Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
INGLID FONTOURA DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA DE BACTÉRIAS EM
CULTURAS PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR
São José dos Campos, SP
2010
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Identificação rápida de bactérias por espectroscopia no infravermelho, Redação de Biofísica
Um estudo sobre a utilização da espectroscopia no infravermelho para a identificação rápida de bactérias responsáveis por infecções no ambiente clínico. O estudo investigou a capacidade da microespectroscopia de ft-ir para discriminar entre diferentes classes de bactérias, identificar culturas puras e mistas com pouca preparação de amostra e um curto tempo de incubação. O documento também apresenta uma revisão sobre a espectroscopia no infravermelho, sua instrumentação necessária, análise e pré-processamento espectral, e trabalhos recentes que envolvem a espectroscopia no infravermelho como método para identificação de bactérias.
Tipologia: Redação
2010
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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
INGLID FONTOURA DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA DE BACTÉRIAS EM
CULTURAS PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR
São José dos Campos, SP 2010
INGLID FONTOURA DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA DE BACTÉRIAS EM
CULTURAS PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR
Dissertação apresentada no Programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientador: Profº. Dr. Airton A. Martin. Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Angélica G. Cardoso.
São José dos Campos, SP 2010
INGLID FONTOURA DA SILVA
"cARAcrERrzAçÃo E IDENTIFTCAçÃoRÁPDA^ DEBAcrÉRrÁs EM cur-TnRAs
PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR''
Dissertaçãoaprovadacomo rcquisito parcial à obtençãodo grau de Mestre eÍn Engenharia Biomédica,do Programade Pós-GÍaduaçãoem EngenhariaBiomédica,do Institutode Pesquisa e Desenvolüm€ntoda^ Universidadedo Vale do Pafaíba,SãoJosédosCampos,SP,pela seguinte bancaexaminadora:
PTOf.DTA.MARIA ANGÉLICA GARGIONE CARDOSO (TINIVAP) Prof. Dr. AIRTON A. MARTIN^ (UNIVAP) Prof. Dr. FRÂNCISCO GARCIA SORIAIIO
Prof. Dra. SandraMar;aFonsecada^ Costa DiretordolP&D^ Univap SãoJosédosCampos,^21 demaiode2010.
Aos meu pais pelo amor incondicional, por mais uma vez confiarem em mim e por mais uma vez abrirem mãos de sonhos. Aos meu tios, meus pais em São José dos Campos, pela dedicação, pelo ombro e pelo colo. Ao meu irmão e meus primos (Anderson e Cléia) pela amizade, companheirismo e favores prestados durante todo o mestrado. Ao meu tio Germino ( in memoriam) por ter sido um GRANDE tio e por ter me ensinado tantos valores. A Frei Dilson e Dewar por me ajudarem dar o primeiro passo rumo a este mestrado. A Mara por me ensinar a me encontrar. A Primeira Igreja Batista, ao PG e ao meu grupo de apoio por me conduzirem ao caminho do Pai. Ao Pr. Paulo Mizoguchi, Min. Flávio, Diogo, Douglas, Robson e Priscila pelas orações.
A Deus (meu Pai) por abrir caminhos, por me sustentar, por ter me dado forças e por ter colocado tantas pessoas essenciais na execução deste trabalho. Ao Prof. Airton pela orientação, pela paciência, pela confiança, por acreditar nos meus sonhos e por ter me apresentado a família LEVB. A Profª Drª Maria Angélica Gargione Cardoso pela co-orientação deste trabalho, pela sinceridade e por abrir as portas de seu laboratório, onde foi possível dar os primeiros passos deste trabalho. Ao CNPq por bolsa de mestrado concedida. As professoras: Ms. Sônia Khouri e Drª. Kumiko Sakane, que me ensinaram a base de microbiologia e espectroscopia no infravermelho e não mediram esforços para me ajudar. Ao Prof. Dr. Leandro Raniero por ter me acompanhado no início do trabalho, quando tudo era sonho, no término, nas traduções e nas discussões. O seu apoio foi essencial. Ao Prof. Dr. Mituo Uehara pela preparação de trabalho (Uberlândia).
Fiz mais do que posso Vi mais do que agüento E a areia dos meus olhos é a mesma Que acolheu minhas pegadas Depois de tanto caminhar Depois de quase desistir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. Eu lutei contra tudo Eu fugi do que era seguro Descobri que é possível viver só Mas num mundo sem verdade. Depois de tanto caminhar Depois de quase desistir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. Sem medo de Te pertencer. Voltam pra Você. Depois de tanto caminhar Depois de quase desistir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. Meus pés cansados de lutar Meus pés cansados de fugir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. (S. Leah)
Caracterização e identificação rápida de bactérias em culturas puras e mistas por microespectroscopia FT-IR
RESUMO
As doenças infecciosas são uma das causas mais frequentes de mortalidade mundial, ficando atrás somente das doenças cardíacas, cerebrovasculares e cânceres. O tempo exigido para a identificação de microrganismos patogênicos responsáveis pelas doenças infecciosas é causa determinante de taxas de mortalidade relacionadas a infecções de pacientes hospitalizados. A maioria dos sistemas de identificação disponíveis em hospitais é baseada na observação de características fisiológicas e nutritivas dos microrganismos e aplicação de testes bioquímicos com uma estadia de 24 h até 5 dias para o resultado. Uma técnica diferente aos métodos tradicionais de identificação de microrganismo é baseada em espectroscopia no infravermelho. Esta técnica é caracterizada por mínima manipulação da amostra e não são exigidos testes bioquímicos fornecendo uma alternativa potencial para a identificação rápida de bactérias. Com o objetivo de investigar a potencialidade da espectroscopia no infravermelho como uma ferramenta para identificação rápida de bactérias responsáveis por infecções em ambiente clínico o estudo foi realizado. As bactérias usadas no estudo foram obtidas da coleção de cultura do Instituto Oswaldo Cruz – Brasil. Escherichia coli ATCC 10799, Proteus mirabilis ATCC 25933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 14456, Staphylococcus epidermidis ATCC 9300 e Enterococcus faecalis ATCC 10100 foram analisadas. O estudo foi realizado em culturas puras e mistas e examinadas em triplicata. Os inóculos foram preparados segundo a escala de McFarland 0,5, incubados a 37°C por 6 horas, diluídos em solução salina, depositados em janela de CaF2 e submetidos a estufa para obtenção de filme fino. As amostras foram mensuradas no Spectrum Spotlight 400 (Perkin-Elmer) no intervalo de 4000-900 cm -1^ com 32 varreduras realizadas por transmitância em modo de ponto e imagem. Os dados tratados serviram de entrada para análise de cluster usando a primeira derivada e o algoritmo Ward’s foi aplicado, uma excelente discriminação entre as bactérias foi obtida. A microespectroscopia FT-IR associado à análise de cluster demonstrou ser uma ferramenta efetiva na identificação de bactérias em culturas puras e na identificação de culturas puras e mistas com mínima manipulação de amostra e com tempo de incubação de apenas 6 horas. A técnica se mostrou rápida, reprodutível, com os espectros das triplicatas classificados corretamente.
Palavras-chave: Identificação rápida, bactérias, cultura pura, cultura mista, microespectroscopia FT-IR, análise estatística multivariada.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 28 - Espectro de absorção da janela de CaF 2 ........................................... 69 Figura 29 - Espectro típico de fundo .................................................................... 69 Figura 30 - Mapa da amostra de Proteus mirabilis associado aos vinte espectros realizados aleatoriamente na amostra e mapa da amostra de Staphylococcus aureus associado aos vinte espectros realizados na borda da amostra ................................................................................................................ 70 Figura 31 – Regiões do filme fino de Staphylococcus aureus ....................................................... 71 Figura 32 - Espectro característico de bactéria com as principais bandas de vibrações moleculares.......................................................................................... 71 Figura 33 - Movimentos moleculares de amida I e amida II de proteínas ............ 72 Figura 34 - Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli , Proteus mirabilis , Pseudomonas aeruginosa , Enterococcus faecalis , Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis ................................................................................. 75 Figura 35 - Primeira derivada de ordem espectral em regiões significativamente diferentes de Escherichia coli , Proteus mirabilis , Pseudomonas aeruginosa , Enterococcus faecalis , Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis ..... 77 Figura 36 - Dendograma resultado da análise de cluster das seis bactérias examinadas em triplicata ..................................................................................... 78 Figura 37 - Dendograma resultado da análise de cluster da triplicata de Escherichia ........................................................................................................... 79 Figura 38 - Micrografia dos filmes finos de Escherichia coli , Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus ...................................... 80 Figura 39 - Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus ....................................... 81 Figura 40 - Primeira derivada da média espectral das amostras utilizadas no estudo, demonstrando diferenças de absorção nas regiões de 3000-2800 cm -1^ , 1470-1410 cm -1^ e 1176-950 cm -1^ ......................................................................... 82 Figura 41 - Dendograma resultado da análise de cluster das três inoculações examinadas em triplicata ..................................................................................... 84 Figura 42 – Filme fino de Escherichia coli associado ao mapa de absorção química de uma amostra e aos 64 espectros extraídos da matriz ...................... 85 Figura 43 – Filme fino de Staphylococcus aureus associado ao mapa de absorção química de uma amostra e aos 64 espectros extraídos da matriz ....... 86
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Ocorrência e características de alguns grupos funcionais ................. 24 Tabela 2 - Estruturas bacterianas correlacionadas à composição bioquímica .... 29 Tabela 3 - Comparação da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram- negativas ............................................................................................................. 34 Tabela 4 - Características usadas para identificação de bactérias ..................... 41 Tabela 5 - Principais grupos funcionais e suas respectivas energias vibracionais ............................................................................................................................. 54 Tabela 6 - Meios seletivos onde as bactérias foram inoculadas .......................... 63 Tabela 7 - Sumários dos estudos realizados, espectros coletados e modo de aquisição ............................................................................................................. 66 Tabela 8 - Atribuição de bandas detalhada associada à composição bioquímica e estrutura celular ................................................................................................ 73 Tabela 9 – Simulação do crescimento exponencial de Escherichia coli com tempo de incubação de 6 horas a partir de uma célula bacteriana ..................... 83 Tabela 10 – Simulação do crescimento exponencial de Staphylococcus aureus com tempo de incubação de 6 horas a partir de uma célula bacteriana ............. 83
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
a - assimétrico A - adenina A/D - analógico-digital ANN (artificial neural network) - rede neural artificial ATCC ( American Type Culture Collection ) - Coleção de cultura americana BaF2 - fluoreto de bário BHI (brain heart infusion) - infusão de cérebro e coração ºC - grau Celsius C - citosina CaF2 - fluoreto de cálcio CLTs - cadeias laterais de tetrapeptídeos Cm -1^ - centímetro a - Dn - dina DNA - ácido desoxirribonucléico DTGS - sulfato de triglicina E. coli - Escherichia coli FIR - infravermelho distante FT - transformada de Fourier g - grama G - guanina HCA (Hierarchical Cluster Analysis) - análise de cluster IR - infravermelho K - Kelvin LPS - lipopolissacarídeos MCT - telureto de cádmio e mercúrio μm - micrômetro MIR - infravermelho médio NAG - N-acetilglicosamina NAM - ácido N-acetilmurâmico NIR - infravermelho próximo OMP (Outer membrane proteins) - proteínas de membrana externa
LISTA DE SÍMBOLOS
α - alfa β - beta
- constante de ligação
δ - deformação ν - estiramento º - grau μ - mi (massa reduzida)
- negativo
- pi
% - por cento
- positivo
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
As doenças infecciosas são uma das causas mais frequentes de mortalidade mundial sendo responsáveis por 25% das mortes globais, mais de 14 milhões de mortes por ano; ficando atrás somente das doenças cardíacas, cerebrovasculares e cânceres. Elas são responsáveis por 29 das 96 principais causas de morbidade e mortalidade humanas listadas pela Organização Mundial de Saúde (MURRAY; LOPEZ, 1997; TAYLOR; LATHAM; WOOLHOUSE, 2001; WENZEL, 1998; WHO, 2004). Essas manifestações são frequentes em pacientes graves internados em Unidade de Terapia Intensiva, com infecções comumente relatadas em locais como: corrente sanguínea, trato-urinário, trato-respiratório, sítios intra-abdominais e feridas cirúrgicas (IBRAHIM et al. , 2000; REIMER; WILSON; WEINSTEIN, 1997). A estimativa da incidência de infecções e suas consequências, como a sepse, é crescente, principalmente em idosos, em pacientes contaminados com microrganismos resistentes ao tratamento, ou com sistema imunológico comprometido ou até aqueles pacientes que se submetem à cirurgia de alto risco por tempo prolongado (RUSSEL, 2006). Uma abrangente revisão de literatura identifica 1415 espécies de organismos infecciosos conhecidos por serem patogênicos aos humanos, são eles: bactérias, vírus, fungos ou parasitas, entre os quais estão presentes 538 bactérias (TAYLOR; LATHAM; WOOLHOUSE, 2001). O tempo exigido para a identificação destes microrganismos patogênicos é causa determinante de taxas de mortalidade relacionadas a infecções de pacientes hospitalizados (IBRAHIM et al. , 2000). Apesar dos esforços no desenvolvimento de métodos diretos para o diagnóstico rápido de doenças infecciosas ou detecção de microrganismos, o método de cultura permanece o padrão-ouro para a identificação bacteriana devido à sua sensibilidade, simplicidade, baixo custo e alta qualidade. A maioria dos sistemas de identificação disponíveis em hospitais é baseada neste método, que requer a observação de características fisiológicas e nutritivas dos microrganismos e aplicação de testes bioquímicos. Estes sistemas exigem uma cultura microbiana pura e 24 h até 5 dias para o resultado. Entretanto em situações de emergência onde são necessárias ações imediatas, mesmo antes do resultado
de identificação, é comum a administração do tratamento empírico com antibióticos de largo-espectro baseado na experiência clínica e conhecimento da patogênese e epidemiologia das infecções. O risco desta prática pode conduzir efeitos secundários tóxicos adversos, entre eles à resistência aos agentes antimicrobianos e a nefrotoxicidade (ATLAS, SNYDER, 2006; SANDT et al. , 2006; STENDER et al. , 2002, MAQUELIN et al. , 2003). A administração inicial inadequada da terapia antimicrobiana aos pacientes criticamente doentes com infecção está também associada a uma mortalidade maior (IBRAHIM et al., 2000). Estudos conduzidos por Barefanger, Drake e Kacich (1999), Doern et al. (1994) e Kerremans et al. (2008) demonstram que a identificação do microrganismo, em um menor tempo, permite ao clínico administrar um antimicrobiano mais específico e consequentemente mais eficaz, o que reduziria a duração de permanência em leito hospitalar, dos custos associados à doença e da taxa de morbidade e mortalidade. A questão da identificação rápida do microrganismo ainda são dificuldades encontradas nos dias atuais. Nos últimos anos novas técnicas têm sido desenvolvidas para a identificação de microrganismos, existindo um interesse na descoberta de novos métodos analíticos, principalmente aqueles que permitem a execução mais rápida da análise do material de pacientes com suspeita de infecção. Entre as técnicas que oferecem possibilidades para a análise rápida, os métodos de biologia molecular se destacam por serem sensíveis para a identificação de microrganismos patogênicos. A maioria dos testes é baseada em sequências específicas de DNA permitindo a identificação específica. Entretanto, estas técnicas diagnósticas moleculares possuem custos elevados e são pouco práticas para utilização em laboratórios de rotina, principalmente para estudos em controle de infecção que exige uma rápida e simples metodologia para a identificação (ERUKHIMOVITCH et al. , 2005; KIRSCHNER et al, 2001). Uma técnica diferente aos métodos tradicionais de identificação de microrganismo é baseada em espectroscopia no infravermelho. Esta técnica é caracterizada por mínima manipulação da amostra, e não são exigidos testes bioquímicos fornecendo uma alternativa potencial aos métodos convencionais. Com esta técnica é possível fazer a análise do microrganismo em um tempo de cultura reduzido em comparação com os métodos comumente utilizados, permitindo a discriminação de células microbianas intactas, sem a sua destruição e fornecendo