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Uma revisão literária sobre o processo de engenharia metabólica de saccharomyces cerevisiae para aproveitar xilose na produção de etanol lignocelulósico. O trabalho descreve a construção de plasmídeos epissomais para a expressão de genes codificadores para xilose isomerase (xi) de piromyces sp., as características das linhagens obtidas após o processo de condicionamento, e as estratégias de engenharia metabólica de microrganismos frequentemente abordadas no melhoramento de linhagens para o aproveitamento de xilose na produção de etanol de segunda geração.
O que você vai aprender
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
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Bárbara Gomes Paes
Brasília 2015
Universidade de Brasília Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular
Universidade de Brasília Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biologia Molecular.
Aluna: Bárbara Gomes Paes Orientadora: Prof.ª Lídia Maria Pepe de Moraes Coorientador: Dr. João Ricardo Moreira de Almeida Brasília 2015
Antes de tudo, à minha família, que foi fortaleza quando eu já não tinha forças, foram energia quando eu precisei recarregar, foram ouvidos quando eu precisava falar, foram ombros quando eu precisava chorar. Obrigada por me darem a herança mais valiosa que alguém pode ter, muitas vezes com sacrifícios, mas sempre com muito amor. Ao querido (co)orientador João Ricardo, pela confiança e oportunidade de desenvolver este projeto em seu grupo de trabalho. Por todas as lições, disponibilidade, e todas as vezes que me disse para ter calma, muita calma. Pela paciência, e especialmente por acreditar em mim até quando eu mesma duvidei, muito obrigada. A minha orientadora Lídia, pela orientação e por acreditar que eu faria um bom trabalho. À Viviane Reis, pela colaboração e disponibilidade na realização dos ensaios enzimáticos. A Ana Paula Ribeiro, conselheira, consultora, salvadora, ajuda para todos os momentos! Amiga que me ensinou tanto, brigou e me abrigou, e me iluminou tantas vezes com o seu conhecimento. Ao Henrique, sempre disponível para ajudar, que me salvou em especial nos momentos mais difíceis. À Carol e à Talita, que me ajudaram na bancada e fora dela, que dividem comigo vícios adoráveis, histórias incríveis, e risadas intermináveis. A todos os amigos do grupo ou que já passaram por ele, que dividiram não apenas bancada, meios e soluções comigo, mas também risadas e histórias, e gostam de mim mesmo com as minhas duzentas canetas e mania de organização. Saibam que eu sei que não é fácil me aguentar! Um agradecimento especial à Samantha, que foi minha fiel escudeira, e se me permite, uma pupila e amiga da qual me orgulho! Obrigada a todos vocês queridos, que tornaram os dias no LGB mais alegres e leves. Sem vocês esta jornada seria infinitamente mais difícil, e certamente sem a mesma graça. Aos analistas do LGB e LPB, sempre dispostos a ajudar. Em especial à Betúlia, que me ajudou a enxergar a beleza do sequenciamento. Aos amigos da salinha da pós, pelos cafés, lanches, risadas, pelo encorajamento, e por dividirem essa experiência nada simples que é a pós-graduação. A tantos amigos do Lab MOA, que estão longe, mas foram todos importantes companheiros e antigos mentores. Aos amigos da graduação e a sumida Lena. Sem vocês essa jornada nem teria começado. As professoras Ildinete e Cynthia, minhas fadas madrinhas, que me salvaram e deram bons conselhos tantas (e tantas) vezes. Vocês me inspiram. Obrigada por cuidarem e acreditarem em mim.
A Thais ‘Japa’ Ziober, que mesmo de longe sempre me apoiou, e me perguntou o que eu tinha almoçado. Ao Bruno ‘Baiano’ Amui, por não desistir de mim por todas as vezes que eu disse “não dá, estou/vou pro lab, e por tentar solucionar meus problemas insolucionáveis (por favor, se forme). Ao Álvaro e à Dri, companheiros de aventuras e divagações, que entraram nessa saga de mestrado, em que dividimos momentos de alegria e dúvida, regados à cafés e cervejas e música boa. À Verô e Igor, que numa amizade recente e surpreendente foram fundamentais neste processo. Ao meu Pedaço querido de Deborah. Pelos papos cabeças e fúteis, pelos conselhos, cervejas, pelos bons momentos e por aparecerem na minha vida! A todos os meus amigos, os lymdos, os loucos, e a todos aqueles que o sol toca. Aos amigos do Núcleo de PesquisaS pela motivação. Aos amigos perto, amigos longe. Vocês que foram meus psicólogos, meus conselheiros, meus companheiros de aventuras, aguentaram minhas crises, me distraíram, viajaram comigo ou me abrigaram em viagens, me aconselharam, ouviram infinitas vezes eu explicar o meu projeto, e especialmente me amaram durante todo este processo. Eu sei que não foi fácil me aguentar, e por isso e por tudo eu sou profundamente grata. A Ceres e à cerveja, inspiração e solução, e que empresta seu nome à minha levedura. Com certeza não teria chegado aqui sem estas. Aos podcasts: Nerdcast, MRG, PDG, Scicast, Rapaduracast, TED Radio Hour, Invisibilia, Seth Andrews, que foram companhia indispensável nos momentos mais solitários, durante as longas horas de lavagem de vidraria e preparação de materiais, e em meus finais de semana no laboratório. Ao Dream Theater, Pink Floyd, Led Zeppelin, ACDC, Metallica, Janis Joplin, Dear Hunter dentre tantos outros, e especialmente ao Queen, que me inspiraram, me acompanharam, e foram a trilha sonora de tantos momentos. A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro. A EMBRAPA Agroenergia que me deu todo apoio, oportunidade e estrutura de desenvolver o projeto, foi meu laboratório e casa pelos dois últimos anos. A sociedade brasileira. E a todos que, de uma forma ou de outra, se sintam parte deste processo (ou não);
o meu sincero muito obrigada.
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Figura 1: Composição percentual da biomassa lignocelulósica, com seus principais monômeros constituintes. 13 Figura 2: Vias metabólicas de catabolismo da xilose: A = oxirredução e B = isomerização. 15 Figura 3: Confirmação da amplificação dos genes XI Piro (1,4kb) e XK (1,8kb)****. 38 Figura 4: Estratégia de construção do plasmídeo p424-XI. 39 Figura 5 Estratégia de clonagem para a construção do plasmídeo p426-XK. 40 Figura 6: Teste de crescimento das leveduras transformantes geradas. 42 Figura 7: Teste de crescimento entre transformantes isolados originais. 43 Figura 8: Curva de crescimento de seis colônias isoladas das linhagens obtidas a partir de cada população de condicionadas. 45 Figura 9: Confirmação da presença do gene XIPiro nos isolados condicionados 46 Figura 10: Confirmação da presença do gene XK nos isolados condicionados. 47 Figura 11: Teste de crescimento das linhagens transformantes originais econdicionadas. 48 Figura 12: Teste de crescimento com inóculo inicial alto das linhagens transformantes Originais e Condicionadas. 51 Figura 13: Cofermentação de glicose e xilose pelas linhagens L2XI Original e Condicionada (A, B) em biorreator em anaerobiose. 56 Figura 14: Atividade enzimática de xiluloquinase das linhagens transformantes Originais e Condicionadas. As barras indicam o desvio padrão das amostras. 58 Figura 15: PCR de confirmação da presença do gene XI Piro das colônias de bactéria transformada com DNA extraído das leveduras. 59 Figura 16: Alinhamento entre as sequencias de XIPiro das leveduras condicionadas L2XI, L7XIΦ, L7XIXK. 60 Figura 17: Teste de crescimento das leveduras condicionadas curadas. 62 Figura 18: Avaliação do crescimento das leveduras curadas. 64 Figura 19: PCR de colônia das leveduras curadas LC2, LCΦ e L7XIXK. 65 Figura 20: Comparação entre teste de crescimento da linhagem retransformada LC-RT7 (A) e a condicionada L7XIXK (B). 67 Figura 21: Sequência gerada a partir da montagem de contigs do sequenciamento do plasmídeo p424-XI. I Figura 22: Sequência gerada a partir montagem de contigs do sequenciamento da PCR de XIPiro utilizando plasmídeo extraído da levedura L2XI Condicionada. II
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Figura 23: Sequência gerada a partir montagem de contigs do sequenciamento de XIPiro dos plasmídeos A B, C, D e E extraídos das colônias de E. coli transformadas com plasmídeo da levedura L7XIΦ Condicionada. III Figura 24: Sequência gerada a partir montagem de contigs do sequenciamento de XIPiro dos plasmídeos A B, C, D e F extraídos das colônias de E. coli transformadas com plasmídeo da levedura L7XIXK Condicionada. IV Figura 25: Alinhamento entre sequências obtidas, dos plasmídeos p424-XI, L2XI, L7XIΦ e L7XIXK Condicionadas. VI
IV
oC Graus Celsius ADP Adenosina bi fosfato ATP Adenosina tri fosfato BSA Albumina do soro bovino ( bovine serum albumin ) CO 2 Dióxido de Carbono dNTP Desoxirribonucleotídeos Fosfatados ( deoxyribonucleotide triphosphate ) EDTA Ácido Etileno-diamino-tetra-acético H 2 SO 4 Ácido Sulfúrico HCl Ácido Clorídrico HPLC Cromatografia líquida de alta performance ( high performance liquid chromatography ) KOH Hidróxido de Potássio LB Meio de cultura Luria-Bertani MCS Sítios de clonagem múltipla ( multiple cloning sites ) Mg 2 Complexo binuclear de magnésio MgCl 2 Cloreto de Magnésio Mn 2 Complexo binuclear de manganês NaCl Cloreto de Sódio NAD+/NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo NADP+/NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NaOH Hidróxido de Sódio OD 600 Densidade ótica à 600nm (densidade celular) PCR Reação em cadeia de polimerase ( polymerase chain reaction ) Proálcool Programa Nacional do Álcool SB Tampão ácido bórico e sódio XDH Xilitol Desidrogenase XI Xilose isomerase XK Xiluloquinase XR Xilose Redutase Y-PER Reagente de extração de proteína de levedura YNB Base nitrogenada para levedura ( yeast nitrogen base ) YPD Extrato de levedura, peptona, dextrose ( yeast peptone dextrose ) YPX Extrato de levedura, peptona, xilose ( yeast peptone xylose )
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O aumento na demanda por energias sustentáveis impulsiona o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas para a produção de biocombustíveis. Neste contexto, o aproveitamento eficiente da biomassa lignocelulósica como matéria prima é fundamental para a produção de etanol de segunda geração. A levedura Saccharomyces cerevisiae , organismo mais utilizado na produção industrial de bioetanol, é incapaz de utilizar pentoses, como a xilose, que é o segundo açúcar mais abundante em algumas biomassas. Neste trabalho, plasmídeos epissomais foram construídos para expressão de genes codificadores para xilose isomerase (XI) de Piromyces sp. e xiluloquinase (XK) de S. cerevisiae. As linhagens laboratoriais de S. cerevisiae CEN.PK 113.14A Δtrp1-289 (L2) e CEN.PK 113.3C Δtrp1-289, Δura- (L7) foram transformadas com os plasmídeos gerados. Desta forma, foram construídas linhagens recombinantes de S. cerevisiae expressando XI isoladamente (L2XI) ou em conjunto com XK (L7XIXK). Uma terceira linhagem, L7XIΦ, expressando XI e com o segundo plasmídeo vazio foi construída como controle. A linhagem L7XIXK apresentou melhores taxas fermentativas que as demais linhagens, confirmando o efeito positivo da expressão de XK. As linhagens L2XI, L7XIΦ e L7XIXK obtidas foram submetidas a um processo de condicionamento em meio seletivo contendo xilose como única fonte de carbono. Ao final do condicionamento, quando comparadas com as originais, apresentaram menor fase lag de crescimento e maior taxa de crescimento, maior consumo de xilose (entre 1,8 e 18,5 vezes) e rendimento de etanol (47% para L7XIXK), concomitante à diminuição do rendimento de xilitol (entre 87,6% e 91,8%). A linhagem L2XI, investigada anaerobicamente, também apresentou aumento no consumo específico de xilose (49,8%), rendimento de etanol (19%) e redução no rendimento de xilitol (75%). As linhagens condicionadas foram submetidas então a um processo de cura para remoção dos plasmídeos. Uma das linhagens obtidas, LC7, derivada de L7XIXK perdeu a capacidade de crescer em meio mínimo, indicando a perda dos plasmídeos. Entretanto o gene para XI ainda foi identificado na levedura. A retransformação desta levedura curada com os plasmídeos originais demonstrou que as melhorias da levedura condicionada podem estar associadas a mutações fora do plasmídeo. Esta linhagem curada tem grande potencial
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The increasing demand for sustainable energy drives the development of biotechnological strategies for the production of biofuels. In this context, efficient utilization of lignocellulosic biomass as feedstock is essential for the production of second generation biofuels. The yeast S. cerevisiae, main organism utilized in the industrial production of bioethanol, is unable to use pentoses, such as xylose, which is the second most abundant sugar in some biomasses. In this work, multi-copy plasmids were constructed for the expression of genes coding xylose isomerase (XI) from Piromyces sp. and xylulokinase (XK) from S. cerevisiae. The laboratory strains of S. cerevisiae CEN.PK 113.14A Δtrp1- 289 (L2) and CEN.PK 113.3C Δtrp1-289, Δura- 52 (L7) were transformed with the generated plasmids. Thus, recombinant strains of S. cerevisiae expressing solely XI (L2XI), or combined with XK (L7XIXK) were obtained. A third strain, L7XIΦ, expressing XI and with an empty second plasmid, was constructed as control. The L7XIXK strain presented better fermentative rates than the other strains, confirming the positive effect of XK expression. The obtained strains L2XI, L7XIΦ and L7XIXK underwent a conditioning process in selective medium with xylose as sole carbon source. At the end of the process, when compared to the original strains, conditioned strains presented shorter lag growth phase, and increased growth rate, increased xylose consumption (1,8 to 18,5 fold) and ethanol yield (47% for L7XIXK), along with reduction in xylitol production (between 87, and 91,8%). The strain L2XI was investigated under anaerobic conditions and also has presented improved xylose specific consumption (49,8%), ethanol yield (19%) and xylitol reduction (75%). The conditioned strains underwent a curing process, in order to remove the plasmids. One of the obtained strains, LC7, which derived from L7XIXK, has lost its ability to grow on minimal medium, a result consistent with the loss of plasmids. However the XI gene was still identified in the yeast. The retransformation of this curated yeast with the originally constructed plasmids showed that the improvements observed in conditioned strains may be associated with mutations outside of the plasmids. The curated strain has a great potential for the development of a screening strain for new enzymes of the xylose catabolic pathway.
Keywords: Xylose isomerase, Saccharomyces cerevisiae, Metabolic engineering, Ethanol.
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1. Petróleo como fonte de energia mundial
O desenvolvimento industrial e social no século XX ocorreu em boa parte devido ao desenvolvimento da indústria petroquímica. O petróleo se tornou uma fonte de energia de baixo custo, abundante e eficiente, tanto para a indústria, agricultura, e na produção de produtos químicos derivados. Adentramos o século XXI, portanto, cada vez mais dependentes de combustíveis fósseis (ANP, 2014). Combustíveis fósseis atualmente representam aproximadamente 80% da energia produzida no mundo, incluindo petróleo, carvão e gás natural (HÖÖK; TANG, 2013). Ainda que tenha havido um crescimento da produção de petróleo de 85,7 milhões de barris por dia em 2009 para 90,88 milhões em 2013, a demanda aumentou quase proporcionalmente, de 84,97 para 91,19 milhões de barris por dia no mesmo período (EIA, 2014a). E a demanda mundial de energia está calculada para crescer cerca de 37% até 2040 (IEA, 2014). A utilização de combustíveis fósseis tem suscitado várias discussões. Além de disputas geopolíticas e crises econômicas (HE; WANG; LAI, 2010), também a crescente preocupação com os efeitos negativos dos derivados de petróleo para o meio ambiente, como a emissão de gases que contribuem para o efeito estufa (PETERSON; CONNOLLEY; FLECK, 2008), e o dano causado por contaminações subterrâneas e eventuais derramamentos. Adicionalmente, o distante, porém inevitável fato de que o petróleo tem disponibilidade limitada, têm incentivado estudos para o desenvolvimento de combustíveis alternativos (HÖÖK; TANG, 2013). Ainda que a preocupação com o esgotamento do petróleo e com a utilização de combustíveis sustentáveis pareça uma discussão moderna, Henry Ford, fundador da Ford Motors Company, em 1916, já fazia previsões para o fim da gasolina durante a Primeira Guerra Mundial, apostando no etanol como substituto:
A gasolina está indo; o álcool, chegando [...]. E olhe que está chegando para ficar, pois é uma fonte ilimitada. E é bom nós nos prepararmos para recebê-la. O mundo espera por um substituto para a gasolina. E, quando ele chegar, não haverá mais gasolina; dentro em pouco, os preços da gasolina subirão tanto que será inviável consumi-la como combustível de motor. Não tarda o dia em que cada tambor de gasolina deverá ser substituído por um tambor de álcool. Henry Ford, 1916 Wheels for the World: Henry Ford, His Company, and a Century of Progress (Tradução retirada de GORDINHO, 2010)
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2013). O Brasil é hoje o segundo maior produtor de etanol do mundo, com 27,6 bilhões de litros em 2013, atrás apenas dos Estados Unidos com 50,4 bilhões de litros (ANP, 2014). Em veículos, este pode ser utilizado em sua forma pura ou combinada à gasolina (DEMIRBAS, 2008), e se destaca como uma das alternativas mais promissoras na redução da dependência de gasolina. O potencial do etanol como combustível não é visionado apenas para veículos terrestres, em 2014 foi lançado o VS-30, primeiro foguete nacional movido por uma combinação de etanol e oxigênio líquido, na base de Alcântara, MA (FAB, 2014).
2.1. O cenário brasileiro
O Brasil, apesar de ter grande potencial na indústria petroquímica e da recente descoberta de jazidas como o pré-sal, ainda é dependente da importação de petróleo para abastecer o mercado interno (EIA, 2014b). Ainda assim, desde 2008, o Brasil se destaca como o único país do mundo em que o consumo de gasolina é superado por um combustível alternativo, o etanol (JANK, 2009; UNICA, 2010). No Brasil, a indústria sucroalcooleira é bem desenvolvida, e do período colonial até os anos 70 era principalmente voltada para produção de açúcar. Diante da crise do petróleo de 1973, o governo brasileiro criou em 1975 o Proálcool (Programa Nacional do Álcool). Com o programa, foram dados incentivos fiscais para o aumento do uso de etanol como combustível, além de tornar obrigatória a mistura do mesmo na gasolina, visando uma menor dependência da importação do combustível (MOREIRA; GOLDEMBERG, 1999). Em 2012 no Brasil, o etanol já representava 70% de todo o combustível utilizado em veículos, sendo boa parte representada pelos 20% de etanol adicionados à gasolina comum (CLARK; LUQUE; MATHARU, 2012). Em 2010, atingimos uma frota de 10 milhões de carros “ flex ”, ou seja, capazes de utilizar tanto gasolina como etanol como combustível. Desde 2003, com o lançamento deste tipo de veículo, a utilização do etanol evitou o lançamento de mais de 100 milhões de toneladas de CO 2 na atmosfera (UNICA, 2010). Contudo, segundo estimativas de crescimento da frota de veículos no Brasil, em 2020 será preciso dobrar a oferta de combustíveis para atender a demanda, assim como aumentar a produção de cana-de-açúcar de 555 milhões para 1,2 bilhões de toneladas por ano (UNICA, 2011a). É necessário discutir a segurança energética brasileira, de forma que se reduza a dependência da importação de petróleo, e o mercado esteja menos sujeito a flutuações de preços. A demanda e as estimativas para o futuro impulsionam não apenas a indústria como
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também pesquisas biotecnológicas com o intuito de aumentar o rendimento e a produtividade do etanol.
2.2. Produção de etanol: Primeira e segunda gerações
Ainda no início do século XX, Albert Jan Kluyver já predizia a utilização de carboidratos e óleos presentes em plantas como matéria-prima para a indústria química:
Assim, a intensificação da agricultura, e seu desenvolvimento associado à indústria moderna, irá, no futuro, tornar-se cada vez mais comum. Isto significa que a indústria química será abastecida principalmente com alguns produtos agrícolas básicos, cujo valor deriva em grande parte de seu conteúdo dos três principais grupos de substâncias, os carboidratos, óleos e proteínas. E assim, particularmente os hidrocarbonetos - os açúcares, amidos, e componentes da parede celular, - se tornarão proeminentes como matérias-primas. Albert Jan Kluyver Albert Jan Kluyver, His Life and Work, 1959) (Tradução Livre)
Existe hoje a tendência de classificação dos biocombustíveis em primeira e segunda geração, baseada nas suas matérias primas (LENNARTSSON; ERLANDSSON; TAHERZADEH, 2014; MACHADO, 2013), tal como previsto por Kluyver. Combustíveis de primeira geração são aqueles derivados de açúcares e óleos, de fontes vegetais como cana-de- açúcar, milho, beterraba, sementes e oleaginosas, entre outras. De forma geral, da extração ao produto final, são combustíveis relativamente fáceis de obter (NIGAM; SINGH, 2011). No caso do etanol, pode-se utilizar qualquer matéria prima contendo carboidratos, seja ela sacarina (cana-de-açúcar, beterraba) ou amilácea (milho, trigo, arroz). Depois da extração dos açúcares fermentescíveis, a levedura Saccharomyces cerevisiae é responsável pela fermentação dos açúcares a etanol. A última etapa consiste na destilação do caldo, para purificação do etanol (MACHADO, 2013). As fontes de matéria prima para o etanol de primeira geração costumam entrar em conflito econômico e social, uma vez que também são usados na indústria alimentícia (CLARK; LUQUE; MATHARU, 2012; NIGAM; SINGH, 2011). Os combustíveis de segunda geração são derivados de açúcares e óleos encontrados na biomassa lignocelulósica de plantas, e convertidos a combustíveis por meio de processos biológicos de esterificação (biodiesel) ou fermentação (etanol), ou ainda processos termoquímicos (pirólise) (TAYLOR, 2008). Geralmente, esses combustíveis são produzidos a
