CAROLINE RODRIGUES ALVES VALOIS
Estudo da expressão de moléculas de adesão celular durante a
migração transendotelial dos leucócitos no pulmão de camundongos
tratados com nanopartículas magnéticas recobertas com DMSA.
Brasília
2006
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Guias e Dicas
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Encontrar documentos
Prepare-se para as provas com trabalhos de outros alunos como você, aqui na Docsity
Pesquisar documentos Store
Os melhores documentos à venda: Trabalhos de alunos formados
Videoaulas
Prepare-se com as videoaulas e exercícios resolvidos criados a partir da grade da sua Universidade
Quiz
Responda perguntas de provas passadas e avalie sua preparação.
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Comunidade
Pergunte à comunidade
Peça ajuda à comunidade e tire suas dúvidas relacionadas ao estudo
Ranking universidades
Descubra as melhores universidades em seu país de acordo com os usuários da Docsity
Guias grátis
Os eBooks que salvam estudantes!
Baixe gratuitamente nossos guias de estudo, métodos para diminuir a ansiedade, dicas de TCC preparadas pelos professores da Docsity
Estudo da expressão de moléculas de adesão celular durante ..., Manuais, Projetos, Pesquisas de Literatura
que E-selectina, integrina-β1 e VCAM-1 são encontradas apenas diante de um ... das famílias das selectinas e integrinas que participam da migração ...
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
2022
Compartilhado em 07/11/2022
usuário desconhecido 🇧🇷
4.5
(77)184 documentos
1 / 103
Esta página não é visível na pré-visualização
Não perca as partes importantes!
Documentos relacionados
Pré-visualização parcial do texto
Baixe Estudo da expressão de moléculas de adesão celular durante ... e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Literatura, somente na Docsity!
CAROLINE RODRIGUES ALVES VALOIS
Estudo da expressão de moléculas de adesão celular durante a
migração transendotelial dos leucócitos no pulmão de camundongos
tratados com nanopartículas magnéticas recobertas com DMSA.
Brasília 2006
CAROLINE RODRIGUES ALVES VALOIS
Estudo da expressão de moléculas de adesão celular durante a
migração transendotelial dos leucócitos no pulmão de camundongos
tratados com nanopartículas magnéticas recobertas com DMSA.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Bentes de Azevedo
Brasília 2006
i DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação...
Aos meus queridos pais, Celso e Marília, meus maiores exemplos de vida, que sempre me
amaram, incentivaram e proporcionaram tranqüilidade para que eu pudesse lutar por meus
ideais com dignidade. A eles o meu eterno amor e gratidão.
Aos meus queridos irmãos, Igor e Leonardo, meus maiores amigos, pelo apoio e carinho
sempre demonstrados ao longo de nossas vidas.
A todos aqueles que têm um sonho e ainda não conseguiram realizá-lo. Que esta dissertação
lhes sirva de incentivo para continuar persistindo na busca de novos caminhos e
possibilidades.
ii AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. Ricardo Bentes de Azevedo
Meu querido orientador, que na grandeza de sua generosidade concede oportunidade a todos
aqueles que o procuram, sonhando em um dia se tornarem cientistas. Exemplo de Professor.
A ele o meu mais sincero agradecimento e a certeza de que todas as oportunidades a mim
concedidas jamais serão esquecidas.
iv
Aos Professores Dr. Albino de Magalhães, Dr. Janildo Reis Jr. e Dra. Sônia Báo, pela
confiança ao disponibilizar o uso do criostato e dos equipamentos de microscopia.
Aos técnicos Antônio Djalma Santos e José Felipe da Silva e a todos os demais funcionários
da Universidade de Brasília, que sempre me compreenderam e nunca negaram esforços para
auxiliar no meu desenvolvimento científico e profissional.
A Universidade de Brasília, que me acolheu como aluna e proporcionou a oportunidade de
continuar os meus estudos.
A Capes, CNPq e Finatec, pelo apóio financeiro.
Agradeço também a todos que de forma silenciosa contribuíram para a realização desta
dissertação.
v RESUMO
O presente estudo avaliou a expressão das moléculas de adesão celular (CAMs): L- selectina, P-selectina, E-selectina, integrina-β2, Mac-1, LFA-1, integrina-β1, VLA-4 e VCAM-1 durante a migração transendotelial dos leucócitos no pulmão. Para isto, utilizou-se um modelo animal de inflamação pulmonar induzida por fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas recobertas com ácido meso-2,3- dimercaptosuccínico (FM-DMSA). As análises foram realizadas em camundongos nos períodos de 4 e 12 horas após a administração do FM-DMSA e em animais controles. A atividade migratória induzida experimentalmente foi investigada por meio de lavagem bronco-alveolar. Microscopia de luz foi utilizada para verificar a distribuição de agregados de nanopartículas magnéticas e análise da morfologia do órgão. A expressão das CAMs foi investigada por meio de imunofluorescência indireta em cortes por congelação. De acordo com os resultados obtidos, o FM- DMSA estimula a migração transendotelial dos leucócitos nos períodos de 4 e 12 horas, com o mínimo de dano a esse órgão. L-selectina, P-selectina, integrina-β2, Mac-1, LFA-1 e VLA-4 participam da migração transendotelial dos leucócitos tanto na presença de um estímulo inflamatório como em condições fisiológicas, enquanto que E-selectina, integrina-β1 e VCAM-1 são encontradas apenas diante de um estímulo inflamatório. L-selectina, P-selectina, integrina-β2, Mac-1, LFA-1, integrina- β1 e VCAM-1 participam da migração transendotelial dos leucócitos em sítios pós- capilares e na microvascularização, enquanto que E-selectina e VLA-4 são encontradas apenas em sítios pós-capilares. E-selectina e LFA-1 têm seus níveis de expressão alterados em função do tempo. As vias de migração transendotelial CD18-dependente (integrina-β2, Mac-1 e LFA-1) e CD18-independente (integrina-β 1 e VLA-4) podem contribuir mutuamente para a migração dos leucócitos no pulmão.
vii LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Representação das etapas da migração transendotelial. Figura 2. Principais CAMs envolvidas na migração transendotelial. Figura 3. Aspecto do FM-DMSA e comportamento magnético do fluido. Figura 4. Camundongo da raça Swiss. Figura 5. Veia do animal e administração endovenosa do FM-DMSA. Figura 6. Escalpe posicionado e incisão no átrio direito do coração. Figura 7. Sistema utilizado para a perfusão cardíaca. Figura 8. Traqueotomia e cateter introduzido na traquéia. Figura 9. Dispositivo de três vias utilizado na lavagem bronco-alveolar. Figura 10. Representação dos procedimentos para a obtenção do número de leucócitos totais. Figura 11. Representação do preparo das amostras para a criomicrotomia. Figura 12. Representação da técnica de imunofluorescência indireta. Figura 13. Jogos de filtros utilizados para cada fluoróforo e cor resultante. Figura 14. Número de leucócitos totais no lavado bronco-alveolar. Figura 15. Fotomicrografias de pulmões de camundongos. Figura 16. Fotomicrografias de imunofluorescência para L-selectina. Figura 17. Fotomicrografias de imunofluorescência para P-selectina. Figura 18. Fotomicrografias de imunofluorescência para integrina-β2. Figura 19. Fotomicrografias de imunofluorescência para Mac-1. Figura 20. Fotomicrografias de imunofluorescência para LFA-1. Figura 21. Fotomicrografias de imunofluorescência para integrina-β1. Figura 22. Fotomicrografias de imunofluorescência para VLA-4. Figura 23. Fotomicrografias de imunofluorescência para VCAM-1. Figura 24. Sumário dos principais resultados da imunofluorescência.
viii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA
CAMs DMSA
DPOC ELAM-
ESL- FM-DMSA
GLyCAM-
GMP-
gp 150, H&E Hs IAP
ICAM
IL- LAD-
LAM-
lbf/pol^2 LECAM ou LEC.CAM
Bovine serum albumin / Albumina sérica bovina C ell adhesion molecules / Moléculas de adesão celular Meso-2,3-dimercaptosuccinic acid / Ácido meso-2,3- dimercaptosuccínico Doença pulmonar obstrutiva crônica Endothelial-leukocyte adhesion-1 / Molécula de adesão leucócito-endotélio- E-selectin ligand-1 / E-selectina ligante– Fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas recobertas com DMSA Glycosylation-dependent cell adhesion- 1 / Molécula de adesão celular dependente da glucosilação- Granule membrane protein-140 / Proteína de membrana granular- Glycoprotein 150,95 / Glicoproteína 150, Hematoxilina e eosina Horas Integrin-associated protein / Proteína associada a integrina Intercellular adhesion molecule / Molécula de adesão intercelular Interleucina- Leukocyte adhesion deficiency-1 / Deficiência de adesão leucocitária- L eukocyte adhesion molecule-1 / Molécula de adesão leucocitária- Libra força por polegada quadrada Leukocyte-endothelial cell adhesion molecule / Molécula de adesão célula endotelial-leucócito
x SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Migração transendotelial 2.2 Mecanismo geral da migração transendotelial 2.3 CAMs envolvidas na migração transendotelial 2.3.1 Família das selectinas 2.3.2 Família das integrinas 2.3.3 Superfamília das imunoglobulinas 2.4 CAMs e a migração transendotelial no pulmão 2.5 Fluidos magnéticos e o FM-DMSA 3 OBJETIVO 3.1 Objetivo geral 3.2 Objetivos específicos 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Parte I 4.1.1 Reagentes, utensílios e equipamentos 4.1.2 Fluido magnético 4.1.3 Procedência, seleção e manutenção dos animais 4.1.4 Grupos experimentais 4.1.5 Obtenção das amostras 4.1.6 Perfusão cardíaca 4.1.7 Lavagem bronco-alveolar 4.1.8 Número de leucócitos totais 4.1.9 Análise estatística dos resultados 4.2 Parte II 4.2.1 Reagentes, utensílios e equipamentos 4.2.2 Anticorpos e corante de ácido nucléico 4.2.3 Soluções 4.2.4 Fluido magnético e procedência, seleção e manutenção dos animais
xi 4.2.5 Grupos experimentais 4.2.6 Obtenção das amostras 4.2.7 Preparo das amostras por congelação 4.2.8 Criomicrotomia 4.2.9 Imunofluorescência indireta 4.2.10 Análise histológica 4.2.10.1 Coloração com H&E 4.2.10.2 Coloração pelo método de Perls 5 RESULTADOS 5.1 Lavagem bronco-alveolar 5.2 Microscopia de luz 5.3 Imunofluorescência 5.3.1 Família das selectinas 5.3.2 Integrinas da subfamília β 2 5.3.3 Integrinas da subfamília β 1 5.3.4 Imunoglobulina VCAM- 6 DISCUSSÃO 6.1 Da atividade migratória induzida pelo FM-DMSA 6.2 Da expressão das CAMs 7 CONCLUSÃO 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Introdução - 2
1 INTRODUÇÃO
A migração transendotelial, ou seja, o egresso dos leucócitos circulantes dos
vasos sangüíneos para o parênquima tissular, constitui um evento de fundamental
importância para os mecanismos de imunidade natural e adaptativa do organismo
(LIU et al., 2004; MARTIN; FREVERT, 2005; NOURSHARGH; MARELLI-BERG,
2005). Por outro lado, o acúmulo de leucócitos nos compartimentos extravasculares
também pode ocasionar lesão tecidual em decorrência da liberação demasiada de
substâncias tóxicas, incluindo proteases e espécies reativas de oxigênio, resultando
no desenvolvimento de quadros patológicos ou ainda contribuindo para o
agravamento de doenças já estabelecidas (GUO; WARD, 2002).
No pulmão, a migração transendotelial está relacionada com a patogenia de
doenças inflamatórias, como, por exemplo, a asma, a bronquite aguda e a doença
pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) (BLOEMEN et al., 1997; DOERSCHUK, 2000;
HAMID et al., 2003). Outras condições, ainda menos favoráveis, apresentam um alto
índice de mortalidade, não tendo sido desenvolvido, até o momento, um tratamento
específico para as mesmas. Dentre estas últimas pode-se citar a lesão pulmonar
aguda (LPA) e a síndrome da angústia respiratória aguda (SARA) (ABRAHAM, 2003;
GUO et al., 2002; O'BYRNE; POSTMA, 1999; SETHI; WAXMAN, 2001).
Diante desse quadro, a busca pelas bases moleculares que coordenam a
migração transendotelial dos leucócitos no pulmão intensificou-se nas últimas
décadas. Na diversidade de fatores endógenos avaliados para tanto, as moléculas
de adesão celular (CAMs) ganharam destaque devido a sua possibilidade de
aplicação clínica, seja funcionando como marcadores biológicos para as doenças
Introdução - 3
inflamatórias pulmonares, seja como alvos para fármacos ou agentes terapêuticos
imunodirecionados (DEDRICK et al., 2003; KUENZ et al., 2005; LUSTER et al.,
2005; ULBRICH et al., 2003).
As CAMs são moléculas expressas na superfície celular que, conforme a
similaridade estrutural e funcional, apresentam-se divididas em cinco grupos:
caderinas, mucinas, família das selectinas, família das integrinas e a superfamília
das imunoglobulinas (ALBERTS et al., 2002; SIMON; GREEN, 2005). A participação
de tais moléculas no processo de migração transendotelial dos leucócitos no pulmão
tem sido amplamente investigada por meio de modelos animais de inflamação, onde
o recrutamento dos leucócitos é induzido pela administração de ácidos, bactérias,
citocinas, endotoxinas, proteínas do complemento e complexo imune (BURNS et al.,
2003; WAGNER; ROTH, 2000). A despeito disto, os resultados obtidos até o
momento ainda não são conclusivos, principalmente no que se refere as CAMs que
constituem as famílias das selectinas e integrinas; o que suscita a necessidade da
realização de novos estudos utilizando modelos experimentais in vivo que possam
melhor representar as condições encontradas nas doenças inflamatórias
pulmonares.
Para essa finalidade, a utilização dos fluidos magnéticos tem sido
recentemente proposta na literatura (AZEVEDO et al., 2004; CHAVES, 2002;
CHAVES et al., 2005; GARCIA, 2005). Os fluidos magnéticos são dispersões
constituídas de nanopartículas magnéticas recobertas por uma camada molecular
estabilizante, como, por exemplo, o ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico (DMSA),
num solvente carreador (HALBREICH et al., 1998; MASSART, 1982). As
nanopartículas magnéticas podem ser sintetizadas a partir de várias ferritas cúbicas,
incluindo a magnetita (MASSART, 1982; SUN et al., 2004). Estudos demonstraram
2 REVISÃO DA LITERATURA
Revisão da Literatura - 6
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Migração transendotelial
Migração transendotelial é o termo utilizado para se referir ao conjunto de
etapas que resultam no egresso dos leucócitos circulantes dos vasos sangüíneos
para o parênquima tissular (LIU et al., 2004; MARTIN; FREVERT, 2005;
NOURSHARGH; MARELLI-BERG, 2005). A migração transendotelial dos leucócitos
pode ocorrer tanto em condições fisiológicas normais quanto na presença de um
estímulo inflamatório (BURNS et al., 2003); e embora existam diferentes tipos de
células leucocitárias, as quais, por sua vez, são classificadas em dois grupos:
mononucleares (linfócitos e monócitos) e polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos
e basófilos), todos os leucócitos migram dos vasos sangüíneos para o parênquima
tissular por meio de um mecanismo semelhante (WAGNER; ROTH, 2000).
2.2 Mecanismo geral da migração transendotelial
O comportamento das células leucocitárias durante a migração transendotelial
foi amplamente avaliado in vivo , em vênulas pós-capilares localizadas na circulação
sistêmica, e em modelos experimentais in vitro , utilizando células endoteliais
derivadas das grandes veias (LIU et al., 2004; MARTIN; FREVERT, 2005;