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Este documento discute sobre a infecção simultânea ou superinfecção de hepatite b (hbv) e hepatite d (hdv), incluindo seus genótipos, mecanismos de transmissão e consequências graves em pacientes coinfectados. O texto aponta para a predomínio do genótipo iii do hdv associado a casos de hepatite com atividade inflamatória acentuada e fibrose moderada a acentuada em adultos jovens, especialmente na amazônia, onde a infecção pelo hdv representa um grave problema de saúde pública.
Tipologia: Notas de aula
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA – UNIR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL - PGBIOEXP ANITA SPERANDIO PORTO
Orientador: Juan Miguel Vilallobos Salcedo
Anita Sperandio Porto
Orientador: Prof. Dr. Juan Miguel Villalobos Salcedo
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Universidade Federal de Rondônia
Área de concentração: Doenças infecciosas e parasitárias.
Porto Velho 2016
Caracterização imuno-histoquímica do antígeno Delta em amostras hepáticas
de pacientes em acompanhamento no Ambulatório de Hepatites do Centro de
Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia-CEPEM.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Experimental –
PGBIOEXP – do Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia para obtenção
do título de mestre, em sessão pública realizada em 1º de abril de 2016.
Banca examinadora
Dr. Juan Miguel Vilallobos Salcedo Presidente da Banca Examinadora Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental Universidade Federal de Rondônia
Dra. Deusilene Souza Vieira Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental Universidade Federal de Rondônia
Dra. Thamy Yamashita Shibayama Departamento de Medicina Universidade Federal de Rondônia
Dedico esta dissertação primeiramente à Deus, por mais esta oportunidade de evolução, à meus pais pela dedicação e amor incondicional, a meus irmãos, pelo apoio e companhia insubstituíveis, aos meus orientadores pela paciência e incentivo constantes. Muito obrigada!
EPIGRAFE
“Não há fé inabalável senão aquela
que pode encarar a razão face a face
em todas as épocas da humanidade.”
Hippolyte Léon Denizard Rivail
Estima-se que cerca de 18 milhões de pessoas se encontram infectadas pelo HDV entre os 350 milhões de portadores crônicos do HBV no mundo. Investigações epidemiológicas na década de 1980 mostraram que a infecção pelo HDV é endêmica em todo o mundo, com taxas de prevalência variando entre as regiões. Atualmente, estão descritos oito genótipos, sendo que o tipo III foi
localizado somente na Região Amazônica venezuelana, colombiana, peruana, equatoriana, boliviana e brasileira, sendo provavelmente originário de populações indígenas. É considerado o mais diferente geneticamente, além de ser o mais patogênico e sintomático, sendo responsável por formas graves e fulminantes de hepatite, com alta mortalidade, especialmente em crianças. Favorece a evolução para
a cronicidade e rápida evolução para a cirrose hepática em pacientes jovens, bem como para o Carcinoma Hepatocelular (CHC). O estado de portador crônico do HBV (HBsAg positivo) constitui-se no principal fator epidemiológico para a propagação do HDV. Esta pesquisa justifica-se por ser a Hepatite Delta pouco conhecida e muito pouco discutida no Brasil e no exterior, sendo considerada
por muitos pesquisadores como uma das doenças infecciosas mais negligenciadas, apesar da sua tendência a evoluir de forma grave. O objetivo deste estudo foi realizar uma descrição detalhada das características histopatológicas e imuno-histoquímicas. Além disso, foi possível correlacionar estes achados histológicos e de imuno-histoquímica com os aspectos clínicos, epidemiológicos,
laboratoriais e genotípicos. Selecionamos 24 casos de pacientes portadores exclusivamente de coinfecção por HBV/HDV, em acompanhamento no Ambulatório de Hepatites Virais do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia, utilizando critérios de inclusão e exclusão. Os pacientes
foram avaliados de maio de 2011 a maio de 2015, sendo submetidos a exames de rotina hematológicos, bioquímicos, sorológicos, além de biópsia hepática com estudo histopatológico e imuno-histoquímico. Foram feitas genotipagem para HBV e HDV por PCR-RT, com determinação de cargas virais de parte dos casos. Nos resultados, foi observado predomínio do genótipo III do HDV
associado ao F do HBV, levando a casos de hepatite com atividade inflamatória acentuada e fibrose moderada a acentuada em adultos jovens, cursando ainda com elevação das transaminases proporcional à carga viral e ao grau histológico. Degeneração hidrópica importante, corpos apoptóticos frequentes, fibrose perissinusoidal importante principalmente em zona 3, infiltrado
inflamatório rico em linfócitos, plasmócitos e eosinófilos, linfocitose perissinusoidal e atividade lobular são achados inespecíficos, porém exacerbados nesta casuística. A distribuição do HDAg nos hepatócitos, por imuno-histoquímica, foi descontínua e esparsa, em todas as amostras, o que sugere que não há infecção célula a célula. O padrão de expressão em faixa observado nos casos HBsAg,
por imuno-histoquímica, esteve relacionado com maior atividade inflamatória e maior grau de fibrose. A imuno-histoquímica para HBcAg evidenciou replicação do HBV em pacientes com sorologia HBeAg (-), o que sugere que este marcador, nos pacientes coinfectados HBV/HDV, não seja a melhor forma de avaliar a atividade replicativa do HBV.
Palavras-chaves: Hepatite Delta; HDV; anti-HDV; histopatologia; imuno-histoquímica; Rondônia.
Tabela 1. Anticorpos utilizados nas reações imuno-histoquímicas
desta pesquisa.
Tabela 2. Perfil genotípico da digestão com Sma I e Xho I para um
fragmento de 406pb correspondente ao HDAg.
Tabela 3. Forma padronizada para a semiquantificação de variáveis
histológicas.
Tabela 4. Distribuição por faixa etária dos pacientes incluídos no
estudo.
Tabela 5. Algumas características sociodemográficas dos casos
estudados
Tabela 6. Distribuição quanto à presença de fatores de risco de
infecção pelo HBV/HDV, entre os casos avaliados.
Tabela 7. Distribuição dos principais sinais e sintomas de hepatite
crônica observados nos pacientes incluídos no estudo.
Tabela 8. Distribuição dos principais achados ultrassonográficos
sugestivos ou indicativos de hepatite crônica e doenças das vias biliares observados nos pacientes incluídos no estudo.
Tabela 9. Valores médios dos principais marcadores bioquímicos e
hematológicos avaliados.
Tabela 10. Avaliação dos casos deste estudo quanto à
soroprevalência.
Tabela 11. Avaliação histológica pela Classificação Metavir de acordo
com a faixa etária.
Tabela 12. Características morfológicas dos casos estudados, por
ordem decrescente de frequência.
Tabela 13. Distribuição por faixa etária dos casos de Genótipo III. 73
Tabela 14. Distribuição por faixa etária dos casos de HBV. 73
Tabela 15. Estudo das cargas virais e log do HBV e HDV. 75
Tabela 16. Exames hematológicos e bioquímicos desta pesquisa x
dados de outros trabalhos
Tabela 17. Marcadores sorológicos desta pesquisa x dados de outros
trabalhos.
Tabela 18. Comparação dos linfócitos no tecido hepático x ALT x
plaquetas.
Tabela 19. Fibrose x Apoptose nos casos deste estudo. 86
Tabela 20. Correlação da Fibrose com a Hepatite de Interface
(Necrose em saca-bocado).
Tabela 21. Relação dos achados imuno-histoquímicos para HDAg com
o grau de atividade inflamatória, necrose em saca-bocado e atividade lobular.
Tabela 22. Relação dos achados imuno-histoquímicos do HBsAg com
a atividade inflamatória, necrose em saca-bocados e atividade lobular.
Tabela 23. Relação dos achados imuno-histoquímicos do HBsAg com
a fibrose hepática.
Tabela 24. Relação dos achados imuno-histoquímicos do HBcAg com
o Metavir.
Tabela 25. Correlação dos genótipos de HBV e HDV com o Metavir. 94
(+) positivo; (-) negativo (FONSECA, 2002)
Figura 10. Perfil sorológico da superinfecção aguda pelo HDV em
diferentes padrões sorológicos de portadores do HBV (FONSECA, 2002).
Figura 11. Microfotografia de uma célula em mórula, achado
característico da hepatite Delta aguda (H&E; aumento original 400X) (BRAGA JUNIOR, 2005).
Figura 12. Microfotografia de uma área de necrose submaciça,
comprometendo zonas 1, 2 e 3 de Rappaport, em um caso de hepatite delta fulminante (H&E, aumento original 40x). BRAGA JUNIOR, 2005.
Figura 13. Microfotografia mostrando a expressão acentuada do antígeno
Delta em núcleo e citoplasma de hepatócitos de pacientes com infecção crônica pelo VHB e VHD, em caso de hepatite de Lábrea (BRAGA JUNIOR, 2005)
Figura 14. Fluxograma resumido da metodologia deste estudo. 27
Figura 15. Diagrama de progressão para a fibrose na hepatite crônica.
F1: Fibrose portal; F2: Septos fibrosos curtos com poucos septos finos porta-porta; F3: Transição para a cirrose, com septos porta-porta, áreas de regeneração com esboço nodular, em algumas áreas da biópsia por agulha; F4: Cirrose estabelecida. BATTS-LUDWIG, 1995, adaptado.
Figura 16. Algoritmo da Classificação Metavir para avaliação da atividade
inflamatória. PMN= “Piecemeal necrosis” (Necrose em saca- bocado ou hepatite de interface), sendo 0=nenhuma; 1=discreta; 2=moderada; 3=acentuada. LN= Necrose lobular, sendo 0=nenhuma; 1=discreta; 2=moderada; 3=acentuada. LN= Necrose lobular. (The Metavir Cooperative Study Group. Hepatology, 1996; 24: 289-293)
Figura 17. Diagrama de atividade necroinflamatória. A0-A2: Graus de
atividade de A0 a A2. Em A3: Necrose confluente, na forma de necrose em ponte, presente somente na atividade grau 3 (A3). BATTS-LUDWIG, 1995, adaptado.
Figura 18. Distribuição da população estudada em relação ao gênero. 45
Figura 19. Distribuição dos casos segundo a naturalidade. 46
Figura 20. Distribuição dos casos com naturalidade em áreas
hiperendêmicas.
Figura 21. Distribuição dos casos segundo a procedência. 47
Figura 22. Diagnósticos Histopatológicos desta casuística, por ordem de
Metavir.
Figura 23. Tipos de células inflamatórias observadas por ordem
decrescente de frequência.
Figura 24. Microfotografia mostrando infiltrado inflamatório acentuado
com formação de um acúmulo linfóide sem centro germinativo (seta) (H&E, 200 x).
Figura 25. Microfotografia mostrando infiltrado inflamatório acentuado
com moderado número de plasmócitos (seta maior). Presença ainda de corpúsculo de Councilman ou corpo apoptótico (seta menor) e balonização citoplasmática (cabeça de seta) (H&E, 200 x).
Figura 26. Microfotografia mostrando numerosos eosinófilos periportais
(H&E, 200x).
Figura 27. Microfotografia mostrando intensa balonização citoplasmática
(H&E, 200 x).
Figura 28. Microfotografia mostrando esteatose macro e microgoticular
em faixa e septos fibrosos permeados por infiltrado mononuclear predominantemente linfocítico (H&E, 100 x).
Figura 29. Microfotografia mostrando grânulos grosseiros em quantidade
moderada, intracitoplasmáticos, difusamente distribuídos (Perls, 200 x).
Figura 30. Microfotografia mostrando hepatócitos em vidro fosco (H&E,
200 x).
Figura 3 1. Microfotografia mostrando inflamação acentuada, com áreas
de necrose em “saca-bocado” (setas) (H&E,100 x).
Figura 32. Microfotografia mostrando células apoptóticas com eosinofilia
e picnose, periportais e mediozonais (setas) (H&E, 200x).
histoquímica para HBsAg, 40x (A) e 200 x (B, C, D).
Figura 43. Microfotografia mostrando expressão em marrom do HBsAg
no citoplasma dos hepatócitos (+++).Técnica de imuno- histoquímica para HBsAg, 40x (A) e 200 x (B).
Figura 44. Microfotografia mostrando expressão do HBcAg no citoplasma
(+++) dos hepatócitos. Técnica de imuno-histoquímica para HBcAg, 40x (A) e 200 x (B).
Figura 45. Microfotografia mostrando expressão do antígeno HBcAg no
núcleo de hepatócito (seta). Único caso com expressão nuclear do HBcAg. Técnica de imuno-histoquímica para HBcAg, 200 x.
Figura 46. Distribuição dos casos de genótipo F do HBV segundo a faixa
etária, em anos.
Figura 47. Distribuição dos casos de genótipo A do HBV segundo a faixa
etária, em anos.
Figura 48. Coeficientes de Correlação de Pearson acima da diagonal,
Histogramas na Diagonal e Diagramas de Dispersão abaixo da Diagonal.
Figura 49. Gráfico mostrando a intersecção de imunoexpressão do
HBsAg, HBcAg e HDV do HBsAg, HBcAg e HDV nos casos deste estudo.
Figura 50. Coeficientes de Correlação de Pearson acima da diagonal,
Histogramas na Diagonal e Diagramas de Dispersão abaixo da Diagonal.
A Grau de atividade inflamatória
ANA Anticorpo Antinuclear
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
AIH Autorização de Internação Hospitalar
ALT/TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica
AML Anticorpo antimúsculo liso
Anti-HAV IgM Anticorpo contra capsídeo do vírus da Hepatite A, infecção
aguda ou recente.
Anti-HBc Total Anticorpo contra o core do vírus da hepatite B
Anti-HBc IgM Anticorpo contra o core do vírus da hepatite B, recente.
Anti-HBe Anticorpo contra o antígeno “e” do HBV. Marcador que
indica um bom prognóstico na fase aguda da hepatite B.
Anti-HBs Anticorpo contra o antígeno de superfície do vírus da
hepatite B
Anti-HCV Anticorpo contra vírus da hepatite C
Anti-HDV Anticorpo contra Vírus da Hepatite D ou Delta
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AST/TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética
CDC Centers for Disease Control (CDC)
CEMETRON Centro de Medicina Tropical de Rondônia
CEPEM Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia
CHC Carcinoma Hepatocelular
cm Centímetro
CNS Conselho Nacional de Saúde
DAB Diaminobenzidina
EBV Epstein Barr Vírus
F Grau de fibrose
g Grama
G Gauge
GGT Gama Glutamil Transferase
TAP Tempo de Ativação da Protrombina
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UI/mL Unidades internacionais por mililitro
UI/L Unidades internacionais por litro
U/L Unidades por litro
ºC Graus Celsius
μm Micrômetro
RESUMO............................................................................................................ viii ABSTRACT........................................................................................................ ix LISTA DE TABELAS......................................................................................... x LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... xii
