Anomalias Citogenéticas em Vaporizadores e Fumantes: Estudo Comparativo, Notas de aula de Cálculo

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LÍGIA ÂNGELO TAVARES SCHWARZMEIER

AVALIAÇÃO DE DANOS CITOTÓXICOS E CITOGENÉTICOS EM

FUMANTES DE CIGARROS INDUSTRIALIZADOS E

VAPORIZADORES DE CIGARROS ELETRÔNICOS

São José dos Campos 2018

LÍGIA ÂNGELO TAVARES SCHWARZMEIER

AVALIAÇÃO DE DANOS CITOTÓXICOS E CITOGENÉTICOS EM FUMANTES DE

CIGARROS INDUSTRIALIZADOS E VAPORIZADORES DE CIGARROS

ELETRÔNICOS

Dissertação apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual

Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para

obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de Pós-Graduação em

BIOPATOLOGIA BUCAL, Área de Patologia.

Orientadora: Profa. Tit. Janete Dias Almeida Coorientadora: Prof. Dra. Celina Faig Lima Carta

BANCA EXAMINADORA

Profa. Tit. Janete Dias Almeida (Orientadora)

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Unesp

Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos

Profa. Adj. Ana Lia Anbinder

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Unesp

Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos

Prof. Adj. Vinícius Coelho Carrard Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Odontologia Campus de Porto Alegre

São José dos Campos, 28 de março de 2018.

DEDICATÓRIA

Dedico meu trabalho a DEUS que sempre está comigo em todas as

situações.

me escutava com paciência! Além disso, o período de mestrado coincidiu com

dois eventos marcantes pra nós, que nos mudou de alguma forma. Um foi o

nosso casamento, que foi um momento de muita alegria, e que nos uniu ainda

mais. O outro foi o acidente do Thomas. Ele foi atropelado por um ônibus no

meio do primeiro ano de mestrado, e ficou hospitalizado por um pouco mais de 2

meses. E é interessante pensar que muitos momentos marcantes do período de

hospital, coincidiram com momentos marcantes do mestrado. Como o dia do

acidente ter sido no mesmo dia em que me reuni com a Profa. Janete e Celina

para decidirmos meu novo projeto de pesquisa; ou um dos dias mais difícieis do

hospital, quando retiraram o curativo do enxerto, foi o dia em que aprendi a

técnica para coloração de Feulgen; e o dia da alta dele, foi quando voltei do

congresso na UEL, e recebemos uma premiação pelo painel apresentado...

Então, quando paro para lembrar de tudo isso, me sinto feliz e agradecida, pois

com o cuidado de DEUS e apoio de todos, conseguimos superar tudo!!

Agradeço aos meus pais, Marcos e Kátia, que sempre me incentivaram a

estudar e buscar meus sonhos. Meus maiores exemplos de relacionamento com

DEUS, integridade e sabedoria, que sempre têm um bom conselho para dar e

que sempre oram por mim. Obrigada por todo apoio e sustento durante toda a

minha vida, sei que muitas vezes abriram mão das coisas deles para dar o

melhor para os meus irmãos e para mim.

E falando de irmãos, também agradeço à Raquel e ao Otávio, que sempre

me animam e me incentivam a persistir. Minha irmã sempre parecendo durona,

mas que por dentro tem um coração enorme. Aquela irmã mais velha em quem

a gente se espelha de alguma forma. Também o caçulinha da família, meu

irmão, que sempre demonstra o quanto quer cuidar de todos, mesmo sendo o

mais novo. Muitas vezes não precisamos falar nada, mas já sabemos quando

não está tudo bem. Parceria que desenvolvemos desde que me conheço por

gente, e aqueles que sei que posso contar em qualquer situação.

Aos meus avós Antônio, Francisca, Sérgio (em memória) e Ilka que

sempre demonstraram muito carinho, amor, e sinto o quanto eles se alegram

com as minhas conquistas. Dizem que os avós são pais duas vezes, e eu

acredito nisso. Sei o quanto eles sofrem quando sofremos, e o quanto se

alegram, quando nos alegramos. E se hoje tenho pais maravilhosos e íntegros,

sei que teve muito sacrifício e empenho por parte dos meus avós.

À família do meu marido Klaus, Jane, Viktor, Lukas, Juliana e Arthur (meu

sobrinho lindo), que também me acompanharam nesse período, me acolheram

muitas vezes e oraram por mim.

Sou grata a Professora Janete que me acolheu desde os ambulatórios de

propedêutica na graduação. Ela é aquela professora tranquila, que nunca se

desespera. Aquela que percebe quando estamos com os olhos cheios de

lágrimas e nos abraça. Aquela que exerce bem pesquisa, ensino e extensão,

tudo ao mesmo tempo. Obrigada por sempre tentar nos compreender e se

esforçar para que o percurso do trabalho seja mais leve.

Agradeço também à minha coorientadora Celina, que me mostrou os

primeiros micronúcleos e que me ensinou cada passo da metodologia desse

trabalho. Uma profissional de muita competência, que também me permitiu conhecer

o seu bom coração. Ela sempre esteve disponível para me ensinar e ajudar em tudo,

inclusive nos dias mais improváveis. Obrigada por me ensinar tanto!

Também à Mônica, sempre muito animada, empenhada e que me ajudou nas

coletas, e com a ajuda dela conseguimos a maioria dos pacientes do grupo de

cigarro eletrônico. Uma excelente profissional que cativa à todos por onde passa.

À Bruna, que participou ativamente das coletas dos pacientes fumantes e ex-

fumantes, e que é uma pessoa muito querida, que conheci a pouco tempo, mas que

já tenho muito carinho.

Não posso deixar de agradecer às alunas de Iniciação Científica Beatriz e

Camila, pois estiveram comigo nas coletas, dedicando o tempo delas para me

ajudar. Também à Gabriela Lima, que me acompanhou nas primeiras colorações de

Feulgen.

Agradeço aos membros da Banca Examinadora que tão prontamente

aceitaram participar desse momento tão importante para mim.

Agradeço também ao Professor Ivan, que me mostrou os passos para a

estatística do trabalho.

À Dra Jaqueline que disponilizou espaço para que realizássemos as coletas,

e por nos indicar os pacientes tratados no Incor para participarem da pesquisa. E

também à Aline, secretária da seção de tabagismo do Incor, que nos auxiliou com os

agendamentos das coletas.

nosso papel é exercer nosso trabalho com responsabilidade, honestidade e

imparcialidade, visando sempre o bem das pessoas e confiando em DEUS de que

tudo dará certo!

"Se eu voar para o Oriente ou for viver nos lugares mais distantes do Ocidente,

ainda ali Tua mão me guia, ainda ali Tu me ajudas.” Salmo 39 : 9 - 10.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CCE Carcinoma de Células Escamosas

CO Monóxido de Carbono

E-cig Cigarro eletrônico

ECSI Escore de Consumo Situacional Issa

MN Micronúcleo

OMS Organização Mundial da Saúde

TFDC Teste de Fagerström para Dependência à Cigarro

Schwarzmeier LÂT. Avaliação de danos citotóxicos e citogenéticos em fumantes de cigarros industrializados e vaporizadores de cigarros eletrônicos [dissertação]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 201 8.

RESUMO

O objetivo desta pesquisa foi investigar a frequência de micronúcleos e anomalias metanucleares na mucosa bucal de vaporizadores de cigarro eletrônico e de fumantes de cigarro industrializado, e comparar com ex-fumantes e não fumantes para determinar se existe diferença no dano citogenético e citotóxico, bem como se o dano diminui após a cessação tabágica. Os pacientes foram divididos em 4 grupos: Controle; E-cig; Fumante e Ex-fumante. Os critérios de inclusão adotados foram: ausência de histórico de neoplasia maligna bucal e ausência de quaisquer sinais clínicos visíveis de alteração no local avaliado. Foi realizada avaliação quanto ao grau de dependência nicotínica, por meio do Teste de Fagerström para Dependênca à Cigarro e Escore de Consumo Situacional Issa, e quanto ao perfil tabágico dos pacientes. A mensuração de CO expirado foi utilizada como critério objetivo de avaliação de consumo de tabaco, bem como a concentração de cotinina no sangue capilar dos pacientes avaliados. As amostras foram coletadas por meio de citologia esfoliativa da região de bordo lateral de língua e soalho bucal. Os esfregaços obtidos foram fixados com spray alcoólico e as lâminas coradas pelo método de Feulgen. Posteriormente, foi realizada a investigação dos micronúcleos e das anomalias metanucleares. Para a comparação dos dados não paramétricos foram utilizados os testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Já para as correlações e associações entre os dados, foram utilizados o teste da correlação de Spearman e o Teste Exato de Fisher, respectivamente. Foi adotado um nível de significância de 5% para todos os testes. A partir dos resultados, observou-se diferença significante entre os grupos E-cig e Controle (p=0,0072), e também entre os grupos Fumante e Controle (p=0,0004), no total de MN. Em contrapartida os grupos E-cig e Ex-fumante foram semelhantes, enquanto que o grupo Fumante foi significativamente maior que o grupo Ex-fumante (p=0,0370) também no total de MN. Também foi possível observar diferença significante entre os grupos E-cig e Ex-fumante, bem como entre os grupos E-cig e Controle em todas as anomalias metanucleares, exceto cariorrexe. Os grupos Fumante e Ex-fumante foram diferentes em cariorrexe (p=0,0517), e nuclear bud (p=0,0470) apenas, e o grupo Fumante foi significativamente maior que o grupo Controle em todas as anomalias metanucleares. A comparação entre os grupos E-cig e Fumante não foi realizada, devido à ingestão de altas doses de bebidas alcoólicas no grupo E-cig. O tabagismo promove danos citotóxicos e citogenéticos e o uso de E-cig associado ao álcool parece causar genotoxicidade e citotoxicidade. A cessação tabágica promove reversibilidade dos danos causados anteriormente.

Palavras-chave: Hábito de fumar. Abandono do hábito de fumar. Mucosa bucal. Testes para micronúcleos. Tabagismo. Cigarros eletrônicos.

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1 INTRODUÇÃO

O tabagismo representa a epidemia que mais ameaça a saúde pública

mundial e é responsável por mais de 7 milhões de mortes por ano, sendo que cerca

de 890 mil dessas mortes são causadas pela exposição involuntária ao fumo (World

Health Organization, 2017). Além disso, é considerado um fator de risco evitável de

câncer, doenças cardiovasculares e respiratórias (Instituto Nacional de Câncer,

2016). Estima-se que um paciente tabagista vive 10 anos a menos, que um paciente

não tabagista (Instituto Nacional de Câncer, 2016).

A farmacologia e processos comportamentais que causam a dependência do

tabaco pela nicotina ocorrem de maneira similar à dependência de drogas como

cocaína e heroína (U.S. Department of Health & Human Services, 1988; Hatsukami

et al., 2008). A dependência nicotínica acontece devido a vários fatores como a

velocidade e quantidade de entrega de nicotina, por sua depuração e efeito sobre o

cérebro, pela dependência física que causa, e além disso o tabagista irá desenvolver

uma associação entre o ato de fumar com os estímulos provenientes do uso de

tabaco (Zevin et al., 1998; Benowitz, 1999; Stratton et al., 2001; Hatsukami et al.,

2008 ).

A nicotina possui meia-vida plasmática relativamente curta, de 1 a 2 horas.

O processo de metabolização da nicotina gera cotinina e outros subprotudos

(Benowitz et al., 2009; Kaisar et al., 2017). A cotinina representa cerca de 75% dos

subprodutos provenientes da nicotina, possui uma meia-vida plasmática mais longa,

de 16 a 18 horas, e aparece em maiores concentrações no sangue do que a nicotina

(Benowitz et al., 2009). Devido a isso, a cotinina é considerada um biomarcador da

ingestão de nicotina (Benowitz et al., 2009; Kaisar et al., 2017). A mensuração tanto

da nicotina, quanto da cotinina podem ser realizadas a partir de amostras de

sangue, urina, saliva e cabelo (Benowitz et al., 2009).

O consumo de tabaco é a causa de diversas desordens no organismo

(Instituto Nacional de Câncer, 2008 ; Daijo et al., 2016). É também um importante

fator de risco para o desenvolvimento de neoplasias malignas em boca, e também

está associado às desordens com potencial de transformação maligna

(Warnakulasuriya et al., 2016; Narayan, Shilpashree, 2016). Entre as neoplasias

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malignas que acometem a mucosa de revestimento da cavidade bucal, o carcinoma

de células escamosas (CCE) é o mais frequente e corresponde a mais de 90% dos

casos (Mao et al., 2004; Scully, Felix, 2006; Siebers et al., 2013; Santos-Silva et al.,

2014).

O consumo de tabaco pode ser feito de diferentes formas como tabaco

mascado, fumo de rolo ou palha, cigarro industrializado e, nos últimos anos surgiu o

uso do cigarro eletrônico (E-cig) (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2014). O

E-cig foi desenvolvido pelo farmacêutico Hon Lik em 2003, cujo objetivo era

favorecer a cessação do tabagismo (Cahn, Siegel, 2011; Knorst et al., 2014; Famele

et al., 2015). O E-cig é constituído por: uma bateria, um cartucho que disponibiliza o

líquido a ser vaporizado e um atomizador. Este sistema eletrônico simula o cigarro

industrializado, uma vez que pode promover a vaporização da nicotina (Knorst et al.,

2014). É importante ressaltar que a concentração de nicotina presente nos líquidos

destes dispositivos é variada e o consumidor escolhe a concentração desejada,

podendo optar por cartuchos sem nicotina. Também estão presentes na maioria dos

líquidos de E-cig o propileno glicol e a glicerina vegetal, que servem como

umectantes e auxiliam na produção de fumaça (Famele et al., 2015; Chun et al.,

2017). Além dessas principais substâncias, existem as essências aromatizantes,

utilizadas para promover sabores mais agradáveis, existindo no mercado mais de

7700 tipos de sabores, todavia a pureza dos ingredientes utilizados é questionada

na literatura quanto à segurança e também à veracidade dos ingredientes

informados pelos fabricantes (Zhu et al., 2014; Javed et al., 2017).

O suposto atrativo estaria na tecnologia que permite ao usuário fumar “sem

riscos” pela ausência da queima do tabaco, impedindo assim a liberação de muitas

substâncias químicas produzidas pela combustão normal com o uso do tabaco

convencional (Famele et al., 2015). Desta forma, os fumantes poderiam conviver de

maneira “segura” com os não fumantes em um mesmo ambiente que estaria livre da

poluição produzida pelo tabaco (Grana et al., 2014; Famele et al., 2015). Além disso,

por haver menor número de componentes nestes líquidos, comparado com os

cigarros industrializados, estudos mostram que o E-cig produz menos substâncias

tóxicas (Goniewicz et al., 2014; Shahab et al., 2017). Devido a isso, alguns

acreditam que os E-cig possam ser menos nocivos que o cigarro industrializado, o

que seria interessante para aqueles pacientes que não desejam parar com o hábito

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separação de um pequeno fragmento de núcleo, que se apresenta como uma

estrutura arredondada ao lado do núcleo principal, e a isto denomina-se MN.

Acredita-se que agentes carcinógenos causem esse tipo de alteração precoce, antes

que ocorram alterações histopatológicas e clínicas, principalmente em mucosa bucal

(Carvalho et al., 2002; Freitas et al., 2003; Çelik et al., 2003; Holland et al., 2008;

Lima et al., 2010; Oliveira et al., 2012; Dosi et al., 2016). Estudos têm evidenciado a

relação entre o tabagismo e a presença de MN, que por sua vez parece estar

associado ao processo de carcinogênese (Stich et al., 1982; Roberts, 1997; Bloching

et al., 2000; Dietz et al., 2000; Oliveira et al., 2012; Kumar et al., 2016).

Além da formação de MN, outras alterações nucleares podem ser formadas

e avaliadas em decorrência de aberrações cromossômicas, sendo denominadas

anomalias metanucleares. Estas anomalias também podem ser indicativas de

citotoxicidade e genotoxicidade. São consideradas anomalias metanucleares:

cariólise, cariorrexe, binucleação, broken eggs e nuclear bud. Elas podem ocorrer

devido a lesão e morte celular, além de defeitos durante a divisão das células

(Roberts, 1997; Oliveira et al., 2012; Kumar et al., 2016).

A cariólise caracteriza-se pela dissolução nuclear sendo observada pela falta

de coloração do núcleo celular, como uma resposta a lesões celulares que ocorrem

frequentemente em células do epitélio não queratinizado. Já a cariorrexe é a

desintegração do núcleo que causa a formação de pequenos fragmentos deste

material nuclear durante o processo de necrose e apoptose. A binucleação celular é

a formação de dois núcleos em uma mesma célula, que ocorre durante o processo

de diferenciação. O termo broken egg é designado para caracterizar um núcleo

dividido, cujas partes são ligadas por uma banda de material Feulgen-negativo

(Tolbert et al., 1992 ). E por fim, o termo nuclear bud é utilizado para definir

estruturas que causam a expulsão do conteúdo de DNA indesejado, durante a

divisão celular, e alguns autores acreditam que podem ser precursores de MN (Dutra

et al., 2010).

Para Tolbert et al. (1992), a carcinogênese está relacionada à citotoxicidade

por meio da proliferação celular, sendo os agentes citotóxicos promotores da

carcinogênese. Enquanto que a genotoxicidade está mais relacionada à indução da

apoptose, promovendo a iniciação da carcinogênese. Em relação aos MN e às

anomalias metanucleares, Tolbert et al. (1992) consideram MN, binucleação, broken

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egg e cariorrexe indicadores de genotoxicidade; cariólise e cariorrexe de

citotoxicidade.

A binucleação trata-se de uma alteração provocada por interferências durante

a divisão celular. Os nuclear buds quando descritos pelos autores, tinham origem

incerta e eram denominados de Broken eggs , porém atualmente, parecem ser

formados devido à expulsão do DNA amplificado do núcleo principal (Dutra et al.,

2010). A cariólise está associada à resposta adaptativa frente a lesões celulares e

pode ser reflexo de danos grosseiros à célula levando à morte celular por necrose. O

mesmo é observado na cariorrexe, porém, neste tipo de anomalia pode ser

observada morte celular em estágios mais iniciais caracterizada por apoptose. A

radiação ionizante e substâncias químicas se relacionam com o DNA das células,

podendo estimular apoptose. A apoptose em níveis normais pode exercer proteção

por eliminar células com alterações genéticas, porém em excesso é um importante

indicador de agressão genotóxica.

Figura 1 - Esquema ilustrativo dos danos celulares provenientes da exposição à

agentes genotóxicos e citotóxicos

Fonte: Adaptado de Tolbert et al. (1992).