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Um estudo que investiga o papel do sistema nps-npsr na atividade locomotora de camundongos submetidos a tratamentos com nps, αmetil-p-tirosina (ampt), reserpina e sulpiride. Os resultados obtidos em testes de atividade locomotora no campo aberto e discute as implicações desses resultados na regulação de funções centrais, como locomoção, ciclo cardiano, ingestão de alimentos, ansiedade, memória e aprendizado, nocicepção, via da recompensa e outras funções.
Tipologia: Notas de aula
Compartilhado em 07/11/2022
4.5
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Não perca as partes importantes!
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
Natal - RN
2014
Dissertação de mestrado apresentada ao curso de Pós-graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Elaine C. Gavioli
Natal – RN
2014
Defesa: 25/04/
A harmonia das leis naturais revela uma
inteligência de tal superioridade que,
comparada a ela, todo o pensamento
sistemático e a ações dos seres humanos
são uma reflexão totalmente insignificante.
Albert Einstein
Muito obrigada pela amizade e companheirismo, queridos! Agradeço de
coração aquela que se chegou com amizade, incentivo e com a ajuda na parte
experimental desse trabalho: a Nataly. Muitas vezes trabalhamos juntas, e
também rimos, brigamos, choramos e isso tudo foi muito bom! Você foi
essencial, muito obrigada! Você também é meu motivo de orgulho, sei que com você vai longe! Enfim, queridos do laboratório, citados ou não, muito obrigada!
Agradeço também a todos os professores da Psicobiologia, pelo
conhecimento adquirido.
Aos componentes da banca, prof. Dr. Marcelo Duzzioni e prof. Dr.
Judney Cavalcante , muito obrigada pela disponibilidade e contribuição para
este trabalho.
Agradeço à professora Dra. Vanessa , que além de ser um modelo, é
também uma fofa. Que honra ter você na minha banca de TCC, de qualificação, e agora, apesar das circunstâncias não terem permitido sua
presença na minha banca, agradeço-lhe por todo incentivo e pela
disponibilidade como suplente.
10
Neuropeptídeo S (NPS) é um peptídeo endógeno formado por 20 aminoácidos e é o ligante de um receptor acoplado à proteína G chamado NPSR, o qual está envolvido na modulação de várias funções biológicas centrais como locomoção, ansiedade, nocicepção, ingestão de alimento e comportamentos motivacionais. Já é conhecido que o efeito hiperlocomotor do NPS é mediado pelos receptores NPSR e parece depender da ativação do sistema adenosinérgico, dopaminérgico e do sistema peptidérgico do CRF. Considerando o pouco conhecimento acerca do envolvimento do sistema dopaminérgico na mediação do aumento da atividade locomotora induzido pelo NPS, o presente estudo objetiva investigar as ações motoras da administração intracerebroventricular (icv) de NPS em camundongos pré-tratados com α- metil- p- tirosina (AMPT, inibidor da enzima de síntese de dopamina), reserpina (inibidor do armazenamento da dopamina em vesículas) ou sulpiride (inibidor de receptores D 2 de dopamina), em animais submetidos ao teste de atividade locomotora no campo aberto. Para fins de comparação, um grupo distinto de animais recebeu os mesmos pré-tratamentos acima descritos (AMPT, reserpina ou sulpiride) e o efeito hiperlocomotor do metilfenidato (inibidor da recaptação de dopamina) foi investigado no campo aberto. O NPS e o metilfenidato aumentaram a atividade locomotora dos animais. O AMPT per se não causou alteração na locomoção dos animais. Por outro lado, o AMPT reduziu parcialmente o efeito hiperlocomotor do metilfenidato, mas não foi capaz de afetar a ação hiperlocomotora do NPS. Tanto o pré-tratamento com reserpina como com sulpiride foram capazes de inibir o efeito estimulatório do NPS, assim como o do metilfenidato. Estes achados mostram que o efeito hiperlocomotor do metilfenidato, mas não do NPS, foi afetado pela administração de AMPT. Além disso, tanto o efeito do metilfenidato quanto do NPS foram prejudicados pelos pré-tratamentos com reserpina e sulpiride. Em conjunto, sugere-se que o NPS pode promover estímulo excitatório mesmo quando a síntese de catecolaminas está prejudicada. Ainda conclui-se que o efeito hiperlocomotor do NPS e do metilfenidato depende dos estoques vesiculares de monoaminas, em particular dopamina, e da ativação do receptor dopaminérgico D 2. O efeito psicoestimulante do NPS por meio da ativação do sistema dopaminérgico pode apresentar importância clínica no tratamento de doenças que envolvem a via dopaminérgica, como a doença de Parkinson e a dependência química.
Palavras-chaves: neuropeptídeo S; atividade locomotora; dopamina; camundongo.
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Neuropeptide S (NPS) is an endogenous 20-aminoacid peptide which binds a G protein-coupled receptor named NPSR. This peptidergic system is involved in the modulation of several biological functions, such as locomotion, anxiety, nociception, food intake and motivational behaviors. Studies have shown the participation of NPSR receptors in mediating the hyperlocomotor effects of NPS. A growing body of evidence suggests the participation of adenosinergic, dopaminergic and CRF systems on the hyperlocomotor effects of NPS. Considering that little is known about the role of dopaminergic system in mediating NPS-induced hyperlocomotion, the present study aims to investigate the locomotor actions of intracerebroventricular (icv) NPS in mice pretreated with α-metil- p- tirosine (AMPT, inhibitor of dopamine synthesis), reserpine (inhibitor of dopamine vesicle storage) or sulpiride (D 2 receptor antagonist) in the open field test. A distinct group of animals received the same pretreatments described above (AMPT, reserpine or sulpiride) and the hyperlocomotor effects of methylphenidate (dopamine reuptake inhibitor) were investigated in the open field. NPS and methylphenidate increased the mouse locomotor activity. AMPT per se did not change the locomotion of the animals, but it partially reduced the hyperlocomotion of methylphenidate. The pretreatment with AMPT did not affect the psychostimulant effects of NPS. Both reserpine and sulpiride inhibited the stimulatory actions of NPS and methylphenidate. These findings show that the hyperlocomotor effects of methylphenidate, but not NPS, were affected by the pretreatment with AMPT. Furthermore, methylphenidate- and NPS-induced hyperlocomotion was impaired by reserpine and sulpiride pretreatments. Together, data suggests that NPS can increase locomotion even when the synthesis of catecholamines was impaired. Additionally, the hyperlocomotor effects of NPS and methylphenidate depend on monoamines vesicular storaged, mainly dopamine, and on the activation of D 2 receptors. The psychostimulant effects of NPS via activation of dopaminergic system display clinical significance on the treatment of diseases which involves dopaminergic pathways, such as Parkinson’s disease and drug addiction.
Keywords: neuropeptide S; locomotor activity; dopamine; mice.
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Figura 18 – Efeito da administração de AMPT nas doses de 100, 200, 250 e
300 mg/kg, ip, 24h após o tratamento,em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto ................................................................................................... 47
Figura 19. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 48
Figura 20. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção
causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto ................................................................................................... 49
Figura 21 – Efeito da administração de reserpina nas doses de 1, 2 e 5 mg/kg,
sc, 24h,em camundongos submetidos ao teste do campo aberto. ................... 50
Figura 22 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção
induzida por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 50
Figura 23 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto ................................................................................................... 51
Figura 24 – Efeito da administração de sulpiride nas doses de 25 e 50 mg/kg,
ip, 45 min, em camundongos submetidos ao teste do campo aberto ............... 52
Figura 25 – Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção
causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 53
Figura 26. Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção
induzida pelo NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto.. 54
Figura 27 – O ciclo sináptico.. .......................................................................... 59
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6-OHDA – 6-hidroxidopamina
AADC – aminoácido aromático descaboxilase
AMPc – adenosina monofosfato cíclico
AMPT – alfa-metil-para-tirosina
AP – ântero-posterior
ATP – adenosina tri-fosfato
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
CRF – fator liberador de corticotropina
DAT – transportador de dopamina
DOPAC – ácido 3,4-dihidroxifenilacético
DV – dorso-ventral
GPCR – receptores acoplados a proteína G
GABA – ácido gama-aminobutírico
Gs – proteína G estimulatória
Gq – proteína G que ativa fosfolipase C
HPLC – do inglês, high performance liquid chromatography
icv - intracerebroventricular
ip – intraperitonial
iv – intravenoso
KO – knockout
16
1.1. O Sistema do Neuropeptídeo S
Novos neurotransmissores ou moduladores podem ser descobertos pelo
uso da técnica da farmacologia reversa, especialmente quando tais ligantes
possuem afinidade por receptores órfãos acoplados a proteínas G (GPCRs, do
inglês G protein-coupled receptors). GPCRs órfãos são proteínas clonadas
cujos ligantes endógenos não foram ainda identificados. Usando GPCRs
órfãos, vários neuropeptídeos têm sido descobertos nos últimos anos, o que
tem ampliado a compreensão de funções particulares do cérebro e auxiliado a
revelar novos alvos terapêuticos para transtornos psiquiátricos (CIVELLI et al.,
2001). Xu e colaboradores (2004) descreveram pela primeira vez as funções
fisiológicas do Neuropeptídeo S (NPS), que foi identificado pela técnica da
farmacologia reversa. O NPS é o ligante endógeno de um GPCR deorfanizado
que foi denominado de NPSR. O NPS foi assim denominado devido à presença
de um aminoácido serina (S) na porção amino-terminal da estrutura primária
desse peptídeo, que se encontra preservada em várias espécies animais, como
mostra a Figura 1.
Figura 1 – Estruturas primárias do Neuropeptídeo S de Humano, chimpanzé, camundongo, rato, cachorro e galinha. Aminoácidos divergentes da seqüência humana são mostrados em negrito. O aminoácido Serina (S) na porção N-terminal está conservado em todas as espécies que expressam o peptídeo. (XU et al., 2004)
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O receptor NPSR é amplamente distribuido no encéfalo, enquanto a
expressão do peptídeo precursor é limitada a poucas áreas do tronco
encefálico. A expressão do RNAm do precursor do NPS no cérebro exibe uma
distribuição muito limitada, pois a maioria dos neurônios que expressam o NPS
foram encontrados em poucas regiões do tronco cerebral, a citar: núcleo
sensitivo principal do trigêmeo, núcleo parabraquial lateral e na área próxima
ao locus coeruleus (XU et al., 2007). Estudos de hibridização in situ
demonstraram que a maioria das células que expressam NPS na área do locus
coeruleus são neurônios glutamatérgicos, poucos são colinérgicos, enquanto
nenhum produz GABA. No núcleo sensitivo principal do trigêmeo, muitos dos
neurônios que expressam NPS utilizam glutamato como um neurotransmissor.
Finalmente, células positivas para NPS no núcleo parabraquial lateral co-
expressam CRF (XU et al., 2007). O NPS parece estar expresso juntamente
com neurotransmissores excitatórios e, baseado nisso, tem sido proposto que o
NPS fornece elementos excitatórios adicionais aos alvos pós-sinápticos destes
neurônios (XU et al., 2007).
Em oposição ao precursor do NPS, o NPSR é amplamente distribuído no
cérebro. De fato, altos níveis de expressão do RNAm do NPSR foram
encontrados no córtex, núcleo olfatório, tálamo, hipotálamo, amígdala e
subiculum (XU et al., 2004; 2007). Vale ressaltar que o receptor NPSR
encontra-se expresso moderadamente na substância negra e na área
tegmental ventral, o que sugere um papel modulatório desempenhado por este
sistema sobre a neurotransmissão dopaminérgica (XU et al., 2007).
O perfil da expressão do receptor NPSR sugere o envolvimento do
sistema NPS-NPSR na regulação de múltiplas funções centrais, como
19
1.2. Ações motoras do NPS
Fisiologicamente, Xu e colaboradores (2004) demonstraram pela
primeira vez que a administração supraespinhal de NPS 0,1 nmol causou
hiperlocomoção em camundongos familiarizados ou não ao ambiente. A
duração do efeito hiperlocomotor produzido pela administração
intracerebroventricular (icv) de NPS foi de aproximadamente uma hora. Estes
resultados foram posteriormente confirmados por vários grupos de pesquisa,
tanto para camundongos (ROTH et al., 2006; LEONARD et al., 2008;
OKAMURA et al., 2008; RIZZI et al., 2008; CASTRO et al., 2009; PAÑEDA et
al., 2009), quanto para ratos (SMITH et al., 2006), mostrando que o efeito
estimulatório da atividade locomotora é robusto e consistente apesar das
diferentes condições experimentais e das espécies animais.
O envolvimento do NPSR na atividade locomotora foi demonstrado com
o uso de três antagonistas quimicamente não relacionados, o composto não-
peptídico SHA 6824 (OKAMURA et al., 2008; RUZZA et al., 2010) e os
peptídicos [D-Val5]NPS (GUERRINI et al., 2010) e [tBu-D-Gly5]NPS (RUZZA
et al., 2012). Os antagonistas foram eficazes em antagonizar o efeito
estimulatório do NPS na locomoção, mas não produziram efeito na locomoção
per se. Estes achados obtidos em diferentes condições laboratoriais e
utilizando moléculas de naturezas diferentes demonstram que a ação do
peptídeo na atividade locomotora ocorre devido à ativação do NPSR e sugerem
que o sistema endógeno de NPS não exerce um controle tônico no
comportamento motor do animal.
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Estudos com diferentes linhagens de camundongos knockout (KO) tem
confirmado essa hipótese. Camundongos KO para o gene do
NPSR(NPSR(−/−)), não apresentaram diferenças no comportamento locomotor
em relação aos animais selvagens, e ainda, o efeito hiperlocomotor do NPS foi
observado em camundongos NPSR(+/+) mas não em camundongos
NPSR(−/−), quando injetados com NPS icv (DUANGDAO et al., 2009; FENDT
et al., 2011; RUZZA et al., 2010). Em conjunto, estes dados indicam que o NPS
produz efeito estimulatório sobre a atividade locomotora mediado pela ativação
do NPSR.
1.3. NPS e sistema dopaminérgico
Baseados no fato de o NPSR estar distribuído em várias áreas
cerebrais, incluindo a área tegmental ventral (VTA; XU et al., 2007), Mochizuki
e colaboradores (2010) propuseram o estudo do envolvimento do sistema
dopaminérgico pela via mesolímbica, que tem sua origem na VTA, na atividade
locomotora de ratos sob o efeito do NPS. A hipótese do grupo era de que a
atividade hiperlocomotora induzida por NPS pode ser mediada por ativação da
via dopaminérgica mesolímbica através da ativação do NPSR expresso na
VTA. A injeção intra-VTA de NPS causou aumento da atividade motora
horizontal e vertical em ratos de forma significativa, nas doses de 0,05 nmol e
0,5 nmol (por hemisfério), e a hiperatividade foi dose-dependente e
significativamente inibida por pré-administração local na parte shell do núcleo
accumbens (NAcSh) de sulpiride, um antagonista do receptor D 2 de dopamina,
