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Um estudo sobre a utilização do marcador genético inter simple sequence repeats (issr) para diferenciar populações de drosophila willistoni que ocorrem em diferentes regiões do brasil. O documento também discute as espécies do subgrupo willistoni, suas distribuições geográficas e as possíveis interações genéticas entre elas. Além disso, o documento sugere a possibilidade de transmissão horizontal de material genético entre espécies.
O que você vai aprender
Tipologia: Notas de estudo
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Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Saúde Humana e Meio Ambiente da Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Saúde Humana e Meio Ambiente. Área de Concentração : Biologia da Conservação Orientadora: Dra. CLAUDIA ROHDE VITÓRIA DE SANTO ANTÃO 2019
willistoni DE Drosophila Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Saúde Humana e Meio Ambiente da Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Saúde Humana e Meio Ambiente. Aprovado em: 16 /09/ BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. Ana Cristina Lauer Garcia (Examinadora Interna) Universidade Federal de Pernambuco
Prof. Dr. Ronaldo Celerino da Silva (Examinador Externo) Universidade Federal de Pernambuco
Profa. Dra. Zilpa das Graças Silva de Melo (Examinadora Externa) Compesa – GNR Mata Norte
A meus pais Antonio e Lucinha, irmãos (Dido, Fio e Jéh), meu marido André, tia Eli, mas especialmente a minha princesa Ana Vitória, Te amo infinito. Família, meu tudo!
Aos meus colaboradores Prof. Dr. Amaro de Castro Lira Neto, do Laboratório de Genômica (IPA), e da doutoranda Flavia Tadeu de Araújo, do Departamento de Genética (UFPE), responsável pelo treinamento para construção da matriz do gel poliacrilamida. A família do Laboratório de Genética do CAV- UFPE, pelo apoio e auxílio no decorrer dessa jornada. Que prazer e felicidade conhecer e passar um pouco dos dias passageiros dessa vida com vocês, cada um marcou do seu jeitinho especial! Principalmente Ana Patrícia da Costa, companheira incansável de trabalho e idas ao IPA e a querida Zilpa Melo que várias vezes se deslocou para me auxiliar nos ajustes para os PCRs e géis. Aos demais companheiros do laboratório: Jorge, Rita, Gleyse, Érima, Danubia, Ícaro, Samuel, Jéssica, André, Rafaela, e tantos outros que passaram pelo laboratório, meu muito obrigada. À Universidade Federal de Pernambuco, orgulho de ter feito parte dessa instituição. Aos responsáveis pelo curso de Pós-Graduação em Saúde Humana e Meio Ambiente (PPGSHMA), aos professores de cada uma das disciplinas ministradas e por cada conhecimento compartilhado. Feliz e grata por ter feito parte da última turma que o programa formou. Aos meus queridos colegas de turma do mestrado pela troca de experiência e apoio na leitura de artigos. Aos Órgãos de Fomento CNPq, CAPES, FACEPE e PROPESQ-UFPE. Enfim, meus sinceros agradecimentos a cada um que fez parte de mais uma etapa na minha vida. São muitos os ensinamentos e experiências que levo comigo e que me ajudaram a ser mais forte hoje. OBRIGADA a todos, OBRIGADA DEUS!
“O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada. Caminhando e semeando, no fim terás o que colher.” Cora Coralina
Polyacrylamide gel electrophoresis represents a valuable technique for separation and characterization of DNA fragments. This methodology can be applied after polymerase chain reaction (PCR) to characterize genetic markers such as Inter Simple Sequence Repeats (ISSR). The main objective of this work was to implement the methodology to improve the definition of patterns and variability within and among Brazilian populations of Drosophila willistoni. Belonging to the genus Drosophila Fallen 1823, D. willistoni is the species of drosophilid that has the largest geographical distribution, ecological versatility, and the ability to explore diverse habitat types such as forests, open formations, and cities. The methodology tested here was the separation of ISSR fragments using primers 844 (CT 8 RC) and 868 (GAA 6 ). Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was performed at a concentration of 6%, 1 mm thick, non- denaturing, and Silver Nitrate staining. The results allowed the recognition of polymorphic fragments in the D. willistoni populations studied. The methodology was also tested to define species-specific patterns of the transposable element P in two cryptic species to D. willistoni. The results confirm the hypothesis that PAGE is effective for visualization, pattern setting for Drosophila species and populations, opening perspectives for further studies on the genetic patterns of Neotropical species. Keywords : Drosophila, Polymorphic patterns, PAGE, willistoni subgroup.
Figura 1 - Imagens da morfologia externa de uma fêmea e um macho de Drosophila willistoni. Fonte: www.flybase.org.br, acesso em julho/2015.
Figura 2 - Distribuição geográfica das espécies do subgrupo willistoni. Compilação de Zanini et al. (2015), de acordo com dados Spassky et al. (1971); Winge (1971); Dobzhansky e Powell (1975); Ehrmann e Powell (1982); Santos e Valente (1990).
Figura 1 - Resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida 6% e revelação com Nitrato de Prata, indicando os padrões de bandas ISSR amplificadas por PCR com o primer 844 ( CT 8 RC ). As amostras de populações naturais de Drosophila willistoni foram: MRI= Marituba/PA, SAL= Saltinho/PE, BJC= Brejo dos Cavalos/PE, ALD= Aldeia/PE, JEQ= Jequiriçá/BA, BRA= Brasília/DF, RIO= Rio de Janeiro/RJ, OSS= Rio Grande do Sul/RS. LAD=marcador DNA ladder 100 pb.
Figura 2 - Resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida 6% e revelação com Nitrato de Prata, indicando os padrões de bandas ISSR amplificadas por PCR com o primer 868 (GAA) 6. As amostras de populações naturais de Drosophila willistoni foram: SAL= Saltinho/PE, BJC= Brejo dos Cavalos/PE, ALD= Aldeia/PE, JEQ= Jequiriçá/BA, OSS= Rio Grande do Sul/RS. LAD=marcador DNA ladder 100 pb.
Figura 1- Resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida 6% e revelação com Nitrato de Prata, indicando os padrões de bandas de elemento transponível P em amostras de Drosophila willistoni (A) , D. paulistorum (B) e Drosophila equinoxialis (C). BRA=Brasília, MRI= Marituba-Pará, RIO= Rio de Janeiro, PDI= Parque Dois Irmãos-Pernambuco, RON= Rondônia. LAD=marcador DNA ladder 100 pb.
Figura 2 - Detalhe da imagem da Figura 1, para tamanhos de bandas entre 500 e 1000 pb, com indicação da conservação de bandas entre as amostras de cada espécie (linhas horizontais azuis); da variabilidade de bandas observadas em algumas amostras da espécie (quadrados brancos); e da ausência de bandas em algumas amostras (quadrados vermelhos).
BJC Parque Municipal João Vasconcelos Sobrinho - PE BRA Reserva Biológica IBGE – DF dNTP Desoxirribonucleotídeos fosfatados (A, T, C, G) D. Drosophila GUA Reserva Biológica de Guaribas - PB ISSR Inter Simple Sequence Repeat JEQ Município de Jequiriçá - BA MRI Maranhão- MA OSS Morro do osso – RS PAGE PCR PDI Eletroforese em gel de poliacrilamida Reação em cadeia polimerase Parque Estadual de Dois Irmãos - PE RIO Parque Nacional Serra dos Órgãos - RJ Rpm Rotação por minuto SAL Reserva Biológica de Saltinho - PE seg SER Segundos Serra da Canastra – MG
15 análises de alta resolução (sequenciamento de DNA/RNA) que requerem maior definição das bandas. Melo (2018) apresentou pela primeira vez em uma espécie da família Drosophilidae, uma análise populacional de ISSR. Os resultados indicaram elevado índice de diversidade genética em oito populações brasileiras de Drosophila willistoni. Porém, o marcador ISSR não foi capaz de diferenciar as populações entre si. Nesta proposta apresentamos resultados do uso do gel de poliacrilamida em espécies do subgrupo willistoni para estudo do marcador ISSR e outras sequências de DNA com a finalidade de definir melhor a variabilidade dentro e entre populações.
16 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Verificar a metodologia em gel de poliacrilamida como melhor método de análise para diferenciação de populações de Drosophila willistoni que ocorrem em diferentes regiões do Brasil, utilizando o marcador genético Inter Simple Sequence Repeats (ISSR). 2.2 Específicos a) Aprimorar a metodologia de análise do marcador ISSR, testando as amostras de populações naturais de D. willistoni por eletroforese em gel de poliacrilamida; b) Analisar os padrões de fragmentos polimórficos de D. willistoni obtidos pelo marcador ISSR através da PAGE; c) Implementar a metodologia em gel de poliacrilamida como rotina do laboratório para melhor separação dos fragmentos de DNA, possibilitando o estudo de variabilidade e mudanças genéticas de populações naturais de drosofilídeos.
18 reprodução, e também seu tamanho, há a possibilidade do cultivo dessas espécies em laboratório, tornando-as excelentes modelos de estudos voltados à evolução, biologia do desenvolvimento, ecologia de populações e genética (SEPEL; LORETO, 2010). Por apresentarem características vantajosas quando comparados a outros grupos de invertebrados, os drosofilídeos são utilizados em uma variedade impressionante de estudos, há mais deum século. Suas qualidades dão suporte tanto para estudos mais generalistas, quanto mais pontuais, com destaque dos recentes estudos sobre mal de Alzheimer, alcoolismo, envelhecimento, que utilizam Drosophila como espécie-modelo (SEPEL; LORETO, 2010). 3.2Grupo e subgrupo willistoni Dentro do subgênero Sophophora e gênero Drosophila se destaca o grupo willistoni ,composto por 24 espécies com distribuição essencialmente neotropical. O grupo se divide em três subgrupos distintos: i) o subgrupo willistoni, constituído por seis espécies crípticas: Drosophila willistoni, Drosophila paulistorum , constituída por várias semiespécies, D. equinoxialis, D. tropicalis, D. insularis e D. pavlovskiana (VAL et al., 1981), sendo D. willistoni a espécie de maior distribuição geográfica, seguida pela D. paulistorum e D. equinoxialis; ii) o subgrupo não críptico alagitans com 12 espécies, sendo as mais estudadas D. nebulosa, D. capricorni e D. fumipennis (SPASSKY et al.,1971) e iii) subgrupo bocainensis , composto por cinco espécies. Segundo Throckmorton (1975) a origem do grupo willistoni se deu na América do Sul, após uma migração ancestral da América do Norte. Como já mencionado no texto o grupo willistoni de Drosophila é um dos mais representativos da região Neotropical, sendo encontrados nos mais diversos biomas brasileiros: Pampa (POPPE et al., 2014), Caatinga (GARCIA et al., 2014), Amazônia (MARTINS; OLIVEIRA, 2007), Cerrado (CHAVES; TIDON, 2008), Mata Atlântica (DE TONI et al.,
19 grupos de drosofilídeos mais abundantes na região neotropical (GARCIA et al., 2014). De modo geral, formam um complexo de vários níveis taxonômicos (DOBZHANSKY,1957), sendo fonte de vários estudos biológicos, através de arranjos sequenciais de estágios evolutivos, tornando-se modelos ideais para análises evolutivas. Burla et al. (1949) foram os primeiros a designarem o termo espécies crípticas ou siblings (espécies-irmãs), tradicionalmente usado para classificar as espécies pertencentes ao subgrupo willistoni. Segundo Mayr (1963) o termo siblings refere-se a “populações naturais morfologicamente idênticas ou muito semelhantes, mas reprodutivamente isoladas”. O interesse teórico por espécies crípticas reside no fato de elas atestarem a possibilidade da existência de isolamento reprodutivo entre espécies sem que seja acompanhado, obrigatoriamente, de mudanças morfológicas; ou que diferenças fisiológicas entre espécies possam estar presentes em indivíduos que são morfologicamente muito semelhantes (crípticos). Dobzhansky (1970) reforçou também este conceito, salientando que “as espécies são fenômenos da natureza que existem independentemente da nossa capacidade para distingui-las”. 3.3 Drosophila willistoni Em 1896, Samuel Williston publicou o trabalho intitulado “On the Diptera of St. Vincent (West Indies)” e nele descreveu uma nova espécie pertencente ao grupo willistoni denominando-a de Drosophila pallida , desconhecendo o fato de que já havia uma espécie com a mesma nomenclatura. Anos mais tarde esse “equívoco” foi corrigido e a mosca descrita foi então nomeada de Drosophila willistoni em sua homenagem. A espécie Drosophila willistoni (Figura 1 ) tem a maior distribuição geográfica dentre as espécies do subgrupo willistoni, sendo encontradas em abundância desde o México e Flórida até o sul do Brasil, Uruguai e Argentina do Oceano Atlântico ao Pacífico, exceto em áreas de grande altitude e desertos (SPASSKY et al., 1971; EHRMAN; POWELL, 1982), até mesmo em áreas urbanas (SPASSKY et al., 1971) (Figura 3 ). Na Flórida, Uruguai e Argentina e norte do México encontra-se apenas D. willistoni (SPASSKY et al., 1971). Em outras localidades, no entanto, D. willistoni
