microbiana?
3. Quais as precauções a tomar para controlar os possíveis contaminantes de laboratório?
4. Quais os meios de esterilização mais frequentemente utilizados na rotina laboratorial?

Protocolo experimental

TRANSFERÊNCIA DE CULTURA EM MEIO LÍQUIDO PARA MEIO SÓLIDO

Ø Inoculação à superfície v Esgotamento ü Por estria – com uma ansa esterilizada, recolher uma ansa cheia de cultura em meio líquido (inóculo), espalhar numa pequena área do meio sólido, junto á borda da placa, constituindo assim o reservatório. A partir daqui traçar estrias paralelas com a ansa. ü Com semeador de vidro (ou descartável) – com uma pipeta de Pasteur esterilizada, recolher uma gota de inóculo, deitar numa placa com meio sólido, espalhar com o semeador. Com o mesmo semeador, voltar a passar numa segunda placa, e depois, da mesma forma, numa terceira placa. Ø Inoculação em profundidade ü Por incorporação – Numa placa de Petri esterilizada, deitar uma porção (por ex: 1 ml) de cultura em meio líquido. Deitar o meio sólido fundido e arrefecido a cerca de 50ºC. Rodar a placa para misturar bem o inóculo com o meio de cultura, mas com cuidado para a mistura não tocar na tampa. TRANSFERÊNCIA DE MEIO SÓLIDO PARA MEIO SÓLIDO Os métodos utilizados neste tipo de transferência são os mesmos que se utilizam na transferência meio líquido-meio sólido, mas o inóculo é constituído por um pouco de cultura em meio sólido, que é recolhido utilizando a ansa, o fio ou a zaragatoa. Ø Inoculação à superfície v Esgotamento por estria v Sementeira em toalha – utilizar uma zaragatoa esterilizada. Recolher uma colónia e fazer uma suspensão em soro fisiológico. Inocular o meio sólido, passando a zaragatoa segundo várias direções, de forma a se obter uma cultura homogénea. v Ø Inoculação em profundidade v Por picada – recolher uma colónia bem isolada e inocular em meio sólido contido num tubo de ensaio, espalhando a cultura na rampa e, por fim, espetando o fio no agar. TRANSFERÊNCIA DE MEIO SÓLIDO PARA MEIO LÍQUIDO Com uma ansa esterilizada, recolher um pouco de cultura do meio sólido. Mergulhar a ansa no meio líquido, agitando-a para soltar o inóculo. TRANSFERÊNCIA DE MEIO LÍQUIDO PARA MEIO LÍQUIDO Recolher um pouco de cultura em meio líquido, utilizando uma pipeta de Pasteur esterilizada. Deitar algumas gotas num tubo com meio líquido.

Questionário

1. Que métodos de sementeira por esgotamento conhece? Qual o objetivo da sementeira por esgotamento?
2. Qual o objetivo da sementeira em toalha? Dê um exemplo prático da utilização deste método.
3. O que é a escala de Mac Farland? Para que serve?
4. Caracterize o método de sementeira por incorporação, e diga em que situações práticas se aplica.

EXAME APÓS FIXAÇÃO E COLORAÇÃO

Existem colorações simples e colorações diferenciais. As colorações simples permitem observar a morfologia individual e morfologia de associação das bactérias, algumas são utilizadas para visualizar estruturas específicas (cápsulas, esporos, cílios, grânulos metacromáticos, etc). As colorações diferenciais permitem apreciar características que diferem com os grupos de microrganismos: coloração de Gram (permite distinguir a constituição da parede bacteriana – Gram+ / Gram-), coloração de Ziehl-Neelsen (permite averiguar a presença de ácidos micólicos (lípidos) que conferem o caracter de ácido-resistência

• Mycobacterium sp. , Nocardia sp. ,etc.). As colorações específicas são utilizadas quando os microrganismos em estudo (ou sob suspeita) não coram com os métodos mais utilizados: coloração de Stamp (para observação de espiroquetas), coloração para riquétsias, etc.. Material
• lâminas
• lamelas
• ansas Protocolo experimental 1. Coloração simples v Forma, estrutura, dimensões, modo de associação. REAGENTES
• Álcool metílico
• Solução de azul de metileno TÉCNICA

1. Secar a preparação microscópica.
2. Fixar com álcool metílico 5 - 10 min., depois entornar o álcool.
3. Corar com solução de azul de metileno 5-10 min.
4. Lavar com água e secar.
5. Observar ao microscópio.

2. Coloração de Gram (coloração diferencial) – Figura 1 v Forma, estrutura, dimensões, modo de associação. v Diferenciação por reação à coloração: Gram positivo / Gram negativo. REAGENTES

• Solução de Violeta de Genciana (ou Cristal Violeta)
• Solução de Lugol: Iodo 1g Iodeto de potássio 2g Água destilada 300 ml
• Álcool-acetona
• Solução de fucsina (ou de safranina) TÉCNICA

1. Secar a preparação microscópica.
2. Fixar pelo calor.
3. Corar com Violeta de genciana – 3 min (ou cristal violeta - 1 min).
4. Escorrer o corante, lavar com o mordente (solução de lugol) e cobrir a lâmina – 1, min.
5. Lavar com água.
6. Diferenciar com álcool-acetona.
7. Lavar com água.
8. Contrastar com safranina (ou fucsina) - 30 seg.
9. Lavar com água e secar.
10. Observar ao microscópio. Figura 1. Coloração Gram.

Questionário

1. Para que serve a coloração de Gram?
2. De que estruturas celulares depende a reação ao Gram?
3. Qual o interesse clínico da coloração de Ziehl-Neelsen (ácido-resistente)?
4. A que se deve a ácido-resistência?

4 - Propagação de Bactérias Aeróbias

Introdução

No grupo de aulas que vamos iniciar, vamos simular uma análise bacteriológica de rotina. Há situações específicas em que a epidemiologia, história pregressa e lesões podem levar a suspeitas que requeiram metodologias próprias. É o caso da pesquisa de: Ø Espiroquetas: Serpulina , Borrelia , Leptospira ; Ø Gram-negativos aeróbicos/microaerófilos, móveis, forma helicoidal ou vibriónica: Campylobacter , Vibrio , etc; Ø Gram-negativos aeróbicos / microaerófilos, cocos e coco-bacilos: Brucella ; Ø Riquétsias, clamídias, Mycoplasma , Mycobacterium , Nocardia , etc. A amostra que lhes é fornecida contem uma população bacteriana desconhecida, tal como acontece numa amostra clínica (Ex: zaragatoa de uma ferida, leite mamítico, pedaço de órgão colhido numa necropsia, etc). Com o objetivo de diagnosticar a causa da afeção, utilizando algumas técnicas laboratoriais que já conhecem e outras que irão aprender, vamos propagar, isolar e identificar as bactérias no inóculo. Cada grupo irá fazer preparações microscópicas, corá-las e observá-las, para fazer uma apreciação das características morfológicas e comportamento perante o Gram, das bactérias contidas na amostra. Depois, irá propagar o inóculo em meios sólidos apropriados: um meio enriquecido – agar sangue (AS) – e um meio seletivo – agar MacConkey (MC) - , utilizando o método de sementeira por esgotamento por estria. Desta forma, pretende obter-se maior quantidade de microrganismos, mas desta vez, sob a forma de colónias isoladas, possibilitando a observação da morfologia colonial, por um lado, e por outro lado, permitindo obter culturas puras, repicando uma só colónia para um novo meio de cultura.

Material

• Cultura mista num tubo com meio líquido
• Lâminas de vidro, corantes e microscópios
• Placa com agar MacConkey (MC)
• Placa com agar sangue (AS)
• Material de sementeira

Questionário

1. O que entende por cultura pura? 2 - Que procedimentos pode utilizar para as obter? 3 - O que pode dizer da observação microscópica na verificação da pureza de uma cultura? 4 - Que tipos de meio de cultura estudou? O que os caracteriza?

2. Caracterize os meios agar McConkey e agar sangue?

5 - Isolamento de Bactérias Aeróbias

Introdução

Na última aula, a partir de um caldo com uma população bacteriana desconhecida, foram efetuadas sementeiras, em diferentes meios de cultura sólidos, para propagar o inóculo e verificar a pureza das culturas. Pela observação das colónias nos referidos meios, poderá deduzir se se trata de culturas puras ou mistas e, neste caso, saber quantos tipos de colónias diferentes existem. Além disso, através da repicagem, poderá produzir culturas puras necessárias para prosseguir com as provas para identificação das bactérias e testes de sensibilidade aos agentes antimicrobianos.

Protocolo experimental

1. Observe as placas e registe as características macroscópicas culturais das colónias nos diferentes meios de cultura utilizados. MacConkey Agar sangue Coloração de Gram