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I. Introdução

Caraterização molecular e funcional de variantes alfa de hemoglobina identificadas no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra

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muito acentuada da produção de cadeias  e , e um aumento na produção das cadeias  e . Após o nascimento a produção das cadeias globínicas  dá lugar à produção das cadeias . Adicionalmente, nesta fase verifica-se a produção muito reduzida de cadeias . Adaptado de Schechter et al ., 2008.

Cada uma das cadeias globínicas da Hb encontra-se ligada a um grupo heme, o qual contém um ião ferro na sua cavidade central. Este ião coordena a seis ligandos, quatro átomos de azoto (N) que pertencem ao anel tetrapirrólico da protoporfirina, um N do grupo imidazol da histidina proximal (His87) e uma molécula de O 2 (Figura 2) (Clark et al. , 2004, Schechter et al ., 2008, Berg et al ., 2008, Gell et al ., 2009, Pittman et al ., 2011). Para que ocorra a ligação reversível de O 2 à Hb é necessário que o ião ferro encontre-se no estado ferroso (Fe2+).

Figura 2: Constituição da Hb A na forma desoxigenada (A) e do grupo heme (B). A) A Hb A é constituída por quatro cadeias globínicas, duas do tipo  (coloridas a rosa) e duas do tipo  (coloridas a azul escuro). Cada cadeia liga a um grupo heme (colorido a azul claro). B) O grupo heme apresenta na sua cavidade central um ião ferro (colorido a vermelho), que coordena a seis ligandos, cinco átomos N (coloridos a azul escuro) e uma molécula de O 2. Quando a Hb encontra-se desoxigenada a molécula de O 2 não está ligada ao grupo heme. Imagens obtidas pelo programa PyMOL versão 1.5 e utilizando o ficheiro PDB ID: 2HHB.

Uma criança saudável com zero dias de vida apresenta nos seus eritrócitos aproximadamente 80% de Hb F e 20% de Hb A 2 , em relação à Hb total. Ao completar

Introdução

os seis meses de idade, os seus eritrócitos contêm aproximadamente 97% de Hb A, 2 a 3.5% de Hb A 2 e níveis de Hb F inferiores a 1%. Este último perfil mantém-se nos adultos (Schechter et al. , 2008, Muncie et al. , 2009).

1.1. HEMOGLOBINA ADULTA

Tal como referido anteriormente a Hb A é constituída por duas cadeias -globínicas e duas cadeias -globínicas e apresenta um peso total de 64 kDa.

A síntese das cadeias  e -globínicas é regulada pela presença de dois agrupamentos de genes, em que um está localizado no cromossoma 16 (16p13.3) e o outro no cromossoma 11 (11p15.5). Em cada um dos agrupamentos os genes funcionais encontram-se organizados na ordem em que são expressos (Schechter et al ., 2008, Suemasu et al ., 2011, Pellegrini et al ., 2011). O agrupamento de genes que regula a produção das cadeias -globínicas abrange três genes funcionais que são, HBZ (), HBA2 (2) e HBA1 (1) (Figura 3) (Pellegrini et al ., 2011, Suemasu et al ., 2011, Wilber et al ., 2011). Por outro lado, o agrupamento de genes que regula a produção das cadeias -globínicas é constituído por cinco genes funcionais sendo estes, HBE (),

HBG2 (G), HBG1 (A), HBD () e HBB () (Pellegrini et al ., 2011).

Os genes 2 e  1 apresentam sequências nucleotídicas similares e codificam a mesma proteína (Figura 4A) (Voon et al., 2008, Moradkhani et al ., 2009). Tem-se verificado que 2 é expresso 2-3 vezes mais que 1 (Voon et al. , 2008) e que a regulação da expressão destes genes depende principalmente da presença de HS-40, uma sequência conservada hipersensível à ação da enzima DNase I (Gobbi et al. , 2007, Rugless et al. ,

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As cadeias  e -globínicas apresentam uma estrutura primária constituída por 141 e 146 aminoácidos, respetivamente. As estruturas secundárias de ambas as cadeias são caraterizadas pela presença de sete e oito segmentos de hélice , respetivamente, sendo estas designadas por uma letra de A a H (Figura 4B) (Manca e Masala, 1992, Schechter et al., 2008). As várias hélices organizam-se originando uma estrutura globular compacta que pode heterodimerizar e originar a estrutura tetramérica da Hb (Schechter et al. , 2008).

Figura 4: Sequência de aminoácidos das cadeias  -globínicas (A) e posição das hélices na Hb (B). Os genes 2 e 1 codificam a mesma proteína que é constituída por 141 aminoácidos. Os primeiros dois aminoácidos, Val1 e Leu2 encontram-se em NA1 e NA2 respetivamente. Os aminoácidos Ser3 a Gly18 estão na hélice A. O resíduo Ala19 encontra-se na dobra AB. Os aminácidos His20 a Ser35 encontram-se na hélice B. Os seguintes sete aminoácidos, Phe36 a Tyr42 estão na hélice C. Os resíduos Phe43 a Gly51 encontram-se na dobra CE e os resíduos Ser52 a Ala71 estão na hélice E. Os aminoácidos Leu80 a Ala88 encontram-se na hélice F e os próximos cinco, de His89 a Val93 na dobra FG. Os aminácidos Asp94 a His112 estão na hélice G, seguindo-se os aminoácidos Leu113 a Phe117 que estão na dobra GH. Os resíduos Thr118 a Ser138 encontram-se na hélice H e os restantes três aminoácidos, Lys139, Tyr140 e Arg estão em HC (Manca e Masala, 1992). Sequência retirada da base de dados Uniprot, P (HBA HUMAN).

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A montagem do tetrâmero  2  2 origina interfaces - (designada por  1 2), - (designada por  1 2) e - (designadas por  1 1 ou  1 2). As interfaces  1 2 e  1  2 formam um canal e apresentam locais de ligação para efetores alostéricos. Apenas se verifica a ocorrência de contatos diretos entre as subunidades da interface  1 2, ocorrendo interações iónicas entre o resíduo Arg141 (localizado no C-terminal) de

uma cadeia  e os resíduos Asp126 e Lys127 localizados na cadeia  oposta. Contrariamente, as subunidades das interfaces  1 2 e  1 1 apresentam contatos

extensivos. A interface  1 2 é altamente polar e dinâmica e a interface  1 1 é estática e menos polar (Kavanaugh et al., 2001).

Desta forma, verifica-se que as cadeias  são constituídas por diferentes aminoácidos que contribuem mais ou menos para a estabilidade e função da Hb. Esta contribuição depende da localização dos mesmos e das suas propriedades. Os aminoácidos mais importantes localizam-se nos contatos de empacotamento e nos contatos deslizantes, na zona de ligação da proteína estabilizante de -Hb (AHSP) e no contato com o grupo heme (Tabela 1) (Manca e Masala, 1992, Yu et al. , 2009).

1.1.1. CONTATOS 

As interfaces -, presentes na Hb A, apresentam contatos extensivos que são conhecidos por contatos de empacotamento ( 1  1 e  2  2 ) e contatos deslizantes ( 1  2 e  2  1 ) (Kavanaugh et al ., 2001, Shikama et al. , 2003, Baudin-Creuza et al ., 2004, Manconi et al ., 2010). Os contatos de empacotamento são formados maioritariamente por aminoácidos dispostos nas hélices B, G e H e na dobra GH, e intervêm principalmente ao nível da estabilização das ligações de O 2 à Hb. A formação correta

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Figura 5: A) Estrutura do complexo  -Hb-AHSP. A cadeia -globínica e a AHSP encontram-se coloridas a azul e verde, respetivamente. B) Representação dos aminoácidos envolvidos no complexo  -Hb-AHSP. As cadeias laterais dos aminoácidos da cadeia  e da proteína AHSP que participam no complexo encontram-se coloridas a laranja e amarelo, respetivamente. As pontes de hidrogénio (H) surgem a vermelho (a tracejado) e os átomos de O e N encontram-se coloridos a vermelho e azul, respetivamente. Os aminoácidos mais importantes da cadeia  para o contato -Hb-AHSP são Lys99, His103, Phe117 e Pro119. Adaptado de Feng et al ., 2004. Tabela 1: Lista de aminoácidos das cadeias  -globínicas que contribuem muito para a estrutura e/ou função da Hb. Estes encontram-se dispostos nos contatos , na zona da ligação da AHSP e no contato com o grupo heme (Manca e Masala, 1992, Yu et al. , 2009). Localização na Hb Aminoácidos Contatos deslizantes  1  2 e  2  1

Pro37, Thr38, Lys40, Thr41, Tyr42, Pro44, Ala88, Leu91, Arg92, Asp94, Pro95, Val96, Asn97, Tyr140, Arg Contatos de empacotamento  1  1 e  2  2

Arg31, Leu34, Ser35, Phe36, His103, Leu106, Val107, Ala110, Ala111, Pro114, Phe117, Thr118, Pro119, His122, Ala123, Asp Locais de ligação da AHSP Lys99, His103, Phe117, Pro119, Ala123, Asp Contato com o grupo heme Met32, Thr39, Tyr42, Phe43, His45, Phe46, His58, Val62, Leu83, Leu86, His87, Leu91, Val93, Asn97, Phe98, Leu101, Leu129, Val132, Leu

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1.1.3. FUNÇÃO DA HB A

A principal função da Hb é realizar o transporte de O 2 dos pulmões para os restantes tecidos do corpo, de forma controlada e eficiente. Esta é uma proteína alostérica e cooperativa.

O processo de oxigenação ocorre devido a alterações na estrutura quaternária da Hb (Figura 6). Esta pode-se apresentar na forma relaxada (R ou oxi-Hb) ou na forma tensa (T ou desoxi-Hb), estando associadas a alta e baixa afinidade para o O 2 , respetivamente (Bruno et al. , 2001, Noble et al. , 2002, Shikama et al. , 2003, Nagatomo et al. , 2005, Schay et al. , 2006, Kovalevsky et al. , 2010). Por outro lado a ligação de uma molécula de O 2 a uma subunidade da Hb leva a que ocorra a ligação de outras moléculas de O 2 , às subunidades livres, com maior afinidade (Lukin et al. , 2003, Fischer et al. , 2011, Steinberg et al. , 2011).

A ligação de moléculas de O 2 à Hb pode ser modulada pela presença de efetores heterotrópicos, tais como, iões hidrogénio (H+) e (2,3-DPG). A presença de H+ associada à diminuição do pH é conhecida por efeito de Bohr. A presença de H+^ e 2,3- DPG diminui a afinidade da Hb para o O 2 (Lukin et al. , 2003, Nagatomo et al. , 2005, Marengo-Rowe et al. , 2006, Kovalevsky et al. , 2010).

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2.HEMOGLOBINOPATIAS

A presença de mutações que afetem o padrão normal de expressão dos genes globínicos leva ao aparecimento das hemoglobinopatias, sendo estas um dos maiores problemas de saúde a nível mundial. A Organização Mundial de Saúde (WHO) estima que aproximadamente 7% da população mundial é portadora de um tipo de hemoglobinopatia (Olufeni et al. , 2011, Wajcman et al. , 2011, Kohne et al. , 2011).

Em Portugal, na população nativa portuguesa, verifica-se uma baixa prevalência das hemoglobinopatias, sendo estas mais frequentes nas zonas Centro e Sul do país. Por outro lado, tem-se verificado um aumento acentuado no número de imigrantes (principalmente vindos de África, Brasil, Europa do Leste e Ásia) a viver em Portugal, tornando desta forma as hemoglobinopatias mais frequentes (Bento et al ., 2006).

As hemoglobinopatias foram identificadas inicialmente na zona do Mediterrâneo e em algumas zonas dos continentes Ásia e África, principalmente em regiões associadas a altas taxas de ocorrência de malária (Figura 7). O aumento da taxa migratória tem levado a uma distribuição das hemoglobinopatias por todo o mundo (Harteveld et al. , 2010, Weatherall et al. , 2011).

As mutações podem originar alterações qualitativas ou quantitativas, resultando na síntese de Hbs com estrutura alterada (variantes de Hb) ou síntese de cadeias globínicas em níveis reduzidos (talassémias) (Clark et al. , 2004, Kohne et al. , 2011).

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Figura 7: Distribuição mundial das hemoglobinopatias e sobreposição com a distribuição geográfica da malária. Retirado de Harteveld et al. , 2010.

Na maioria dos casos, os indivíduos portadores de hemoglobinopatias são assintomáticos. Por outro lado, os indivíduos que apresentam a mutação ou várias mutações em homozigotia apresentam um fenótipo clínico grave (Clark et al ., 2004).

2.1.TALASSÉMIAS

As talassémias são caraterizadas por uma redução na taxa de síntese das cadeias globínicas, devido à presença de mutações nos respetivos genes globínicos (Sarnaik et al. , 2005). A redução poderá ser total ou apenas parcial, resultando desta forma num fenótipo de talassémia 0 ou talassémia + (Sarnaik et al. , 2005, Vichinsky et al,. 2009, Harteveld et al,. 2010, Fucharoen et al. , 2011).

Os genes  e -globínicos são os genes mais afetados com este tipo de doença (Sarnaik

et al. , 2005, Kohne et al. , 2011). As -talassémias têm como origem frequente a presença de deleções que envolvam um ou os dois genes -globínicos de cada

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associada a um dos seguintes genótipos --/- ou --/T. A taxa de síntese das cadeias  encontra-se bastante reduzida. Em casos extremos, os quatro genes  de um indivíduo podem-se encontrar inativos resultando em -talassémia major (Síndrome de hidrópsia fetal). A síntese das cadeias  é nula, resultando na presença de anemia intrauterina severa e morte fetal ou poucas horas após o nascimento do indivíduo (Tabela 2) (Sarnaik et al. , 2005, Muncie et al. , 2009, Harteveld et al. 2010, Nadkarni et al. 2010). A severidade do fenótipo apresentado está relacionada diretamente com o número de genes -globínicos afetados. Em geral, o fenótipo associado à ocorrência de - talassémia é caraterizado por um grau variável de anemia, diminuição dos valores de Hb globular média (HGM) e volume globular médio (VGM), níveis de Hb A 2 normais ou ligeiramente reduzidos e níveis de Hb F normais. No período fetal podem surgir também tetrâmeros de cadeias  - Hb Bart e no período pós-natal podem surgir tetrâmeros de cadeias  - Hb H (Harteveld et al. 2010, Nadkarni et al. 2010, Suemasu et al. , 2011).

Tabela 2: Fenótipos, número de genes -globínicos ativos, rácio das cadeias globínicas /, haplótipos e genótipos apresentados na presença de -talassémia. Fenótipo (^) #genes  - globínicos

Rácio das cadeias globínicas  / 

Haplótipo Genótipo

Normal (^4 1) ,  / Estado silencioso 3 0.8 (^) +,  - / Talassémia minor 2 0.6 (^) ^0 ,  or +, +^ --/ or - /- Talassémia intermédia 1 0.3 (^) ^0 , +^ --/- Talassémia major (^0 0) ^0 , ^0 --/--

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2.2.VARIANTES DE HB

As variantes de Hb são caraterizadas pela presença de mutações nos genes globínicos, que podem ser substituições, deleções ou inserções de um ou mais nucleótidos (Anexo 1). Desta forma são sintetizadas cadeias globínicas com a sequência de aminoácidos alterada. Em 95% dos casos as variantes de Hb resultam de mutações pontuais – mutações missense (Fais et al. , 2010). O local afetado e a natureza dos aminoácidos envolvidos determina a gravidade do fenótipo associado à variante de Hb. Estas podem apresentar vários fenótipos, caraterizados por, formação de células falciformes, instabilidade, afinidade para o O 2 alterada (diminuída ou aumentada), capacidade de transporte de O 2 diminuída e fenótipo talassémico (Kohne et al. , 2011, Fais et al. , 2010). Na maioria dos casos as variantes quando em heterozigotia são assintomáticas.

De acordo com os dados inseridos na base de dados HbVar encontram-se descritas 1162 variantes estruturais de Hb. As variantes mais frequentes resultam de mutações nos genes  e -globínicos, estando associadas a percentagens de 36.57% e 49.14%, respetivamente (Tabela 3).

Ao nível dos genes -globínicos encontram-se descritas 424 variantes, sendo que 141 ocorrem no gene 2, 87 no gene 1 e 197 ocorrem em ambos os genes.

As variantes, Hb J-Paris-I [12(A10)AlaAsp (GCCGAC) (2 ou 1)], Hb Lisbon

[23(B4)GluAsp (GAGGAT) ( 2 ou 1)], Hb Evora [35(B16)SerPro (TCCCCC) (2)], Hb Parma [A2] [59(E8)GlySer (GGCAGC) (2)], Hb G-

Georgia [95(G2)ProLeu (CCGCTG) (2)], Hb Palmela [115(GH3)AlaVal (GCCGTC) (1)], Hb Portimão [132(H15)ValMet (GTGATG) (1)], Hb Esch

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se verificar a ocorrência de hemólise crónica e vaso-oclusão intravascular (Wu et al. , 2005, Steinberg et al ., 2008).

2.2.2.VARIANTES INSTÁVEIS

A estabilidade da estrutura tetramérica da Hb depende principalmente da posição molecular dos resíduos não polares (que se encontram principalmente no interior da proteína) e dos contatos de empacotamento ( 1  1 e  2  2 ). Estes mantêm as quatro cadeias globínicas juntas e controlam a proximidade com o grupo heme (Wajcman et al. , 2008).

Ao nível dos contatos  1  1 as variantes instáveis surgem principalmente devido a mutações nas hélices C, G e H, que podem destabilizar os contatos hidrofóbicos internos e/ou a interface  1  1 (Wajcman et al. , 2008).

Os mecanismos fisiológicos responsáveis pela instabilidade das cadeias globínicas mutadas e pela baixa síntese das mesmas não são claros. É proposto que, a formação de ARN mensageiro instável com um curto período de vida leve a uma baixa expressão de variantes instáveis; a presença de variantes instáveis aumentam a tendência para a desagregação dos grupos heme das cadeias globínicas levando à produção de ROS que podem levar à ocorrência de eritropoiese ineficiente e apoptose; por último, as cadeias mutadas podem não apresentar a capacidade de ligar à AHSP, não ocorrendo o processo de destoxificação (Wajcman et al. , 2008).

As Hbs instáveis tendem a precipitar nos eritrócitos e a formar corpos de Heinz, podendo levar ao aparecimento de anemia hemolítica (Sarnaik, e t al. , 2005, Wajcman et

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al. , 2008, Manconi et al ., 2010). Estas estão muitas vezes associadas a um fenótipo de -talassémia (Garçon et al. , 2010).

2.2.3.VARIANTES COM AFINIDADE PARA O O 2 ALTERADA

Em indivíduos com Hb normal a curva de dissociação do oxigénio representa a reação da Hb com as moléculas de O 2 , a qual deverá apresentar uma forma sigmoidal devido à presença de cooperatividade. Esta pode ser modificada devido ao efeito de Bohr, mudanças de temperatura e presença de 2,3-DPG (Marengo-Rowe et al. , 2006).

A presença de mutações principalmente ao nível dos contatos  1  2 pode alterar a afinidade da molécula por O 2 a qual será facilmente identificada pela curvas de dissociação do oxigénio correspondentes (Sarnaik et al. , 2005). Podem também se verificar mutações na zona de contato com o grupo heme e na zona de ligação do 2,3- DPG (Sarnaik et al. , 2005, Marengo-Rowe et al. , 2006).

As variantes caraterizadas por um fenótipo de alta afinidade apresentam uma curva de dissociação de oxigénio desviada para a esquerda, já as variantes com fenótipo de baixa afinidade apresentam uma curva desviada para a direita (Marengo-Rowe et al. , 2006).

A nível clínico, os indivíduos com Hbs de alta afinidade podem apresentar eritrocitose, e os indivíduos com Hbs de baixa afinidade podem apresentar cianose.

2.2.4 VARIANTES COM CAPACIDADE DE TRANSPORTE DE O 2 DIMINUÍDA

O ião ferro do grupo heme deve encontrar-se no estado de oxidação 2+ permitindo assim a combinação com O 2. Se ocorrer oxidação, o ião encontrar-se-á no estado de