UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO E CULTURA
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA
NÚCLEO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Manual de Técnica Histológica de
Rotina e de Colorações
VITÓRIA DE SANTO ANTÃO/2021
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Manual de Técnica Histológica de Rotina e de Colorações, Esquemas de Histologia
Objetivo da coloração: essa coloração tem utilidade tanto na histologia, quanto na patologia e objetiva detectar amido, mucina, base de membrana no tecido ...
Tipologia: Esquemas
2022
1 / 37
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO E CULTURA
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA
NÚCLEO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Manual de Técnica Histológica de
Rotina e de Colorações
VITÓRIA DE SANTO ANTÃO/202 1
Manual de Técnica Histológica de Rotina e de Colorações Katharine Raquel Pereira dos Santos Doutorado em Ciências Biológicas pela Universidade Federal da Paraíba. Docente do Núcleo de Biologia da Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória. Francisco Carlos Amanajás de Aguiar Júnior Doutorado em Estomatopatologia pela Universidade Estadual de Campinas. Docente do Núcleo de Biologia da Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória. Erivaldo Alves Antonio Doutorando em Biociência Animal pela Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Recife. Fabricya Roberta da Silva Doutorado em Biociência Animal pela Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Recife. Keila Tamires da Silva Doutoranda em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Pernambuco. Departamento de Bioquímica, Recife. Ketsia Sabrina do Nascimento Marinho Doutorado em Biociência Animal pela Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Recife. Nivaldo Bernardo de Lima Junior Doutorado em Biociência Animal pela Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Recife.
APRESENTAÇÃO
O Manual de Técnica Histológica de Rotina e de Colorações tem como objetivo fornecer informações sobre os procedimentos que servirão como guia para a obtenção de preparados histológicos através da técnica histológica de rotina, assim como as colorações básicas e alguns métodos histoquímicos mais utilizados para a análise das estruturas e componentes citológicos e teciduais. Estas técnicas possibilitam a produção de lâminas histológicas para diversos fins, como: ensino, pesquisas e diagnósticos. O presente manual foi elaborado através do projeto de Extensão “Histologia em Foco: Aperfeiçoamento do Acervo Didático para o Ensino Básico e da Graduação” e dos Cursos de Extensão em Histotecnologia, realizados ao longo do desenvolvimento do projeto para proporcionar aos monitores e alunos da graduação e da pós-graduação, treinamento para a confecção de recursos didáticos utilizados nas atividades práticas, originando assim, uma maior integração entre os professores e alunos que atualmente utilizam os Laboratórios de Biotecnologia e Fármacos e de Microscopia I e II no âmbito do Ensino, da Pesquisa e da Extensão.
SUMÁRIO
- TÉCNICA HISTOLÓGICA DE ROTINA PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
- Coleta de Material
- Fixação
- Descalcificação
- Clivagem
- Processamento Histológico
- Inclusão
- Microtomia
- COLORAÇÕES PARA CITOLOGIA E HISTOLOGIA
- Coloração de rotina com H.E. (Hematoxilina e Eosina)
- 2.1. Coloração May Grunwald – Giemsa 2. Colorações citológicas
- 2.2. Coloração de Papanicolaou
- 2.3. Coloração de SHORR
- 3.1. Coloração de Ácido Periódico de Schiff (P.A.S.) 3. Colorações Histoquímicas
- 3.2. Coloração de Alcian Blue pH 1,0 e 2,5
- 3.3. Coloração de AgNOR
- 3.4. Coloração de Picrosírius
- 3.5. Coloração de Tricômico de Gomori
- 3.6. Coloração de Tricômico de Mallory
- 3.7. Coloração de Tricômico de Masson
- 3.8. Coloração de Verhoeff
- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Após a retirada dos órgãos de interesse, os mesmos devem ser identificados e registrados em livros de protocolos sob um número de registro, o qual acompanhará o material durante todo o processamento, até o seu arquivamento.
2. Fixação A fixação consiste em uma das etapas mais importante da técnica histológica e tem por finalidade a interrupção do metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares para preservar e conservar os elementos teciduais. Também permite a penetração de outras substâncias subsequentes à fixação. Ela pode ser realizada por meio de agentes físicos (frio e calor) ou químicos (líquidos fixadores). A fixação química é a mais utilizada na técnica histológica de rotina. Os mais utilizados são os fixadores formaldeídos, como formalina a 10%; formol-salino; formalina tamponada de Carson ou formalina em tampão Millonig; formalina-alcoólica e a mais utilizada rotineiramente, é a formalina neutra tamponada a 10%. Outras substâncias também são utilizadas como a acetona, os ácidos acético e pícrico, o álcool etílico e o fixador de Boüin. Alguns fatores podem influenciar na fixação do tecido a ser analisado, como temperatura, espessura do tecido, tempo de fixação (depende do tamanho da peça, mas varia de 12 a 48 horas em temperatura ambiente), escolha do fixador, Ph e concentração do fixador. Preparação da Formalina neutra tamponada 10% Formalina 37 – 40% ................................................ 100 ml Água destilada ......................................................... 900 ml Fosfato de Sódio Monobásico ................................. 4,0 g Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro) ....................... 6,5 g Dica: Manusear as peças com delicadeza, devido à fragilidade dos tecidos. Uma pressão exagerada ou mesmo o uso de instrumentos inadequados, além de dificultar o exame histopatológico, altera o tecido de tal maneira que pode simular uma lesão.
3. Descalcificação A descalcificação consiste em retirar os componentes inorgânicos do tecido, como o fosfato de cálcio, presente em tecidos ósseos. Este procedimento pode ser realizado por meios químicos (pH ácido, soluções quelantes e meios de troca iônica) e físicos (ultrassom e micro-ondas). O método físico acelera o processo de descalcificação, por isso, é sempre associado ao químico. Os meios químicos são os mais utilizados, como a descalcificação por ácidos. Dentre os descalcificadores ácidos, há os fortes (ácido nítrico e ácido clorídrico) e os fracos (ácido fórmico, ácido acético e ácido pícrico), sendo os fracos os mais utilizados por possuir ação fixadora e causar menos danos aos tecidos. É imprescindível que durante a manipulação destas substâncias, sejam utilizadas luvas específicas para a manipulação química e máscara com filtro próprio para vapores ácidos. O preparo dessas soluções deve ser feito em capela de exaustão. Dicas: Não é indicado coletar fragmentos grandes do material biológico. Uma vez que, pode interferir na penetração do fixador no tecido, ocorrendo uma fixação superficial do material. Também é importante estar atento às características do recipiente que contém as peças. Um recipiente muito pequeno, além de não proporcionar um volume adequado do fixador para o tamanho e a quantidade do material biológico (volume do fixador deve ser, no mínimo, 10 vezes o volume do material), também pode fazer com que a peça se dobre, resultando num aumento de espessura e consequente na má penetração pelo fixador. Dicas: Reduza ao máximo o tamanho do material a ser descalcificado, assim reduzirá o tempo de descalcificação. Renove o descalcificador diariamente, pois ele vai perdendo a sua concentração original. É essencial a lavagem do material antes e após a descalcificação. O volume do descalcificador deve ser, no mínimo, vinte vezes o tamanho da peça. Para verificar se o material está totalmente descalcificado, podem ser utilizados meios físicos (inserir uma agulha bem fina para verificar o grau de mineralização) ou químicos (através do oxalato de amônia).
5. Processamento histológico O processamento histológico consiste na difusão de reagentes químicos para o interior dos tecidos e na remoção do líquido tecidual. Este procedimento torna os fragmentos dos tecidos rígidos facilitando a obtenção de cortes finos para a observação ao microscópio. No processamento de rotina, o material passa pelas etapas de desidratação, diafanização, impregnação e inclusão, sendo a parafina, a substância mais utilizada nas duas últimas etapas indicadas. ● Desidratação O objetivo da desidratação é retirar a água presente no tecido, visto que a parafina é insolúvel em água. O álcool etílico é o produto mais utilizado para esse fim. O processo de desidratação é realizado de forma progressiva quanto à graduação alcoólica. ● Álcool 70% ● Álcool 80% ● Álcool 90% ● Absoluto I (Álcool 100%) ● Absoluto II (Álcool 100%) (1h para cada banho de álcool).
● Diafanização ou Clarificação
A finalidade da diafanização ou clarificação é remover completamente o álcool do interior dos tecidos, visto que a parafina não se mistura homogeneamente com o álcool. Desta forma, é necessário substituir o álcool por um produto com o qual a parafina tenha afinidade. Este reagente intermediário deve ser miscível com o desidratante (álcool) e o impregnador (parafina). O xilol é o agente utilizado nesta etapa do processo histológico de rotina. Ao substituir o álcool esse diafanizador vai deixando o tecido mais claro (quase transparente), por isso este processo também é chamado de clarificação. Nesse processo é recomendado o tecido passar mais de uma vez no diafanizador (xilol) para que obtenha um maior sucesso nesta etapa. ● Xilol I ● Xilol II (1h para cada banho de xilol).
● Impregnação A impregnação consiste na infiltração da parafina líquida no material biológico para que o tecido adquira rigidez suficiente e seja possível a realização de cortes finos. O objetivo desta etapa é eliminar completamente o xilol contido na peça e a total penetração da parafina nos espaços deixados pela água e pela gordura, antes existentes no tecido. Neste procedimento, também é recomendável passar o material mais de uma vez na parafina líquida, visando garantir uma impregnação eficiente. Esta etapa deve ser realizada em estufa regulada a 60º C. Lembrar que a parafina deve ser colocada na estufa, anteriormente à realização desta etapa, para que ela possa derreter. ● Parafina I ● Parafina II (1h para cada banho de parafina em estufa regulada a 60º C). As etapas do processamento histológico citadas acima, podem ser realizadas manualmente (Fig. 3), utilizando recipientes contendo cada um dos banhos dos reagentes e a troca é feita também de forma manual do material em cada banho, ou automaticamente, por meio de processador automático, chamado histotécnico (Fig. 4). Nestes processadores, os cassetes contendo os materiais biológicos são colocados em uma cesta que é transportada mecanicamente de forma a imergir os cassetes em cada reagente. Figura 3: Etapas do processamento histológico realizado manualmente, utilizando recipientes contendo os reagentes.
6. Inclusão O objetivo da inclusão é envolver o exterior do material biológico com a parafina líquida para formar blocos que serão submetidos posteriormente à microtomia. Nesta etapa o material é colocado com a superfície (clivada) a ser cortada para baixo em um molde para inclusão (Fig. 5), que será preenchido com a parafina líquida (Fig. 6), e em seguida coberto com o cassete. Após o resfriamento, os blocos de parafina com o material incluído são obtidos (Fig. 7 ). É importante estar atento à posição em que as peças serão colocadas no molde, visto que isso determinará a incidência de corte que será realizada. Figura 5: Molde de metal para inclusão do fragmento do material após a impregnação do tecido. Figura 6: Dispensador de parafina. Equipamento no qual a parafina sólida (barra ou lentilha) é colocada para derreter e ser utilizada para encher os moldes de inclusão.
Figura 7 : Fragmento do material biológico incluído em bloco de parafina para ser cortado.
7. Microtomia A microtomia consiste em executar cortes bem finos com espessura de 3 a 6 micrômetros para a passagem de luz e observação do tecido ao microscópio. O equipamento utilizado para a obtenção dos cortes é o micrótomo (Fig. 8 ). Há vários tipos de micrótomos, porém, o mais utilizado na técnica histológica de rotina é o micrótomo rotatório (tipo Minot). A navalha é uma das peças fundamentais nesse equipamento, sendo responsável por executar os cortes que podem ser de diversos tipos. As navalhas mais utilizadas são as descartáveis por possuírem custo menor em relação às de aço. Para a realização da microtomia, o bloco precisa estar resfriado e fixo no micrótomo para obter uma fatia fina do material. Os cortes obtidos devem ser levados com o auxílio de uma pinça ao banho-maria (Fig. 8 ) à temperatura aproximada de 40 a 50ºC para que as fitas de parafina se distendam sobre a água, evitando a formação de dobras no tecido. Em seguida, os cortes são pescados com lâminas previamente limpas e Dicas: Nunca coloque o material biológico em contato direto com o molde, sempre coloque um pouco de parafina antes de inserir o seu fragmento e depois, termine de preencher o molde com a parafina. Desta forma, evita-se a aderência do material no metal do molde e a subsequente formação de buracos no bloco de parafina.
COLORAÇÕES PARA CITOLOGIA E HISTOLOGIA
A coloração compreende uma etapa importantíssima para a visualização e interpretação do material citológico e histológico a ser observado em microscópio óptico. As lâminas citológicas obtidas através de esfregaços/estiraços, após a sua fixação, seguem a coloração que julgar mais adequada dentre as que estão descritas mais adiante neste manual. Enquanto para as lâminas histológicas, a coloração é imprescindível para a observação dos componentes teciduais, uma vez que o processamento de rotina deixa a peça translúcida devido ao xilol e à microtomia. A coloração a ser utilizada para as lâminas histológicas deve seguir o objetivo da análise. Para uma observação geral dos componentes teciduais, a técnica de coloração de rotina com hematoxilina e eosina (H.E.) é a mais indicada. Já, para a análise de elementos específicos do tecido, é recomendável a utilização de técnicas histoquímicas. Como os corantes utilizados para ambas as técnicas de coloração histológica (rotina e histoquímica), geralmente são hidrossolúveis, é necessário a remoção da parafina e a reidratação do corte antes da utilização dos corantes. Após a coloração, a desidratação e a clarificação são necessárias para possibilitarem a montagem da lâmina tanto citológica, quanto histológica. Seguem abaixo os procedimentos necessários para realizar a coloração de lâminas histológica e citológica, para esta última, após a fixação do material, seguem as etapas do procedimento a partir da coloração. Procedimentos gerais para colorações Este procedimento consiste em remover a parafina do tecido a ser corado, seguindo as etapas abaixo: Desparafinização : tem por objetivo remover a parafina do tecido após a microtomia, utilizando dois banhos de xilol. ● Xilol I (10 min) ● Xilol II (10 min)
Hidratação : tem por finalidade hidratar o tecido com concentrações decrescentes de álcool. ● Álcool absoluto I (1 min) ● Álcool absoluto II (1 min) ● Álcool 90% (1 min) ● Álcool 80% (1 min) ● Álcool 70% (1 min) ● Água destilada (1 min) Coloração : é o ato de corar o tecido com o corante escolhido para a posterior visualização em microscópio de luz. Desidratação : tem por objetivo retirar a água do tecido por meio de concentrações de álcool crescentes, visto que os meios de selagem não são miscíveis em água. ● Álcool 70% (1 min) ● Álcool 80% (1 min) ● Álcool 95% (1 min) ● Álcool absoluto I (3 min) ● Álcool absoluto II (3 min) Clarificação: tem por finalidade usar o xilol para remover o álcool, que este último também não é miscível com o meio de montagem, e após esta etapa, realizar a montagem da lâmina. ● Xilol I (10 min) ● Xilol II (10 min) Selagem ou montagem da lâmina: esta etapa consiste em cobrir o tecido com uma lamínula de vidro, usando um meio de montagem para fixar a lâmina à lamínula (selagem). Os meios de montagem mais utilizados são com Bálsamo do Canadá, Ethelan etc. Dicas: No ato da selagem, cuidado com a formação de bolhas nas lâminas, pois elas dificultam a análise do tecido.
✔ Eosina aquosa 1 g de eosina Y 100 ml de água destilada Após a dissolução da eosina na água, adicionar umas gotas de formol para evitar o crescimento de fungos. A adição de 0,5 ml de ácido acético a cada 500 ml de solução, ajusta o pH para valores próximos de 5. ✔ Eosina-Floxina B Solução de Floxina a 1% 1 g de floxina B 100 ml de água destilada ✔ Solução Eosina-Floxina 100 ml de eosina Y aquosa a 1% 10 ml de floxina B a 1% 780 ml de álcool etílico a 96% 4 ml de ácido acético glacial Misturar as soluções de eosina Y e eosina floxina no álcool, adicionar o ácido e filtrar. Etapas da coloração Hematoxilina e Eosina ● 1ª Etapa: desparafinar e hidratar. ● 2ª Etapa: lavar as lâminas com água destilada por 1 minuto, para assim receber o primeiro corante, a hematoxilina. As lâminas ficam imersas no corante por 3 minutos (depende do tempo de preparo e uso do corante). ● 3ª Etapa: lavar as lâminas com água corrente por 10 minutos e corar com eosina por 7 minutos (depende do tempo de preparo e uso do corante). ● 4ª Etapa: desidratar e clarificar. Em seguida, realizar a montagem das lâminas. Resultados: os núcleos coram-se de azul a roxo pela hematoxilina, enquanto que o citoplasma e os espaços extracelulares são corados pela eosina, em róseo ou avermelhado.
2. Colorações Citológicas 2.1. Coloração May Grunwald – Giemsa Objetivo da coloração: utilizada para coloração de células. Esta coloração consiste em uma mistura de corantes com características neutras, que coram os componentes nucleares e citoplasmáticos das células. É um método que obtém um resultado final melhor e mais detalhado quando comparado com a coloração Giemsa simples. Preparo dos corantes e soluções: A) Giemsa 6 g de giemsa 500 ml de metanol 500 ml de glicerol B) May Grunwald 2 g de May Grunwald 1000 ml de metanol Etapas da coloração May Grunwald – Giemsa ● 1ª Etapa: coleta e fixação do material em solução álcool/éter em partes iguais. ● 2ª Etapa: cobrir a lâmina com o corante de May Grunwald e deixar atuar por 2 minutos. ● 3ª Etapa: acrescentar 20 gotas (1 ml) de água destilada tamponada pH 7,0-7,2 deixar atuar por 1 minuto e homogeneizar. Escorrer sem lavar. Dicas: É aconselhável sempre filtrar os corantes antes do uso. Se a lâmina ficar muito corada quando passar pela Hematoxilina, pode lavar rapidamente em solução álcool ácido (99,5 ml de álcool P.A. + 0,5 ml de ácido clorídrico concentrado) e após, em água corrente por 2 minutos.