Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Prepare-se para as provas com trabalhos de outros alunos como você, aqui na Docsity
Os melhores documentos à venda: Trabalhos de alunos formados
Prepare-se com as videoaulas e exercícios resolvidos criados a partir da grade da sua Universidade
Responda perguntas de provas passadas e avalie sua preparação.
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Comunidade
Peça ajuda à comunidade e tire suas dúvidas relacionadas ao estudo
Descubra as melhores universidades em seu país de acordo com os usuários da Docsity
Guias grátis
Baixe gratuitamente nossos guias de estudo, métodos para diminuir a ansiedade, dicas de TCC preparadas pelos professores da Docsity
Um estudo sobre a detecção de diferentes espécies virais do complexo viral do alho (allium sativum) em plantas matrizes provenientes de limpeza clonal e infectadas, utilizando a técnica de rt-pcr. O documento também discute as alterações fisiológicas, morfológicas, bioquímicas e citológicas causadas pelas infecções virais e as técnicas utilizadas para a detecção de vírus em alho, como elisa e rt-pcr. Além disso, o documento menciona algumas doenças importantes que afetam a cultura do alho, como alternaria porri e puccinia allii, e os reflexos das alterações causadas pela infecção viral na produção de alho.
Tipologia: Notas de estudo
1 / 173
Esta página não é visível na pré-visualização
Não perca as partes importantes!
Tese apresentada ao Departamento de Fitopatologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília como requisito para a obtenção do título de Doutor em Fitopatologia.
iv
Diagnose, disseminação e efeitos fisiológicos do complexo viral do alho em regiões produtoras do Brasil. [Distrito Federal] 2010. XXX p. (IB/UnB, Doutor, Fitopatologia, 2010). Tese de Doutorado- Universidade de Brasília. 1.Vírus 2.Sondas moleculares 3.RT-PCR 4.Alho 5.Alterações fisiológicas
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA FAYAD-ANDRÉ, M. S. Diagnose, disseminação e efeitos fisiológicos do complexo viral do alho em regiões produtoras do Brasil. Brasília: Instituto de Biologia, Universidade de Brasília, 2010, XXXp. Tese de Doutorado. CESSÃO DE DIREITOS Nome do Autor: Michelle de Souza Fayad André Título da Tese: Diagnose, disseminação e efeitos fisiológicos do complexo viral do alho em regiões produtoras do Brasil. Grau: Doutor Ano: 2010 É concedida à Universidade de Brasília, à Embrapa Hortaliças, permissão para reproduzir esta tese ou emprestá-la apenas para propósitos acadêmicos e científicos. Michelle de Souza Fayad André Universidade de Brasília Departamento de Fitopatologia Endereço eletrônico: mi_fayad@hotmail.com
v
“Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo o propósito debaixo do céu. Há tempo de nascer, e tempo de morrer; tempo de plantar, e tempo de arrancar o que se plantou; Tempo de matar, e tempo de curar; tempo de derrubar, e tempo de edificar; Tempo de chorar, e tempo de rir; tempo de prantear, e tempo de dançar; Tempo de espalhar pedras, e tempo de ajuntar pedras; tempo de abraçar, e tempo de afastar-se de abraçar; Tempo de buscar, e tempo de perder; tempo de guardar, e tempo de lançar fora; Tempo de rasgar, e tempo de coser; tempo de estar calado, e tempo de falar; Tempo de amar, e tempo de odiar; tempo de guerra, e tempo de paz.”
AO ALFA E O ÔMEGA, O PRINCÍPIO E O FIM, ÀQUELE QUE ERA, QUE É, E O QUE HÁ DE VIR ...
vii
Às queridas amigas Darislene e Gabriela Buzzi meus sinceros
agradecimentos.
Ao meu grande amigo Davi Rossato. Obrigada por todo o apoio...
Aos colegas do Laboratório de Microscopia Eletrônica, em especial
Raimundo, Virgínia, Anabele, Débora, André Bertran e Misléia...
A todos os amigos da Fitopatologia: Andreza Tomé, Ednalva Patrícia,
Rita Pereira, Ana Paula, Fernanda, Érico, Vânia Freitas, Débora
Zocolli...
por todo o apoio e ensinamento...
Aos meus pais (Sérgio Fayad e Luzirene) e aos meus parentes que em
seus corações torciam por mim, meu muito obrigado!!!
À minha família querida: meu esposo Régis, minhas filhas Ana Carolinna
e Nathália e ao João Pedro, vocês são meu maior incentivo. Obrigada
pela paciência...amo vocês!!!
viii
FICHA CATALPGRÁFICA.......................................................................iv DEDICATÓRIA..........................................................................................v AGRADECIMENTOS...............................................................................vi ÍNDICE GERAL......................................................................................viii ÍNDICE DE TABELAS............................................................................xiii ÍNDICE DE FIGURAS..............................................................................xv RESUMO.................................................................................................xix ABSTRACT...........................................................................................xxiii CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO GERAL....................................................
x
5.1. Extração do RNA total e Reação de Transcrição Reversa (RT)........ 5.2. Reação de RT-PCR............................................................................ 5.3. Teste de verificação da qualidade do RNA total extraído e usado nas reações de RT-PCR .................................................................................
3.2. Amplificação dos vírus do complexo do alho via RT-PCR a partir de extratos de RNA total de plantas...............................................................
xi
NO COMPLEXO VIRAL DO ALHO ( Allium sativum ) EM REGIÕES PRODUTORAS DE ALHO NO BRASIL...................................................
I.Introdução.............................................................................................. II. Material e Métodos..............................................................................
CAPÍTULO IV: EFEITOS FISIOLÓGICOS, MORFOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E CITOLÓGICOS EM PLANTAS DE ALHO ( ALLIUM SATIVUM L.) CAUSADOS POR INFECÇÃO VIRAL............................... I. Introdução............................................................................................. II. Material e Métodos..............................................................................
xiii
Tab.1. Evolução anual da produção mundial de alho ( Allium sativum)...4. Tab. 2 : Ranking da produção nacional de alho, no ano de 2008.............. Tab.3. Principais espécies de vírus encontradas associadas à cultura do alho, espécies tentativas e seu grupo vetor.............................................. Tab. 4. Sequência dos oligonucleotídeos específicos (primers) sintetizados a partir da sequência da capa protéica de seis espécies virais que infectam alho nas principais regiões produtoras desta cultura do Brasil.......................................................................................................... Tab. 5. Amostras de plantas de alho ( Allium sativum ) analisadas provenientes da Embrapa Hortaliças........................................................ Tab. 6. Detecção do complexo viral do alho via NCM-Elisa com antissoros policlonais em amostras do banco de germoplasma da Embrapa Hortaliças................................................................................................... Tab. 7. Detecção viral em amostras de alho provenientes do banco de germoplasma da Embrapa Hortaliças via RT-PCR com primers específicos para espécies do complexo viral do alho............................... Tab. 8 : Descrição das amostras de alho ( Allium sativum L.) analisadas no Brasil, quanto à origem geográfica, o sistema produtivo e a cultivar......................................................................................................... Tab. 9. Prevalência das espécies do complexo viral do alho ( Allium sativum ) por sistema produtivo................................................................. Tab. 10. Prevalência das espécies do complexo viral do alho ( Allium sativum ) por cultivar de alho comum e nobre por sistema de produção utilizados no Brasil.....................................................................................
xvi
Fig. 7. Análise comparativa da visualização do produto de PCR em diluições seriadas via gel de agarose e sonda molecular não-radioativa. Fig. 8. Avaliação da eficiência da extração de RNA total de plantas através da amplificação de um fragmento de 358 pb com um par de primers EF1F (5’-TGTTGCTGTTAAGGATTTGAAGCG-3’) e EF1R (5’- AACAGTTTGACGCATGTCCCTAAC-3’), específicos para a porção interna de um gene conservado correspondente a um fator de elongação na maioria das plantas.............................................................................. Fig. 9. Detecção do complexo viral do alho via RT-PCR com primers vírus-específicos em amostras de plantas provenientes das principais regiões produtoras do Brasil...................................................................... Fig. 10. Dispersão das espécies do complexo viral em áreas produtoras de alho no Brasil...................................................................................... Fig. 11. Avaliação das variáveis de crescimento em plantas de alho ( Allium sativum ) sadias e infectadas pelo complexo viral em três épocas (30, 60 e 90 dias após o plantio) por três anos......................................... Fig. 12. Avaliação das variáveis fisiológicas em plantas de alho ( Allium sativum ) sadias e infectadas pelo complexo viral durante três anos....... Fig. 13. Avaliação da concentração de pigmentos fotossintéticos em plantas de alho ( Allium sativum ) livre de vírus e infectadas por um complexo viral durante três anos............................................................... Fig. 14. Avaliação da atividade da Rubisco em plantas de alho ( Allium sativum ) sadias e infectadas por um complexo viral durante três anos..
xvii
Fig. 15. Avaliação da concentração de proteínas totais em plantas de alho ( Allium sativum ) sadias e infectadas por um complexo viral durante três anos......................................................................................................... Fig. 16. Avaliação da concentração de açúcares solúveis totais em plantas de alho ( Allium sativum ) sadias e infectadas por um complexo viral no ano de 2007, aos 60 e 90 dias após o plantio.................................... Fig. 17. Microscopia eletrônica de sessões ultra-finas do mesófilo de células de folhas de planta de alho (Allium sativum) sadias e infectadas por Potyvirus , Carlavirus e Allexivirus coletadas às 9:00h......................
xix
CP de seis vírus detectados no país ( Potyvirus: Onion yellow dwarf virus- OYDV , Leek yellow stripe virus - LYSV; Allexivirus: Garlic virus C- GarV-C , Garlic virus D- GarV-D e Garlic mite-borne filamentous virus- GarMbFv e Carlavirus: Garlic common latent virus- GarCLV), foram efetuadas para a síntese das sondas específicas marcadas com digoxigenina. Os resultados mostraram que as sondas foram específicas para a detecção do gene da capa protéica de cada espécie viral. Todas as sondas espécie-específicas foram sensíveis para detectar o cDNA do gene da capa protéica de suas respectivas espécies a uma concentração de 0, ng/ μL. Entretanto, as mesmas não permitiram a detecção de amostras provenientes de RNA total. Foi demonstrado também, que a técnica de hibridização aumentou a capacidade de visualização dos produtos da PCR auxiliando na maior sensibilidade de detecção dos vírus. Paralelamente ao desenvolvimento das sondas, a técnica de RT-PCR foi desenvolvida para a detecção de amostras provenientes de RNA total, sendo estes resultados, comparados com a detecção sorológica via ELISA. Os resultados obtidos indicaram a maior sensibilidade da RT-PCR na detecção de diversas espécies virais em plantas matrizes provenientes de limpeza clonal, que supostamente deveriam estar livres de vírus. No Capítulo III foi estudada a prevalência e a ocorrência das seis espécies virais em regiões produtoras de alho no Brasil sob diferentes sistemas produtivos. Para isso, amostras de alho foram coletadas nas regiões produtoras para análise via RT-PCR com primers específicos. Os resultados revelaram a ocorrência de Potyvirus (OYDV e LYSV) em todas
xx
as regiões. O Carlavirus (GarCLV) ficou restrito as regiões de produção de Cerrado (MG, BA e GO). Em todas as regiões amostradas foi observada, no mínimo, uma espécie de Allexivirus (GarMbFV, GarV-C e GarV-D). A prevalência desses vírus nas regiões produtoras foi relacionada principalmente ao tipo de sistema produtivo e as variedades de alho utilizadas pelos produtores rurais. Foram realizadas avaliações em planta de alho sadias (PS), livres de vírus, e infectadas (PI), com um complexo viral com a finalidade de estudar os efeitos fisiológicos, morfológicos, bioquímicos e citológicos causados pelos vírus. Bulbilhos foram semeados em vasos e 30, 60, 90 dias após plantio (DAP) foram realizadas as avaliações de várias variáveis fisiológicas e bioquímicas durante 3 anos e comparadas estatisticamente. As plantas sadias apresentaram desenvolvimento superior em relação às plantas infectadas. A análise fotossintética revelou que as plantas sadias assimilaram 20% a mais de CO2, do que as plantas infectadas, somente aos 30 DAP. Houve uma redução nos teores de clorofilas a e b, nas três épocas de avaliação, durante os três anos, mas não no teor de carotenóides, para as plantas infectadas. Não se observou diferença significativa na atividade da Rubisco, na produção de açúcares solúveis totais e proteínas totais. A avaliação de amido revelou que as plantas de alho não acumulam amido ou o fazem em baixas concentrações. Este resultado foi confirmado pelas análises citológicas em células de plantas sadias. Além disso, foi observada a presença de aglomerações de compostos lipídicos fora dos cloroplastos normais das células sadias. Em contrapartida, os cloroplastos das células infectadas apresentaram
