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FACULDADE DE MEDICINA DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO - FAMERP
Laboratório de Imunogenética do Departamento de Biologia Molecular RELATÓRIO CIENTÍFICO PARCIAL Processo 2022/08270- 6 01/07/2022 a 28 / 02 /202 3 “Genotipagem de Toxoplasma gondii isolado em tecidos reprodutivos de cães e gatos” Relatório Científico Parcial, de Bolsa de Apoio Técnico – Treinamento Técnico III, apresentado à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP São José do Rio Preto - SP Fevereiro de 202 3
SUMÁRIO
- RESUMO ORIGINAL
- 2.SÍNTESE DAS ATIVIDADES REALIZADAS NO PERÍODO DESTE RELATÓRIO
- METODOLOGIA
- RESULTADOS PARCIAIS
- CRONOGRAMA PARA AS PRÓXIMAS ATIVIDADES
- ANEXOS
Introdução Gatos e cães são animais que convivem intimamente com humanos e quando portadores de determinadas zoonoses, elevam os riscos de transmissão da infecção aos seus proprietários, tutores, cuidadores e profissionais de saúde
veterinária. Neste contexto, o Toxoplasma gondii e a toxoplasmose ocupam
posição de destaque pois este parasito se vale de gatos como hospedeiros definitivos e de cães, como intermediários. Os primeiros casos de toxoplasmose foram registrados no município de São José do Rio Preto, SP, em 2015 (n=6) e em 2018 chegou a 104 casos (SINANWEB - Dados Epidemiológicos Sinan, 2019)(SINAN, 2019). Estes dados oficiais despertam a atenção para a necessidade de medidas de diagnóstico, prevenção e tratamento de animais de estimação acometidos por toxoplasmose. Embora São José do Rio Preto seja um município com excelentes condições sociais, econômicas, ambientais bem como apropriada infraestrutura e saneamento básico, casos de toxoplasmose em animais domésticos e em humanos ainda são relatados. Acredita-se que a maioria dos casos de toxoplasmose não é notificada possivelmente pela falta de conhecimento e conscientização da população sobre os desfechos desta doença na saúde humana e animal. O fato da
infecção por T. gondii apresentar evolução assintomática também contribui
para a desatenção. Neste contexto, a execução deste projeto agregará conhecimentos úteis para esclarecer pontos ainda obscuros na epidemiologia
da infecção por T. gondii e da toxoplasmose em animais de estimação, assim
como em meio ambiente, uma vez que animais abandonados em diversos pontos da cidade de São José do Rio Preto, SP, são levados ao CCZ-SJRP para castração e devolução ao local onde foram encontrados, contribuindo com a
infecção por T. gondii uma vez que oocistos podem ser liberados por toda a
vida nas fezes dos gatos infectados.
Vários estudos relataram elevada prevalência sorológica de infecção por T.
gondii em animais (Ergene et al., 2017; Calero-Berna and Gennari, 2019; Dubey
and Lindsay, 2019; Cunha et al., 2020; Dubey et al., 2020a; Fábrega et al., 2020). O DNA genômico deste parasito foi encontrado em vários tecidos de gatos (diafragma, cérebro, coração, rim, fígado, pulmões, baço, língua e músculo esquelético). (Dubey et al., 2020a)Há também demonstrações de sua presença na placenta de animais (Turner and Savva, 1990; Ergene et al., 2017; Teixeira et al., 2017; Varlet-Marie et al., 2018; Ren et al., 2019; Minuzzi et al., 2020). Em um estudo com inoculação experimental de cistos e taquizoítos de
T. gondii em gatos, não foi observada a presença deste parasita no sêmen e
em tecidos do testículo e do epidídimo(Teixeira et al., 2017). Estes autores
argumentam que a transmissão sexual de T. gondii em gatos não constitui uma
importante rota de disseminação do parasito. Contudo, ainda se desconhece se a infecção natural atinge os órgãos reprodutivos de gatos e cães. Recentemente, foram publicados artigos tratando exclusivamente sobre a toxoplasmose em cães e gatos, tendo um dos co-autores o doutorando vinculado a esse estudo. (Calero-Berna and Gennari, 2019; Dubey et al., 2020b, 2020a) Esse estudo está sendo executado pelo doutorando Fernando Murata (contemplado com bolsa CAPES-DS) e alunas de iniciação científica graduandas em medicina veterinária (duas delas contempladas com bolsa PIBIC-CNPq).
2.SÍNTESE DAS ATIVIDADES REALIZADAS NO PERÍODO DESTE RELATÓRIO
Os procedimentos realizados nesse estudo foram aprovados pelo CEUA-FAMERP e seguem as normativas do CONCEA. As atividades referentes a esse processo iniciaram em julho/2022, são vinculadas ao Auxílio Regular FAPESP 2020/03972-7, além de colaborar em outras atividades do grupo de pesquisa liderado pela orientadora.
2.2. Análise Sorológica Foram coletadas amostras de sangue periférico ou da jugular dos animais e transferidos para tubos seco e com EDTA. O soro foi utilizado para a
identificação de infecção por T. gondii com o uso de kit comercial de reação de
imunofluorescência indireta - RIFI (WAMA Diagnóstica). O procedimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. 2.3. Bioensaio em camundongos Para a realização do bioensaio foram utilizados camundongos Balb fêmeas ou machos provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). Os tecidos foram separados de acordo com o resultado da sorologia. Para amostras negativas foram realizados “pools” de cada grupo animal contendo até 5 amostras cada. As amostras com sorologia negativa foram digeridas individualmente. Amostras de tecido animal foram separadas e armazenadas em freezer - 20ºC para realização de PCR, e até 50 gramas de tecidos foram digeridos por pepsina de acordo com o protocolo de Dubey,
- (Dubey, 1998) Um mL do produto da digestão foi inoculado via subcutânea em camundongos do tipo Balb C de ambos os sexos. Os camundongos foram observados diariamente por um período de até 45 dias. Os animais que apresentaram sintomas de infecção foram eutanasiados para evitar sofrimento animal e tiveram os tecidos observados de acordo com o período de dias pós-inoculação. Para os animais que sobreviveram até 45 dias pós-inoculação, foi coletado sangue da região submandibular com o auxílio de uma lanceta, para realização da sorologia. Os
animais foram eutanasiados após esse período e foi realizado imprint de
fragmentos do cérebro em busca de cistos de bradizoíto. Animais que morreram de infecção aguda, tiveram o pulmão e lavado peritoneal coletados, e foi realizado a pesquisa de taquizoítos. A limpeza das gaiolas foi realizada semanalmente e descarte de maravalha, restos de ração foi acondicionado em sacos plásticos brancos (de
material biológico). As carcaças dos animais foram congeladas e descartadas seguindo as normas de descarte para esse tipo de material. 2.4. Cultivo Celular Para o cultivo celular foram utilizadas células do tipo VERO que são mantidas em estufa à temperatura de 37,0°C e concentração de CO2 a 3%. As células são observadas diariamente em microscópio de luz invertida e cultivadas de acordo com a necessidade de uso (criopreservação em nitrogênio líquido, descongelamento, repique e infecção). (Verma et al., 2017)Cistos ou taquizoítos encontrados em camundongos infectados foram inoculados em garrafas de cultura para reprodução dos mesmos. Atualmente a cultura celular é também utilizada para inoculação de tecidos humanos (sangue, líquido amniótico) de pacientes com lesões oculares ativas, gestantes e neonatos com infecção aguda, referentes aos projetos
orientados e coordenados pela Profa^ Cinara também sobre T. gondii, todos
aprovados pelo CEP-FAMERP e CEUA-FAMERP. 2.5. Análise Molecular O DNA genômico está sendo extraído das amostras congeladas dos animais já coletados, através de kits comerciais (Qiagen DNeasy Blood & Tissue kit). Os procedimentos estão sendo realizados de acordo com as especificações do fabricante e descritos e nossos estudos prévios.(Previato et al., 2015; Camilo et al., 2017)
3. METODOLOGIA
3.1. Coleta e processamento das amostras Os animais atendidos no CCZ-SJRP foram mantidos em gaiolas próprias até a realização do procedimento (Alesco). Com o animal anestesiado, foi
coletado um swab anal e oral, e armazenados em tubos do tipo Falcon de 15
mL para pesquisa de outros patógenos. Uma amostra de sangue foi coletada
⚫ Separar tubos de ensaio descartável ou limpos e identifica-los (Amostra
- diluição); ⚫ Diluir a amostra em 1:16 e ou 1:32. Aspirar as quantidades corretamente com calma, aspirar no primeiro estágio da pipeta, verificar se a amostra/tampão foi aspirada corretamente na ponteira livre de bolhas. Desprezar a amostra/tampão apertando a pipeta até o segundo estágio. Para a amostra de soro, homogeneizar a amostra no tampão com movimentos de aspirar e desprezar repetidamente;
- 1:16 – Amostra – 6,25 μl + Tampão fosfato-salino (PBS) kit – 93,5 μl total 100 μl
- 1: 32 – Amostra – 10 μl + Tampão fosfato-salino (PBS) kit – 310 μl – total 320 μl ⚫ Usar os controles positivos e negativos não diluídos; ⚫ Pingar 1 gota dos CONTROLES POSITIVO E NEGATIVO sem diluir, nas áreas 1 e 2 da lâmina, respectivamente. Evitar transbordar as áreas; ⚫ Pingar 1 gota dos SOROS DESCONHECIDOS em suas devidas diluições nas áreas restantes da lâmina, evitando transbordar; ⚫ Incubar em câmara úmida por 30 minutos, a temperatura ambiente; ⚫ Deixar os tampões PBS (preparados no laboratório) em temperatura ambiente para lavagem das lâminas, e separar os recipientes para a lavagem das lâminas;Remover as lâminas, uma por vez, da câmara úmida. Segurá-la por uma extremidade e com o auxílio de uma pipeta Pasteur, lavá-la no sentindo de cima para baixo a partir dos controles, dessa forma os controles positivo e negativo serão lavados em sentido que não atingiram outros poços com amostras. Colocar a lâmina em recipiente próprio para lavagem e acrescentar o PBS, não adicionando diretamente sobre a lâmina. Fazer o mesmo procedimento com as lâminas restantes; ⚫ Fazer a lavagem 3 vezes com PBS com 5 minutos em cada lavagem, agitando o recipiente suavemente algumas vezes durante cada lavagem;
⚫ Após a última lavagem, remover as lâminas do recipiente, uma de cada vez. Tirar o excesso de PBS com o auxílio de um papel absorvente. Secar o dorso e laterais da lâmina e ir IMEDIATAMENTE para a etapa seguinte para não secar o local da reação; ⚫ Retornar a câmara úmida. Pingar 1 gota de ANTIGAMAGLOBULINA marcada em cada área da lâmina, tendo cuidado de recobri-la totalmente; ⚫ Incubar em câmara úmida por 30 minutos, a temperatura ambiente, protegendo do excesso de luz; ⚫ Remover as lâminas, uma por vez, da câmara úmida e repetir o processo de lavagem nos passos 12 e 13. Na terceira lavagem, pingar 2 a 3 gotas de ⚫ AZUL DE EVANS no recipiente com o tampão PBS; ⚫ Remover as lâminas, uma por vez, dos recipientes de lavagem. Remover o excesso de PBS secando o dorso e laterais das lâminas com papel absorvente e IMEDIATAMENTE prosseguir para a próxima etapa para não secar o local da reação; ⚫ Pingar 3 gotas de glicerina tamponada entre as áreas reativas (começo, meio e final da lâmina). Cobrir as lâminas com lamínulas evitando a formação de bolhas. Secar o excesso de glicerina com papel absorvente. Limpar o dorso da lâmina; ⚫ Ler em microscópio de fluorescência. É conveniente fazer a leitura no mesmo dia. Entretanto, no caso de não ser possível, conservá-las em geladeira (2-8ºC) protegidas da luz e lê-las no dia seguinte. A glicerina não deve secar, se isto ocorrer colocar mais glicerina. 3.2.1. Leitura de lâminas em microscópio de imunofluorescência Resultado das leituras Reação negativa : AUSÊNCIA de fluorescência amarelo-esverdeada em todo o contorno do toxoplasma. Os parasitas exibem uma coloração avermelhada;
Para cada amostra, foi retirado um pequeno fragmento com o auxílio de uma pinça e tesoura estéril, e reservada em tubos do tipo eppendorf. Estes foram congelados em freezer - 20ºC para extração de DNA genômico. Os tecidos foram separados e pesados individualmente. Para a separação do “pool” foi utilizado tecidos da mesma espécie e sexo (ex: até 50 gramas de testículos de gatos machos, ou até 50 gramas de útero de gatos fêmeas). As amostras com sorologia positiva foram digeridas individualmente. Cada amostra e “pool” foram separados e macerados. Para amostras com baixo volume (~10-15 gramas) foi macerado com o auxílio de gral e pistilo, e o restante das amostras foram triturados com o auxílio de um “mixer” de uso doméstico. Foi preparada a pepsina de acordo com o volume total de tecido a ser digerido e colocada em banho maria a 37° C até o momento do uso. Para cada 10g de tecidos = 100ml de solução de digestão (50ml de salina 0,85% + 50ml de solução ácida péptica). O preparo da solução ácida péptica foi realizado da seguinte forma = pepsina: 2,6g; NaCl: 5,0g, HCl 6N: 14 ml, q.s.p. 500ml de água destilada. A pepsina foi adicionada ao tecido digerido e incubada a 37ºC em banho maria por 1 hora. Após esse período, o material foi filtrado em copos plásticos descartáveis e gaze estéril. O filtrado foi distribuído em tubos do tipo Falcon de 50 ml e centrifugados a 2500 xg por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi homogeneizado mecanicamente. Após, o material foi neutralizado com solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) a 1,2% recém- preparada. O conteúdo dos tubos foi juntado em um único tubo e adicionado salina 0,85% até 40 ml. Foi homogeneizado e ajustado o pH com fita e completado o volume até 50 ml com salina 0.85%. O material foi ao vórtex e centrifugado a 2500 xg por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e adicionado solução de AB ( 2000 unidades de penicilina e 200μg de estreptomicina/ml) volume/volume, homogeneizado e deixado em temperatura ambiente por 1 hora. (Dubey, 1998) Após esse período, o material foi aspirado em seringa para inoculação em camundongo.
Todo o material utilizado foi lavado com água e sabão e deixado em água fervente. Os materiais autoclaváveis foram autoclavados antes e após o uso. 3.3.2. Inoculação em camundongos Foram utilizados camundongos do tipo Balb C de ambos os sexos. Os camundongos foram requisitados ao biotério da FAMERP um dia antes da inoculação e mantidos em gaiolas com sistema de ventilação com filtro HEPA (Alesco). Os camundongos foram separados e deixados em gaiolas individuais. Os camundongos foram mantidos em ambiente agradável livre de barulhos e trânsito de pessoal para evitar o estresse desses animais. No dia da inoculação, os camundongos foram identificados com etiquetas próprias para cada gaiola. Foi anotado identificação do projeto, amostra, volume, via e data de inoculação. Os camundongos foram contidos manualmente e inoculado 1 ml com agulha de 25 x 0,8 mm da solução de digestão por via subcutânea. Os camundongos foram retornados as gaiolas e foram observados diariamente em busca de sinais e sintomas de infecção. Aqueles que apresentaram algum sinal de infecção ou sofrimento foram eutanasiados para evitar o sofrimento animal. Para os animais que permaneceram sem sinais e sintomas por até 45 dias, foi coletado sangue da região da veia submandibular com o auxílio de uma lanceta. Foram coletados de 2 a 3 gotas de sangue (~100 μl). O sangue foi incubado a 37ºC em banho maria e centrifugado para coleta de soro e realizado imunofluorescência. Após o resultado da sorologia, os camundongos foram eutanasiados e o cérebro foi coletado para pesquisa de cistos de bradizoítos. A eutanásia foi realizada com inoculação de anestésico Xilazina ( mg/kg) + Quetamina (100 mg/kg) via intraperitoneal. Após o animal ficar imóvel, o mesmo foi colocado em câmara fechada pré-prerada (recipiente com seringa de 5 a 10 ml com algodão embebido com isoflurano) até a morte do animal (parar de respirar; mudança da cor dos olhos de vermelho para marrom). Para
gota de salina a 0.85% e um pequeno fragmento de pulmão foi homogeneizado a salina. A lâmina foi coberta com lamínula e analisada em microscópio de luz em aumento de 40x para pesquisa de taquizoítos. Coleta de cérebro Após a eutanásia, o camundongo foi colocado em decúbito ventral sobre um papel absorvente. A região do crânio foi desinfectada com álcool a 70%. Com o auxílio de uma pinça e tesoura, foi removido a calota craniana e um pequeno fragmento de cérebro foi removido e colocado em lâmina. Foi realizado um “imprint” de lâmina em lamínula e cistos de bradizoíta foram pesquisados em microscópio de luz em aumento de 10x e confirmados em aumento de 40x. (Figura 2) Uma parte do material foi armazenado para extração de DNA. Caso seja encontrada alguma forma do parasita, o material coletado deve ser transferido para cultura celular.
Até o momento, não foram isolados nenhuma cepa de T. gondii dos
tecidos animais (cães e gatos). A carcaça dos animais foi coloca em sacos plásticos branco para materiais biológicos, e foram congelados e descartados em local próprio para descarte de material biológico no biotério da FAMERP. 3.4. Cultivo celular
Os isolados de T. gondii devem ser transferidos para cultura celular para
multiplicação do parasita que serão utilizados para extração de DNA para genotipagem e criopreservação. (Verma et al., 2017) Até o momento, a cultura tem sido utilizada para reprodução de cepa RH
de T. gondii e inoculação de amostras de humanos (sangue e líquido
amniótico). Futuros isolados em camundongos serão cultivados em células.
Figura 2. Pesquisa de cistos de bradizoítos em cérebro do camundongo no dia
30 de agosto de 2022, inoculado com pool das amostras DG07 e DG010.
Nenhum cisto foi encontrado nesta amostra. As células utilizadas na cultura celular são células do tipo VERO. Todas as medidas de precauções para evitar contaminação no cultivo celular são tomadas. Os protocolos para cultivo celular são descritos abaixo. Procedimento geral de higienização para cultura de células ⚫ Antes de qualquer procedimento com meio de cultura, utilizar um jaleco descartável e exclusivo para uso na cultura. Limpar o fluxo laminar com álcool e papel toalha ou tecido absorvente limpo; ⚫ Todos os materiais que forem utilizados devem ser colocados dentro do fluxo após a limpeza; ⚫ Verificar se não há nenhum objeto interrompendo a passagem de ar pelo fluxo;
Meio DMEM 3% ⚫ Utilizado para células infectadas e garrafas limpas com alta confluência; ⚫ Em um frasco de meio RPMI 500 ml, acrescentar 15 ml de SFB, 2,0 ml de gentamicina (2 tubos eppendorf) e 1 ml de fungizone. ⚫ Manter em refrigerador. Criopreservação ⚫ As células devem ser mantidas nas garrafas de cultura para uso, por outro lado devem ser mantidas criopreservadas em nitrogênio; Preparo do meio de crio 10% de SFB 5% de DMSO 85% de meio DMEM Para preparar 50 ml de meio de crio RPMI ou DMEM – 42.5 ml DMSO – 2.5 ml SFB – 5 ml
⚫ Separar o material para ser criopreservado (garrafa de cultura, pulmão, cérebro);
⚫ T. gondii pode ser criopreservado como taquizoítas (em pulmão, lavado
peritoneal) e como cistos teciduais (cérebro, músculos) ou bradizoítas provenientes de produto de digestão; ⚫ Para criopreservar a partir da cultura, remover as células mecanicamente ou com tripsina, centrifugar e ressuspender o pellet com 1 ml de meio de crio. Transferir para um tubo tipo crio, identificar, e deixar em temperatura ambiente por 30 minutos. Colocar em caixas de congelamento e congelar em freezer - 70° C. Deixar overnight e transferir os criovials para o nitrogênio líquido; ⚫ Para criopreservar a partir de tecidos, macerar os tecidos com pistilo e cadinho e adicionar 1 ml do meio de crio. Transferir para um tubo tipo crio, identificar, e deixar em temperatura ambiente por 30 minutos. Colocar em caixas de congelamento e congelar em freezer - 70ºC. Deixar overnight e transferir os criovials para o nitrogênio líquido. Descongelamento de células a partir do nitrogênio ⚫ Organizar todos os materiais necessários antes do descongelamento das células e organizar e esterilizar o fluxo laminar; ⚫ Remover os criovials do nitrogênio e rapidamente descongela-los em banho- maria a 37ºC; ⚫ Com o auxílio de uma pipeta, transferir o material para um tubo Falcon de 15 ml e adicionar 3 ml de meio DMEM 10%; ⚫ Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min; ⚫ Descartar sobrenadante e ressuspender o pellet com volume necessário para uso: ⚫ Para células limpas – Ressuspender o pellet em 0,5 a 1 ml de meio e passar para uma garrafa de cultura de 25 cm². Adicionar meio até chegar a um volume de 5 ml - verificar concentração de SFB de acordo com o objetivo, porém um crescimento bom para as células vindas do descongelamento é de 10% a 15%). Guardar a garrafa em estufa de CO2;
