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Um estudo sobre o cultivo de dois fungos, ganoderma stipitatum e ganoderma lucidum, em diferentes substratos agroindustriais, como bagaço de cana e casca de arroz. O objetivo é avaliar o crescimento micelial e a produção de enzimas em diferentes condições de cultivo, incluindo variações de temperatura, ph e fontes de nitrogênio. O estudo é relevante para a produção de compostos bioativos e enzimáticos a partir de resíduos agroindustriais, contribuindo para a sustentabilidade e a bioeconomia.
Tipologia: Teses (TCC)
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Reconhecida pela Portaria – MEC N.º 1580, de 09/11/93 – D.O.U. 10/11/ Mantenedora: Associação Paranaense de Ensino e Cultura – APEC Coordenadoria de Pós-Graduação - COPG Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Aplicada à Agricultura Eduardo Henrique Baltrusch de Gois Condições de cultivo de Ganoderma stipitatum e Ganoderma lucidum em resíduos agroindustriais e atividades enzimáticas da biomassa micelial Umuarama 2023
Eduardo Henrique Baltrusch de Gois Condições de cultivo de Ganoderma stipitatum e Ganoderma lucidum em resíduos agroindustriais e atividades enzimáticas da biomassa micelial Tese apresentada como parte das exigências para a obtenção do grau de doutor em Biotecnologia Aplicada à Agricultura pela Universidade Paranaense - UNIPAR. Orientadora: Profª. Drª. Juliana Silveira do Valle Coorientador: Prof. Dr. Nelson Barros Colauto Umuarama 2023
Condições de cultivo de Ganoderma stipitatum e Ganoderma lucidum em resíduos agroindustriais e atividades enzimáticas da biomassa micelial Tese aprovada como requisito obrigatório para obtenção do Grau de Doutor ou Mestre no Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade Paranaense – UNIPAR, pela seguinte banca examinadora: ____________________________________________ Dra. Cristiane Claudia Meinerz Universidade Paranaense ____________________________________________ Dra. Katielle Vieira Avelino Universidade Estadual de Maringá ____________________________________________ Dra. Maria Graciela Iecher Faria Universidade Paranaense ____________________________________________ Dra. Zilda Cristiani Gazim Universidade Paranaense ____________________________________________ Dra. Juliana Silveira do Valle Universidade Paranaense – UNIPAR Umuarama, abril de 2023
Agradeço a todas as pessoas a seguir por sua contribuição para a finalização desta tese:
Ganoderma lucidum e Ganoderma stipitatum em meio líquido com diferentes
9 Eduardo Henrique Baltrusch de Gois Cultivation conditions of Ganoderma stipitatum and Ganoderma lucidum in agro- industrial wastes and enzymatic activities of mycelial biomass ABSTRACT: The production of mycelium aims to obtain bioactive and enzymatic compounds. Therefore, it is necessary to identify the ideal conditions for biomass cultivation and its variations for each fungus. This thesis is divided into three chapters. Chapter I evaluated the growth of mycelial biomass (GMB) of Ganoderma stipitatum U15-4 and G. lucidum U17-2 strains when cultivated in a medium with different sources and concentrations of nitrogen (N) and at different pHs and temperatures. Soybean meal (SF) and urea were used as a source of N. The pH of the culture medium was adjusted between 2 and 12.5, with a variation of 0.5. The cultivation temperature was evaluated at 20 to 40 °C (varying by 5 °C). G. stipitatum and mainly G. lucidum demonstrate significant GMB in media with up to 18 g L-^1 of N from FS. For urea, GMB was significant up to 4 g L-^1 of N. Both fungi show potential for GMB production in media with an initial pH of 4.5 to 11.5. Temperature affected the GMB of both fungi. G. stipitatum showed higher GMB at 35 °C and G. lucidum at 20 and 25 °C. Once the best cultivation conditions were determined, Chapter II evaluated the GMB of the two strains in solid cultivation with different proportions of substrates (sugarcane bagasse, BC, and rice husks, CA) and the multienzyme production. Cultivation took place in borosilicate tubes for 15 days, and five treatments were evaluated: 100%BC; 100%CA; 75%BC+25%CA; 50%BC+50%CA, and 25%BC+75%CA. As for multienzyme production, cultivation took place in Erlenmeyer flasks for 13 days using the two best treatments for GMB (100%CA and 25%BC+75%CA). The activities of laccase, pectinase, xylanase, and cellulases (FPase and CMCase) were determined. The best GMB performance for both fungi occurred in the 100%CA substrate (10.26 and 8.90 cm), with a strong negative correlation between C/N ratio and growth. None of the strains produced cellulases, pectinase or xylanase during cultivation in the evaluated substrates. Only G. stipitatum produced laccase on both substrates (100%CA with 635±122 U g-^1 and 25%BC+75%CA with 774± 236 U g-^1 ). In Chapter III, the GMB and the multienzyme production of the two strains were evaluated in liquid medium with different concentrations of PS (2.0; 4.0; 6.0 and 8.0 g L-1) for 15 days, static and in the absence of light. At all FS concentrations, G. lucidum showed mycelial growth superior to G. stipitatum. However, G. stipitatum produced all enzymes in all evaluated treatments, with enzymatic activities superior to G. lucidum. The fungus G. stipitatum presents greater robustness in enzymatic production under the assessed conditions than G. lucidum. Keywords: Ganoderma spp ., sugarcane bagasse, rice husk, soybean meal, enzyme production.
10 CAPÍTULO I Cultivo axênico de Ganoderma lucidum e Ganoderma stipitatum em função de diferentes fontes e concentrações de nitrogênio, faixas de pH e de temperatura RESUMO: A fonte e a concentração de nitrogênio (N) orgânico ou inorgânico têm papel decisivo sobre o crescimento da biomassa micelial (CBM) e para colonização de diversos substratos por fungos basidiomicetos, e está aliada a outras condições como pH e temperatura. G. lucidum é utilizado na medicina tradicional chinesa há milhares de anos, além da aplicabilidade medicinal, tem importância nutricional e biotecnológica. Entretanto, G. stipitatum ainda não possui usos comerciais conhecidos e há poucos estudos sobre a produção enzimática ou das condições de cultivo. O objetivo deste estudo foi avaliar o CBM de G. stipitatum e G. lucidum em diferentes fontes e concentrações de N, e diferentes valores de pH e temperatura. Foram utilizadas as linhagens U15-4 ( G. stipitatum ) e U17-2 ( G. lucidum ). A influência da concentração de N foi avaliada em nove concentrações de N variando de 0 a 8,0 g L-^1 , em triplicata. O Farelo de soja e ureia foram usados como fonte de N em meio de cultivo ágar-extrato de malte (MEA, 0 g L-^1 ) e pH 5,5. A influência do pH do meio de cultivo foi avaliada na faixa entre 2 e 12,5, com variação de 0,5, em meio MEA (20 g L-^1 ). A temperatura de cultivo foi avaliada em cinco condições de temperatura variando de 20 a 40 °C (a cada 5 °C), em quatro repetições, em meio MEA (20 g L-^1 ) e pH 5,5. As médias aritméticas e desvios padrões foram calculados pelo Software Sisvar 5.6 e aplicado Teste de Scott-Knott p≤0,05. G. stipitatum e principalmente G. lucidum demonstram significativo crescimento micelial em meios com até 18 g L-^1 de nitrogênio a partir de farelo de soja. Com ureia o crescimento foi significativo até 4 g L-^1 de nitrogênio. Ambos os fungos demonstram potencial para produção de biomassa micelial em meios com pH inicial de 4,5 até 11,5. As temperaturas avaliadas afetaram o crescimento micelial de ambos os cogumelos. G. stipitatum apresentou maior crescimento micelial a 35 °C e G. lucidum em 20 e 25 °C. Palavras-chave: Basidiomicetos, Ganoderma spp., farelo de soja, crescimento micelial, pH, temperatura.
12 fúngico é essencial não somente para produzir os produtos almejados, mas também para a produção de medicamentos e nutracêuticos à base de desse fungo, com potencial para atingir padrões de qualidade e segurança elevados (WASSER; WEIS, 1999; ELISASHVILI, 2012). As condições de crescimento de G. lucidum tem um conjunto único de requisitos em fatores nutricionais e parâmetros de crescimento. Os fatores nutricionais, como fontes de carbono e nitrogênio, temperatura, umidade relativa, luz, entre outros, formam a base para o cultivo artificial desse fungo (ZHOU, 2017). Dessa maneira, conhecer as melhores condições de cultivos da linhagem U17- 2 ( G. lucidum ) e da linhagem U15-4 ( G. stipitatum ) é necessário para o futuro cultivo comercial dessas linhagens, uma vez que não possuem estudos específicos com essas linhagens. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o crescimento da biomassa micelial de G. stipitatum e G. lucidum ao serem submetidos a diferentes fontes e concentrações de nitrogênio, e diferentes valores de pH e temperatura.
13 MATERIAL E MÉTODOS Material biológico Ganoderma stipitatum (linhagem U15-4) e Ganoderma lucidum (linhagem U17-
15 RESULTADOS Ganoderma stipitatum e G. lucidum cresceram de forma diferenciada em todas as temperaturas avaliadas. Conforme a Tabela 1, G. stipitatum obteve maior crescimento micelial na temperatura de 35°C (8,9 ± 0,1 cm), diferentemente de G. lucidum que atingiu melhor crescimento nas temperaturas de 20 e 25°C (8,9 ± 0,1 cm e 9,0 ± 0,0 cm), respectivamente. Tabela 1. Crescimento da biomassa micelial de G. stipitatum e G. lucidum , cultivados por sete dias em meio MEA (20 g L-^1 ) em diferentes temperaturas. Temperatura (oC) Crescimento micelial (cm) G. lucidum G. stipitatum 20 8,9 ± 0,1a 4,2 ± 0,4d 25 9,0 ± 0,0a 7,2 ± 0,2b 30 8,7 ± 0,2a 5,8 ± 0,2c 35 1,0 ± 0,1e 8,9 ± 0,1a 40 0,0 ± 0,0f 0,1 ± 0,0f *As médias aritméticas e os desvios padrões foram calculados pelo Software Sisvar 5.6, com aplicação de ANOVA seguido pelo teste de Scott Knott com p≤0,05. Ambos os fungos não toleram temperaturas na faixa de 40°C. Considerando a faixa de temperatura de 20 a 30 °C, G. lucidum apresenta robustez e uniformidade no crescimento micelial, quando comparado com G. stipitatum. Entretanto, G. stipitatum obteve maior robustez no crescimento micelial em temperatura elevada (35°C). O pH inicial do meio de cultivo afetou o crescimento micelial de ambos os fungos. De forma geral, observa-se que em faixas extremas de acidez o crescimento micelial foi reduzido, pois em pH 2,5 o crescimento foi de 2,1 ± 0,4 cm e de 2,7 ± 0, cm para G. lucidum e G. stipitatum , respectivamente (Tabela 2).
16 Tabela 2. Crescimento micelial de G. lucidum (U17-2) e G. stipitatum (U15-4) cultivado por sete dias a 25 ± 1°C sobre meio ágar extrato de malte (20 g L-^1 ) com diferentes valores iniciais de pH ajustado com HCl (0,5 mol L-^1 ) ou NaOH (0,5 mol L- (^1) ). pH Crescimento micelial (cm) G. lucidum G. stipitatum 2,0 0,0 ± 0,0h 0,0 ± 0,0h 2,5 2,1 ± 0,4g 2,7 ± 0,2f 3,0 7,0 ± 0,2c 3,0 ± 0,2f 3,5 8,4 ± 0,3a 3,7 ± 0,5e 4,0 8,8 ± 0,3a 7,7 ± 0,3b 4,5 8,5 ± 0,2a 8,1 ± 0,4b 5,0 8,4 ± 0,1a 8,2 ± 0,1b 5,5 8,6 ± 0,1a 8,1 ± 0,2b 6,0 8,5 ± 0,2a 7,9 ± 0,4b 6,5 8,5 ± 0,1a 7,8 ± 0,4b 7,0 8,7 ± 0,1a 8,0 ± 0,2b 7,5 8,6 ± 0,4a 8,1 ± 0,1b 8,0 8,4 ± 0,1a 8,1 ± 0,3b 8,5 8,4 ± 0,1a 8,1 ± 0,2b 9,0 8,8 ± 0,3a 8,2 ± 0,4b 9,5 8,5 ± 0,1a 8,4 ± 0,3a 10,0 8,4 ± 0,1a 8,3 ± 0,5b 10,5 8,3 ± 0,1a 8,0 ± 0,4b 11,0 8,4 ± 0,1a 8,0 ± 0,5b 11,5 8,1 ± 0,2b 7,9 ± 0,1b 12,0 6,8 ± 0,2c 6,2 ± 0,3d 12,5 0,0 ± 0,0h 0,0 ± 0,0h *As médias aritméticas e os desvios padrões foram calculados pelo Software Sisvar 5.6, com aplicação de ANOVA seguido pelo teste de Scott Knott com p≤0,05. No entanto, o crescimento foi maior em uma ampla faixa de pHs que abrange desde a acidez até pHs alcalinos extremos. G. lucidum e G. stipitatum apresentaram
18 Tabela 3. Crescimento micelial de G. lucidum (U17-2) e G. stipitatum (U15-4) cultivados a 25 ± 1 °C em meio MEA (20 g L-^1 ) e pH 5,5 contendo diferentes concentrações de farelo de soja e ureia. Concentração (g L-^1 ) Crescimento micelial (cm) G. lucidum G. stipitatum Farelo de soja Ureia Farelo de soja Ureia 0,5 8,18 ± 0,16bA^ 7,89 ± 0,13cB^ 7,70 ± 0,11bC^ 7,42 ± 0,32bD 1 ,0 8,42 ± 0,27aB^ 7,77 ± 0,10cC^ 8,58 ± 0,08aA^ 7,82 ± 0,10bC 2,0 8,19 ± 0,19bB^ 7,86 ± 0,12cC^ 8,68 ± 0,17aA^ 7,73 ± 0,24bC 3,0 8,57 ± 0,18aA^ 7,76 ± 0,23cC^ 8,44 ± 0,20aB^ 7,17 ± 0,21bD 4,0 8,36 ± 0,19aA^ 7,58 ± 0,22dB^ 8,26 ± 0,27aA^ 7,41 ± 0,16bB 6,0 8,40 ± 0, 13 aA^ 7,09 ± 0,15eB^ 8,56 ± 0,17aA^ 6,99 ± 0,19cB 7,0 8,32 ± 0,07bB^ 6,79 ± 0,19fC^ 8,64 ± 0,10aA^ 6,44 ± 0,32dD 8,0 8,49 ± 0,23aA^ 5,99 ± 0,12hB^ 8,57 ± 0,09aA^ 5,52 ± 0,21eC 10,0 8,53 ± 0,09aA^ 6,55 ± 0,15gC^ 7,51 ± 0,30bB^ 4,10 ± 0,24fD 12,0 8,50 ± 0,10aA^ 5,31 ± 0,15iB^ 7,58 ± 0,19bB^ 3,20 ± 0,44gC 14,0 8,37 ± 0,10aA^ 5,28 ± 0,16jC^ 7,83 ± 0,15bB^ 2,70 ± 0,35iD 16,0 8,39 ± 0,11aA^ 4,16 ± 0,13kC^ 7,67 ± 0,31bB^ 3,03 ± 0,08hD 18,0 8,17 ± 0,12bA^ 3,63 ± 0,14lC^ 6,52 ± 0,54dB^ 2,61 ± 0,49iD *As médias aritméticas e os desvios padrões foram calculados pelo Software Sisvar 5.6, com aplicação de ANOVA seguido pelo teste de Scott Knott com p≤0,05. Letras diferentes indicam diferença estatística. Letras minúsculas na mesma coluna comparam o crescimento nas concentrações da fonte de nitrogênio. Letras maiúsculas na mesma linha comparam o crescimento das linhagens em diferentes fontes de nitrogênio. Ganoderma lucidum e G. stipitatum apresentaram crescimento micelial diferente utilizando a mesma fonte de nitrogênio (ureia). O G. stipitatum obteve menor crescimento do que o G. lucidum para as concentrações de 12, 14, 16 e 18 g L-^1 de ureia. G. lucidum apresentou crescimento micelial maior nas concentrações de 0,5 a 10,0 g L-^1 e sofreu redução quando adicionados ao meio de cultivo com 12, 14, 16 e 18 g L-^1. G.
19 stipitatum obteve maior crescimento entre 0,5 e 8,0 g L-^1 , com redução a partir de 10 até 18g L-^1. Tais resultados sugerem para ambos os fungos, um potencial de crescimento micelial em uma ampla faixa de concentrações de ureia (Tabela 3). G. lucidum e G. stipitatum obteviveram crescimento micelial distintos utilizando diferentes fontes de nitrogênio (farelo de soja e ureia). Ambos os basidiomicetos apresentaram crescimento micelial estável com farelo de soja em todas as concentrações. Já para o crescimento em ureia houve uma redução crescente do crescimento micelial, o que indica que os dois fungos possuem maior afinidade pela fonte protéica (farelo de soja) do que pela aproteica (ureia) (Tabela 3). G. stipitatum apresentou crescimento micelial maior com farelo de soja em todas as concentrações avaliadas (0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 7,0; 8,0; 10,0; 12,0; 14,0; 16,0 e 18,0g L-^1 ). Logo, G. stipitatum demonstrou maior robustez no crescimento micelial utilizando o farelo de soja como fonte de nitrogênio (Tabela 3).
