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Resumo COVID Existem no mundo cerca de 2.000 registros de ensaios clínicos para a investigação de medicamentos aprovados e outros candidatos para a Covid-19, incluindo moléculas pequenas e medicamentos biológicos, sem contar as vacinas. O reposicionamento de fármacos, estratégia mais explorada até o momento, não levou a qualquer novo tratamento antiviral contra a Covid-19. O remdesivir, apesar de sua aprovação emergencial pela agência reguladora norte-americana, apresentou somente resultados modestos em estudos clínicos. A dexametasona, que contribuiu para reduzir a mortalidade em pacientes graves recebendo ventilação mecânica invasiva ou oxigênio, é um corticoide que possui propriedades anti-inflamatórias e imunossupressoras. Os medicamentos biológicos, por sua vez, como anticorpos monoclonais, interferons, proteínas específicas e anticoagulantes estão sendo avaliados em diversas triagens clínicas para definir o seu papel na terapia da doença. A Organização Mundial da Saúde (OMS) alertou que o coronavírus poderá nunca desaparecer, mesmo com uma eventual vacina, evidenciando a urgência de pesquisas por novos fármacos inovadores. O sars-CoV-2 (coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2) se espalhou rapidamente pelo mundo, a partir de Wuhan-China, causando graves implicações socioeconômicas e de saúde pública. O panorama global, de janeiro a setembro de 2020, é devastador. Mais de 33 milhões de pessoas foram infectadas com o vírus, que é o causador da Covid-19, doença que causou a morte de cerca de 1 milhão de pessoas (WHO, 2020; Zhu et al., 2020). Somente no Brasil, no mesmo período, foram aproximadamente 4,8 milhões de casos confirmados da doença e 143 mil mortes, com mais de 4 milhões de recuperados. O Brasil ocupa a terceira colocação mundial em número de casos de Covid-19, ficando atrás dos Estados Unidos e da Índia, que registraram cerca de 7,1 e 6,1 milhões de casos, respectivamente, e a segunda colocação em número de mortes, superado apenas pelos Estados Unidos, que já ultrapassou a marca de 205 mil mortes (WHO, 2020). O componente principal de uma formulação farmacêutica empregada como medicamento é denominado fármaco ou princípio ativo. É geralmente uma molécula pequena, de origem natural ou sintética, que possui estrutura química definida e é capaz de ajustar ou modificar funções fisiológicas, sendo usado para tratar, curar ou prevenir doenças e disfunções em humanos (Wermuth et al., 1998). Até chegar à aprovação, última etapa antes da comercialização, o fármaco passa por um longo e complexo processo de Pesquisa e Desenvolvimento (P&D), que é caracterizado por elevados investimentos e riscos (DiMasi, 2020). Processo de criação de Farmacos: O processo de P&D de moléculas pequenas (peso molecular < 1.000 Da) envolve duas fases fundamentais, chamadas de fases de descoberta (ou pré-clínica) e desenvolvimento (ou clínica) (Figura 1). O objetivo é aprimorar e potencializar a melhor combinação de características farmacodinâmicas (potência, afinidade e seletividade), farmacocinéticas (ADME: administração, distribuição, metabolismo e excreção) e toxicológicas para assegurar duas propriedades indispensáveis para um novo medicamento: segurança e eficácia ( Dowden; Munro, 2019 ). A fase pré-clínica, que pode levar de dois a seis anos, envolve diversas etapas, incluindo: identificação e validação de alvos moleculares (proteínas-alvo); realização de triagens biológicas e computacionais; planejamento, síntese e avaliação in vitro de novas moléculas bioativas; otimização de propriedades como potência, seletividade e ADME; até a investigação in vivo dos compostos mais promissores em modelos experimentais em animais. Essa fase se encerra com a descoberta de um
candidato a novo fármaco, denominado nova entidade química (NCE, New Chemical Entity). Após a aprovação da NCE pela agência reguladora tem início a fase clínica, que é composta pelas fases 1, 2 e 3. Na fase clínica 1 são avaliados voluntários saudáveis em relação à segurança e as dosagens do candidato a fármaco. Na fase clínica 2, a NCE é administrada em pacientes para a avaliação da segurança e eficácia. Por sua vez, a fase clínica 3 é responsável por ampliar os testes de avaliação de segurança e eficácia para um grande número de pacientes, com ampla cobertura mundial, bem como estabelecer os protocolos de formulação e produção industrial do medicamento. Por fim, as agências reguladoras revisam todos os dados das triagens clínicas para a aprovação do registro do novo medicamento. No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) é a agência reguladora de medicamentos, e nos Estados Unidos, a equivalente é a Administração de Alimentos e Medicamentos (FDA, Food and Drug Administration). A fase clínica 4 tem início após a comercialização do medicamento e são monitoradas as reações adversas inesperadas a longo prazo, bem como o impacto do novo produto na promoção da saúde. Para atender às demandas urgentes de uma pandemia, como a de Covid-19, os cientistas se mobilizaram na busca por novos tratamentos e o reposicionamento de fármacos surgiu naturalmente como a alternativa mais segura e viável. Essa estratégia busca identificar novas indicações para medicamentos aprovados ou candidatos em fases clínicas avançadas por meio de triagens fenotípicas, seguidas de ensaios clínicos de fases 2 e 3 (Pushpakom et al., 2019). Em comparação ao processo tradicional de P&D, o reposicionamento de fármacos possui algumas vantagens. As principais são o tempo e o custo de desenvolvimento bem menores, pois os testes de segurança (pré-clínica e clínica) e os protocolos de formulação e produção em larga escala já foram estabelecidos ( Ferreira; Andricopulo, 2016 ). A principal base de dados de registros de estudos clínicos, a ClinicalTrials.gov, mantida pela Biblioteca Nacional de Medicina nos Institutos Nacionais da Saúde (NIH, National Institutes of Health) dos Estados Unidos, possui aproximadamente 2.000 estudos clínicos registrados (até o final de setembro de 2020) para a Covid-19, considerando-se somente moléculas pequenas e biológicos. Outras bases de dados importantes, como a EU Clinical Trials Register, a ISRCTN e a Chinese Clinical Trial Registry (ChiCTR), também possuem diversos registros, totalizando em torno de 2.500 estudos clínicos, com cerca de 200 medicamentos, sem contar fitoterápicos e extratos diversos. As principais classes terapêuticas investigadas são antivirais, anticâncer, anti-hipertensivos, imunossupressores, antiparasitários e anti-inflamatórios, entre outras. A grande demanda de testes clínicos e a necessidade de avaliar mais profundamente alguns candidatos induziram à organização de redes mundiais. Uma dessas iniciativas, a Recovery (Randomised Evaluation of Covid-19 Therapy ou Avaliação Randomizada da Terapia contra a Covid-19) foi estabelecida para investigar a eficácia de diferentes protocolos em pacientes hospitalizados com Covid-19 (Normand, 2020). Liderada pela Universidade de Oxford, são considerados atualmente os tratamentos com dexametasona, azitromicina, plasma convalescente, tocilizumabe e REGN-COV2. Os dados desses estudos são revisados regularmente para que qualquer tratamento eficaz possa ser identificado rapidamente e disponibilizado a todos os pacientes. O principal resultado desse estudo até o momento foi com a dexametasona (Figura 3), um corticoide com propriedades anti-inflamatórias e imunossupressoras, usado desde a década de 1960, que reduziu a taxa de mortalidade em pacientes graves recebendo ventilação mecânica invasiva ou oxigênio (Recovery Collaborative Group et al., 2020). Por outro lado, estudos no âmbito da Recovery descartaram definitivamente a hidroxicloroquina e lopinavir- ritonavir por não apresentarem nenhum benefício clínico em pacientes hospitalizados com Covid-19, a partir das evidências preliminares em estudos pré-clínicos realizados em laboratório. Outra iniciativa internacional, a Solidarity, liderada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para avaliar a eficácia de tratamentos para a Covid-19, considera
curto/médio prazo, a sua produção em larga escala e os altos custos de comercialização são grandes desafios em relação à sua acessibilidade e disponibilidade global. Os interferons são glicoproteínas que estimulam o sistema imunológico a combater invasores externos, incluindo o Sars-CoV-2. Estudos sugerem que o aumento de interferons no organismo humano, especialmente no início da infecção, pode diminuir os efeitos da Covid-19 e os danos à saúde, como observado em tratamentos para outras doenças, como como a hepatite C e a esclerose múltipla. Estudos preliminares produziram resultados interessantes, que devem ser confirmados para estabelecer o real potencial da terapia e os possíveis efeitos colaterais em humanos. O uso de plasma convalescente é outra abordagem terapêutica que está sendo testada em pacientes com Covid-19. Há mais de um século, o plasma convalescente de doadores recuperados de infecções tem sido transfundido em outros pacientes que apresentam a mesma infecção. Exemplos incluem Ebola, Mers e gripe H1N1 ( Chen et al., 2020 ). Em meio a pandemia, a expectativa é que os anticorpos produzidos por doadores curados da doença possam auxiliar o sistema imunológico dos indivíduos receptores a neutralizar o vírus. No entanto, os estudos realizados foram feitos com pequenos grupos de pacientes, geralmente não randomizados e sem grupo controle ( Ledford, 2020 ), não apresentando resultados conclusivos. Outra dificuldade é a grande variação que existe na concentração de anticorpos entre diferentes doadores. Estudos clínicos conduzidos na iniciativa Recovery estão em andamento e ainda não é possível avaliar a segurança e eficácia do uso de plasma convalescente no tratamento da Covid-19. A enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2, Angiotensin-Converting Enzyme 2), que se liga à proteína S da superfície viral, foi identificada como receptor essencial para a infecção pelo Sars-CoV-2, que também envolve a serino-protease transmembrana 2 (TMPRSS2, Transmembrane Serine Protease 2) (Monteil et al., 2020). Proteínas ACE recombinantes mostraram resultados promissores em experimentos com células, mas ainda precisam demonstrar a sua ação em humanos. Além disso, o mecanismo molecular de ação sugere que a inibição dessas interações pode ser um tratamento útil. Dessa maneira, a entrada do vírus nas células poderia ser bloqueada por anticorpos neutralizantes da proteína S e por inibidores da TMPRSS2. Por fim, a heparina e outros anticoagulantes estão sendo avaliados em triagens clínicas de fases 2 e 3 para definir os possíveis benefícios e riscos na prevenção de infecções ou tratamento de pacientes hospitalizados com Covid-19 (NIH, 2020; Tandon et al., 2020). O Sars-CoV-2 é formado por uma cápsula proteica, denominada capsídeo, envolvendo o material genético, o RNA, e tem em média, 120 nanômetros de tamanho. O genoma do Sars-CoV-2 foi rapidamente sequenciado e consiste em uma molécula de RNA fita simples de sentido positivo (ssRNA+) de aproximadamente 30 kb. As fases de leitura aberta (ORF, Open Reading Frame), ORF1a e ORF1b , que juntas compreendem mais de 21 kb, codificam a produção de 16 proteínas não estruturais (nsp1 a nsp16), entre elas as enzimas indispensáveis para a replicação viral. O envelope esférico do vírus contém 4 proteínas estruturais: Spike (S), envelope (E), membrana (M), e nucleocapsídeo (N) , dentro do envelope. Um terceiro grupo de 9 proteínas acessórias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8, 9b, 9c, 10) que não são essenciais para a replicação do vírus, mas parecem ter um papel na patogênese, completa as 29 proteínas do Sars-CoV-2 ( Gordon et al., 2020 ; Zhou et al., 2020). A principal protease do Sars-CoV-2 (Mpro) é uma cisteíno-protease essencial para a replicação viral. Ela hidrolisa ligações peptídicas em pelo menos 11 sítios conservados das poliproteínas precursoras pp1a e pp1ab para liberar os polipeptídios precursores das proteínas funcionais. Por meio da integração da triagem virtual baseada na estrutura do receptor (SBVS, Structure-Based Virtual Screening) com a triagem biológica automatizada em alta escala (HTS, High Throughput Screening), mais de 10.000 compostos, incluindo medicamentos aprovados, candidatos em ensaios clínicos e outros compostos
farmacologicamente ativos, foram avaliados contra a Mpro^ ( Jin et al., 2020 ). Seis inibidores foram identificados, com valores de IC 50 (concentração de inibidor para reduzir em 50% a atividade da enzima Mpro) variando entre 0,67 e 21,4 μM. São eles: ebselen (inflamação), tideglusib (doença de Alzheimer), carmofur e PX-12 (câncer), shikonina (inflamação) e dissulfiram (alcoolismo) (Figura 8). No entanto, apenas o ebselen apresentou atividade in vitro contra o Sars-CoV-2. Um outro estudo de triagem virtual, com cerca de 2.000 medicamentos aprovados, foi realizado para a identificação de inibidores da Mpro^ do Sars-CoV-2 ( Ghahremanpour et al., 2020 ). Dezessete compostos foram avaliados in vitro contra a enzima-alvo e os 5 mais promissores apresentaram valores de IC 50 entre 4,8 e 38,5 μM. São eles: manidipina (hipertensão), boceprevir (hepatite C), lercanidipina (hipertensão), bedaquilina (tuberculose) e efonidipina (hipertensão) (Figura 9). Outra cisteíno-protease estudada é a PLpro, uma protease relacionada à papaína. Esta enzima hidrolisa as poliproteínas precursoras pp1a e pp1ab em três sítios de clivagem para gerar proteínas virais funcionais. Além disso, a PLpro^ cliva modificações pós- traducionais em proteínas do hospedeiro e inibe as reações imunológicas mediadas por interferons, facilitando a evasão viral (Shin et al., 2020). Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR, Structure-Activity Relationships) de inibidores sintéticos da PLpro^ revelaram o potencial de benzamidas e isoindolinas (Figura 10) contra o Sars-CoV- (Welker et al., 2020). A RdRp, vital para os processos de replicação e transcrição do genoma do Sars-CoV-2, tem sido amplamente explorada para o desenvolvimento de fármacos. Ela é formada por duas subunidades acessórias (nsp7 e nsp8) e uma subunidade catalítica denominada nsp12 ( Hillen et al., 2020 ). Alguns inibidores da RdRp são o remdesivir, favipiravir, penciclovir e ribavirina
