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Uma visão geral sobre a citometria de fluxo, uma técnica analítica poderosa utilizada em diversas áreas da biologia e medicina. Ele aborda os principais conceitos, a evolução histórica, os componentes básicos de um citômetro de fluxo, as aplicações em diferentes campos como imunologia, virologia e apoptose, bem como os protocolos para preparação de amostras de sangue total e células mononucleares do sangue periférico. Com uma descrição detalhada e exemplos ilustrativos, este documento é uma referência valiosa para estudantes, pesquisadores e profissionais da área de ciências biológicas e da saúde que desejam compreender e aplicar a citometria de fluxo em suas pesquisas e práticas.
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
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“A persistência é o caminho do êxito.” Charles Chaplin
ÁLVARO LUIZ BERTHO DOS SANTOS: Bacharel em Biomedicina formado pela Universidade do Rio de Janeiro UNI-RIO (1984). Doutor em Ciências, área de concentração: Imunoparasitologia. Pesquisador Titular e Chefe Substituto no Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ e Professor Adjunto de Imunologia Clínica na Universidade Severino Sombra, Vassouras, RJ. Coordena a Plataforma Multiusuários de Citometria de Fluxo do Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz - Núcleo de Análise e Separação de Células ( Sorting ). Consultor Científico no Setor de Imunologia do Laboratório Dr. Sérgio Franco (1996 a 2003). Expertise na área de Imunologia e Imunogenética, com ênfase em Imunologia Celular e Clínica, atuando principalmente nos seguintes temas: citometria de fluxo, apoptose, imunoparasitologia, e nas leishmanioses. Primeiro Citometrista de Fluxo no Brasil.
O estudo das doenças infecto-parasitárias é realizado a partir da utilização de uma diversidade de técnicas que viabilizam o entendimento da biologia dos parasitas, suas interações com o hospedeiro e a resposta do hospedeiro no decorrer das infecções. Embora os cursos de graduação abordem amplamente os aspectos teóricos envolvidos no estudo de tais doenças, os aspectos práticos relacionados à forma de obtenção deste conhecimento não são devidamente explorados. Essa apostila tem como objetivo apresentar a aplicabilidade da técnica de citometria de fluxo no estudo das doenças infecto-parasitárias, buscando despertar no aluno de graduação novas idéias que possam ser abordadas em estudos posteriores para ampliar essa área do conhecimento. Inicialmente fazemos uma pequena revisão sobre os mecanismos de resposta imune às doenças infecto-parasitárias, abordando os principais aspectos da imunidade inata e adaptativa e a aplicabilidade da citometria no âmbito dessas respostas. Posteriormente, um breve histórico, sobre a citometria de fluxo e os princípios básicos da técnica, é apresentado. Descrevemos também as principais aplicações dessa técnica nos estudos relacionados à morte celular por apoptose e nos estudos na área de protozoologia e virologia, apresentando em seguida conceitos e princípios básicos e a aplicabilidade da técnica de Sorting , assim como alguns protocolos para citometria de fluxo. Finalizando a apostila, propomos um ensaio prático em imunofenotipagem e apoptose, enfatizando aspectos relacionados à aquisição de amostras e à análise e interpretação dos dados obtidos nos ensaios.
Os autores Rio de Janeiro 2010
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Figura 1.1. Perfil de expressão dos antígenos CD´s durante a hematopoise. Ao longo do processo de maturação ediferenciação, as células expressam diferentes moléculas de superfície.
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As células e moléculas responsáveis pela imunidade formam o Sistema Imunológico, e sua resposta coletiva e coordenada à introdução de substâncias estranhas é chamada de resposta imunológica. A função fisiológica do sistema imune é a defesa contra microorganismos infecciosos ou substâncias estranhas. A imunidade protetora contra microorganismos é mediada pelas reações iniciais da Imunidade Inata e pelas respostas posteriores da Imunidade adquirida.
1.2. Imunidade Inata
As doenças infecciosas ocorrem quando um microorganismo é capaz de evadir a defesa inata do hospedeiro com sucesso para estabelecer um sítio de infecção e replicação que permita sua transmissão. A imunidade inata é muitas vezes comparada à linha de frente de defesa do hospedeiro. Ela é composta por barreiras naturais, como superfícies epiteliais, células imunes e moléculas solúveis que existem independentemente do estabelecimento de uma infecção. Quando um microorganismo atravessa a barreira epitelial, entra nos tecidos e começa a se replicar, ou cai na circulação, na maioria dos casos ele é imediatamente reconhecido por células residentes nos tecidos ou no sangue (Figura 1.2). Proteínas do sistema complemento extravasam para os tecidos infectados, são ativadas e ligam-se a superfície dos patógenos levando-os à lise. Essas proteínas também “marcam” os patógenos para serem reconhecidos por receptores para complemento em fagócitos profissionais (opsonização). Ao reconhecer microorganismos opsonizados os fagócitos promovem a sua destruição. Algumas proteínas do complemento também conectam a imunidade inata à adaptativa. Os macrófagos, assim como os neutrófilos, são células cuja função primária é identificar, ingerir e destruir microorganismos. Os macrófagos estão estrategicamente posicionados nos locais de entrada dos microorganismos no hospedeiro. O estímulo para a sua ativação vem do reconhecimento de antígenos através de receptores (receptores do tipo Toll ) e de moléculas secretadas por outras células da imunidade inata, como as células Natural Killer (NK). Além de fagocitar e destruir o parasito endocitado, os macrófagos também apresentam peptídeos desse patógeno para os linfócitos T CD4+^ através de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II, expressas em sua superfície. Assim como nas células dendríticas, essa apresentação é importante para a indução de respostas efetoras mais específicas do macrófago, como produção de substâncias microbicidas e
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As células NK , que reconhecem células infectadas que perderam a expressão de moléculas do MHC de classe I, produzem citocinas que também ativam fagócitos. Suas funções efetoras promovem a destruição de células infectadas através de substâncias que induzem a morte celular.
1.3. Imunidade Adaptativa, Adquirida ou Específica
Quando os microorganismos desenvolvem maneiras de burlar os mecanismos protetores da imunidade inata, tornam-se necessários mecanismos de defesa mais específicos para conter a infecção. Além da imunidade inata ou natural, que atua de forma inespecífica sobre diferentes microorganismos, o sistema imunológico possui também a imunidade adaptativa, adquirida ou específica, que se baseia no reconhecimento específico de substâncias estranhas associadas ou não a superfícies celulares. Ao contrário da imunidade natural, cuja resposta se desenvolve de maneira imediata, a imunidade adquirida é responsável por mecanismos específicos que demoram alguns dias para se estabelecer. A resposta imune adquirida é formada por linfócitos e anticorpos, que são altamente específicos. As substâncias estranhas que induzem e são o alvo das respostas específicas são chamadas antígenos. O termo imunidade adaptativa deve-se ao fato de que os mecanismos de defesa, desenvolvidos em resposta a um agente infeccioso, aumentam em magnitude e capacidade defensiva em cada exposição sucessiva, adaptando-se a essa infecção. A imunidade adaptativa apresenta também grande especificidade, podendo distinguir entre os diferentes microrganismos e moléculas, sendo também chamada de imunidade específica. A imunidade específica pode ser desencadeada através da imunidade ativa ou através da imunidade passiva. Quando a resposta a um determinado microorganismo ocorre como reação a um antígeno, sendo produzida pelo próprio indivíduo, ela é chamada de imunidade ativa. Quando a imunidade a um antígeno é conferida pela transferência de anticorpos ou células de um indivíduo imunizado para um receptor que se tornará resistente a determinado antígeno mesmo sem ter sido exposto a ele, ela é chamada de imunidade passiva. Os linfócitos são as principais células da resposta imune adquirida, sendo os responsáveis por sua especificidade, uma vez que reconhecem até sutis diferenças entre os variados tipos antígenos. Quando os receptores de superfície para antígenos são expressos, durante a maturação, eles se tornam responsivos à estimulação antigênica e se desenvolvem
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em diferentes classes funcionais. Existem dois tipos de respostas imunes adquiridas, a imunidade celular e a imunidade humoral, que possuem componentes imunológicos distintos.
1.3.1. Características da Imunidade Adaptativa
A imunidade adquirida apresenta características fundamentais que a difere da imunidade natural. A resposta imune adquirida apresenta alta especificidade a um determinado antígeno ou até mesmo a determinadas porções deste antígeno. As porções reconhecidas especificamente pelos linfócitos são chamadas de determinantes ou epítopos. Essa especificidade deve-se aos receptores presentes na membrana dos linfócitos, que são capazes de reconhecer diferenças mínimas na estrutura dos antígenos. O sistema imunológico é capaz de reconhecer milhares de antígenos diferentes devido a enorme diversidade do seu repertório linfocitário. A resposta imune adquirida apresenta também a capacidade de memória. Quando o sistema é submetido a um determinado patógeno, as células utilizadas em sua eliminação permanecem viáveis por longos períodos, podendo reagir novamente, de forma mais rápida e eficiente, no caso de uma segunda infecção com o mesmo patógeno. A imunidade adquirida é autolimitante. Uma vez eliminado o antígeno que disparou o processo imune, as respostas imunológicas tendem a cessar, de forma que o organismo retorne ao seu estado basal, num processo chamado de homeostasia (Figura 1.3). O sistema imunológico é também caracterizado por sua tolerância a antígenos próprios. Embora seja capaz de reconhecer e eliminar antígenos estranhos, o sistema imunológico apresenta mecanismos de controle que inibem respostas contra antígenos do próprio hospedeiro, prevenindo assim a ocorrência de doenças auto-imunes.
Figura 1.3. A resposta imunesenta alta especificidade adquirida apre- (antígenosinduzem a produção de A e B diferentes anticorpos), memóriasecundária (aao (^) antígenoresposta A é mais rápida e maior que a resposta primária)e altolimitação (os níveis de anticorpos declinam ao longo do tempo).
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Figura 1.5. Diferenciação das células TCD4+^ frente à exposição ao antígeno. As células TCD4+ podem se diferenciar em subpopulações distintas, principalmente Th1 e Th2 em resposta ao antígeno, aos co-estimuladores e às citocinas.
Ambas as respostas, Th1 e Th2, são importantes na defesa do hospedeiro contra infecções. A resposta Th1 está relacionada com a defesa contra protozoários, bactérias intracelulares e vírus, enquanto a resposta Th2 é mais efetiva contra helmintos e bactérias extracelulares. Os linfócitos Th1 secretam principalmente Fator de necrose Tumoral (TNF), Interleucina-2 (IL-2) e Interferon-gama (IFN-γ). O IFN-γ age nos macrófagos para aumentar a fagocitose e a destruição de microorganismos fagocitados. Nos linfócitos B, o IFN-γ estimula a produção de Imunoglobulinas G (IgG) que opsonizam microorganismos para a fagocitose, importante ativador de macrófagos. O TNF é importante para a ativação dos neutrófilos e conseqüentemente para a estimulação do processo inflamatório. Os linfócitos Th2, por sua vez, produzem principalmente IL-4, IL5, IL10 e IL-13, perfil de citocinas que estimula a diferenciação de linfócitos B em plasmócitos, direcionando para a imunidade humoral (dependente de anticorpos). A IL-4 estimula a produção de IgE, que se liga a mastócitos. A IL-5 ativa os eosinófilos, resposta importante na defesa contra infecções helmínticas. Essas respostas são antagônicas, uma vez que o IFN-γ modula negativamente a resposta Th2, e a IL- 4e a IL-10 modulam negativamente a resposta Th1, possibilitando uma resposta imune balanceada (Figura 1.6).
IMPORTANTE : A identificação das diferentes subpopulações de linfócitos T foi possível somente após a descoberta de que essas células apresentam proteínas de membrana distintas em suas superfícies. Essas proteínas constituem os marcadores fenotípicos das diferentes subpopulações linfocitárias, sendo chamadas de CDs. Os CDs são moléculas que podem ser reconhecida por anticorpos monoclonais. A identificação dos diferentes tipos de linfócitos pode ser feita por citometria de fluxo de acordo com os seus marcadores de superfície.
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Figura 1.6. Funções efetoras das células Th1 e Th2. As células Th1 e Th2 produzem diferentes tipos de citocinas, que ativam diferentes vias de resposta imune. A resposta produzida por Th1 é mais efetiva no combate à microorganismosintracelulares, enquanto a resposta produzida por Th2 é eficaz no combate de patógenos extracelulares.
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Estruturalmente as moléculas de anticorpo possuem um formato em Y e são compostas por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas por pontes dissulfeto. Cada cadeia de imunoglobulina, tanto a leve quanto a pesada, é formada a partir de segmentos gênicos que se rearranjam em uma seqüência específica para constituir a cadeia completa, formando as regiões variável e constante das mesmas. Os braços da imunoglobulina são compostos pelas cadeias leves e pela região variável das cadeias pesadas (porção Fab). A região variável tanto da cadela leve quanto da pesada participa no reconhecimento dos antígenos – especificidade. Nas cadeias pesadas, as porções constantes interagem com outras moléculas efetoras e células do sistema imune, participando assim como mediadora da maioria das funções biológicas dos anticorpos (região Fc). Existem cinco tipos diferentes de cadeias pesadas que formam região Fc da imunoglobulina e que definem as classes ou isotipos IgA, IgG, IgD, IgE e IgM. As funções efetoras das imunoglobulinas são mediadas por esta região da molécula. Cada classe de anticorpo desempenha uma função efetora distinta na imunidade à diferentes patógenos (Figura 1.8).
Região Fab
Região Fc
Cadeias leves Cadeias pesadas Região de ligação deantígenos Região Fab
Região Fc
Cadeias leves Cadeias pesadas Região de ligação deantígenos
Figura 1.8. Estrutura de uma molécula de anticorpo. A imunoglobulina apresenta uma região variável de cadeia leve epesada (Região Fab) que atua no reconhecimento dos antígenos. As porções constantes da cadeia pesada (Região Fc) interagem com células efetoras do sistema imune, mediando diferentes funções biológicas dos anticorpos.
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IMPORTANTE : As IgGs são imunoglobulinas capazes de desempenhar todas as funções conferidas aos anticorpos. É a mais abundante no soro e está igualmente distribuída nos compartimentos extracelulares, além de ser a única que normalmente atravessa a placenta. A IgG é a principal imunoglobulina produzida nas respostas humorais secundárias à patógenos. Além disso, as moléculas de IgG, tem uma alta afinidade para neutralizar partículas virais. Todas as características citadas acima tornam a IgG o anticorpo mais explorado em estudos de imunofenotipagem aplicados a citometria de fluxo.
1.4. Produção de Anticorpos Monoclonais
A produção e caracterização de anticorpos foram radicalmente alteradas em 1975 quando Köhler & Milstein descreveram a técnica de produção de anticorpos monoclonais utilizando a fusão de linhagens de células de carcinoma e de linfócitos B revolucionando a utilização de anticorpos em metodologias como imunofluorescência, hibridização in situ e citometria de fluxo. Essa técnica foi denominada hibridoma. Os anticorpos que reconhecem apenas um único antígeno são denominados de monoclonais. Eles são produzidos e secretados por um único clone de linfócitos B antígeno- reativos. Alguns anticorpos podem reconhecer diferentes antígenos e, portanto ser produzidos a partir de clones distintos. Esses anticorpos são chamados policlonais. Ambos os anticorpos, monoclonais e policlonais, presentes no soro podem ser utilizados em ensaios de imunofenotipagem. Os anticorpos monoclonais são quimicamente idênticos. Eles têm a vantagem de possuir uma alta especificidade e afinidade ao antígeno. Os anticorpos monoclonais são os mais usados em pesquisa, em diagnóstico clínico e terapia. Para a produção de anticorpos monoclonais comercialmente, utilizam-se ensaios de cultura de hibridomas formados por linfócitos B antígeno-específicos e células obtidas de tumores. Nesse estudo camundongos são desafiados com um antígeno X. As células esplênicas secretoras de anticorpos (células B antígeno específicas) são adquiridas do baço desses animais e cultivadas em meio HAT com um inibidor que bloqueia vias normais de biossíntese de nucleotídeos. Dessa forma, as células normais utilizam uma via alternativa para sintetizar seus ácidos nucléicos. Essa via é defectiva em linhagens de células tumorais que, portanto morrem em cultura com meio HAT. Para se produzir uma fonte contínua de anticorpos as células normais esplênicas são fundidas com células de mieloma, gerando híbridos, e cultivadas in vitro em microplacas. As células híbridas passam a expressar o gene envolvido com essa via alternativa de produção de aminoácidos e, portanto, apenas as células
