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CAPÍTULO 1 Técnicas e análises de biologia molecular
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
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Compartilhado em 23/08/2019
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1 ALESSANDRA NEJAR BRUNO
Reagente I (detergente) Reagente II (sal de cozinha) Água destilada Álcool etílico (92%) gelado Faca Placa de Petri Proveta Tubos Falcon (50 mL) Funil Papel filtro Bastão de vidro Banho-maria Freezer
Material (reagentes, vidrarias e equipamentos): Morango Aula prática de extração de DNA - 1
2 BIOTECNOLOGIA II
Misturar, em um tubo falcon, 8 mL do reagente I e 8 g do reagente II, completando com água destilada até 40 mL. Aqueça a solução em banho-maria a 60°C. Picar com a faca, em uma placa de Petri, um morango em pedaços pequenos. Adicionar a amostra (morango) na solução aquecida. Aquecer a solução por 10 minutos em banho-maria a 60°C. Resfriar rapidamente a mistura colocando o frasco no freezer por aproximadamente 15 minutos (precipitação do DNA). Coar a mistura com um papel filtro, recuperando o filtrado em outro tubo falcon. Adicionar álcool etílico gelado ao filtrado, deixando o etanol escorrer pela parede do vidro. Observar a formação de fios esbranquiçados. Estes fios correspondem aos ácidos nucléicos, DNA e RNA (e açúcar). Luvas de látex Banho-maria Microcentrífuga Micropipetas Microtubos autoclavados Ponteiras para micropipetas autoclavadas Swab ou cotonete Solução tampão de extração/lise Solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1; v/v) Álcool etílico 70% Álcool etílico absoluto (a -20°C, ou isopropanol, soluções acetatos de sódio ou amônio) Solução tampão TE (Tris e EDTA) Papel toalha Aula prática de extração de DNA - 2
Material:
4 BIOTECNOLOGIA II
Luvas de látex Material vegetal Balança analítica Banho-maria Microcentrífuga Micropipetas Microtubos autoclavados Ponteiras para micropipetas autoclavadas Solução tampão de extração/lise CTAB Solução de ß-mercaptoetanol Solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) Álcool etílico absoluto (a -20°C (ou isopropanol ou soluções acetatos de sódio ou amônio) Álcool etílico 70% Solução tampão TE (Tris e EDTA) Papel toalha Aula prática de extração de DNA - 3
Material:
Adicionar 500 mL de solução tampão CTAB e 5 mL ß-mercaptoetanol (1% de volume do tampão, p.ex. 10 mL em 1 mL) em um microtubo de 2 mL e aquecer em banho-maria a 60-65°C. Pesar 100 mg de material vegetal, de preferência fresco, e transferir ao microtubo com tampão de extração pré-aquecido. Macerar o material com auxílio de um bastão de vidro. Fechar o microtubo e misturar bem o material macerado com a solução tampão. Incubar as amostras em banho-maria, a 60-65°C, por 15 minutos, agitando ocasionalmente o microtubo para manter o material vegetal ressuspendido. Retirar o microtubo do banho-maria e esperar que a mistura atinja a temperatura ambiente. Adicionar 350 mL de solução de clorofórmio:álcool isoamílico. Fechar o microtubo e misturar manualmente por inversão. Centrifugar a 13.000 rpm, por cerca de 7 minutos, a temperatura ambiente, para separar a fase orgânica da aquosa.
5 ALESSANDRA NEJAR BRUNO
Remover a fase aquosa (fase superior) para um microtubo novo, previamente identificado, com auxílio de uma micropipeta. Evitar pegar resíduos da fase orgânica e interface. Repetir a etapa com clorofórmio:álcool isoamílico mais uma ou duas vezes, levando em consideração que as repetições podem tornar a amostra mais pura, porém com maiores perdas de DNA. Adicionar RNase a uma concentração final de 100 mg/mL e incubar a 37°C por 30 minutos. Essa etapa é opcional e contribui para aumentar a pureza da sua amostra (remoção RNA). Adicionar 500 mL álcool etílico absoluto ou 150 mL de isopropanol, ambos a -20°C. Misturar suavemente até visualizar o DNA. Centrifugar a amostra a 13.000 rpm, por cerca de 7 minutos. Descartar o sobrenadante, vertendo-o por inclinação do microtubo (cuidado para não perder o DNA). Caso o precipitado se solte, repita a centrifugação por 5 minutos. Lavar o DNA (o DNA não deve estar escuro em uma boa preparação) com 300 mL de álcool etílico 70%, por 5 a 10 minutos, e após centrifugar a amostra por cerca de 7 minutos, a 13. rpm. Caso o precipitado se solte, repita a etapa da centrifugação por 5 minutos. Descartar o sobrenadante, vertendo- por inclinação do microtubo (cuidado para não perder o DNA).
10 11 12 13 14 15 Deixar os microtubos abertos com as amostras de DNA para que o etanol evapore, por 24 h a temperatura ambiente ou por 24 h a temperatura ambiente ou por 1 hora em estufa a 37°C. Após a total evaporação do álcool, ressuspender o DNA em 50 ml de tampão TE e deixar a 4°C por 24 h. A amostra pode ser então armazenada a - - 20°C.(freezer) até seu uso. 16 17 Associe as soluções de 1 a 5 a suas respectivas funções nas extrações de DNA. Resposta: (5); (3); (2); (1); (4); Calcule a quantidade de DNA extraído e o índice de pureza das amostras 1 e 2 analisa das por espectrofotometria. Qual amostra apresenta maior quantidade e qualidade de DNA? Resposta: Amostra 1: Concentração do DNA: 190 ng/μL; Pureza: 1, Amostra 2: Concentração de DNA: 325 ng/μL Pureza: 1, Melhor: amostra 2 AGORA É A SUA VEZ
7 ALESSANDRA NEJAR BRUNO
Fazer o mesmo procedimento para cada amostra de DNA extraído ou PCR. Tampar a cuba de eletroforese e ligar a corrente elétrica. Observar a posição dos polos. O eletrodo negativo deve ser o mais perto das amostras, pois os ácidos nucléicos por terem carga negativa migram em direção ao polo positivo. Obs. Não é possível ver os fragmentos de DNA migrando por serem incolores, mas estima-se a migração das amostras pelo corante azul de bromofenol do tampão de amostra. Após cerca de ___ minutos de migração (o tempo depende da amperagem liberada pela fonte, tamanho da cuba, concentração do gel e tamanho dos fragmentos de DNA), desligar a corrente elétrica. Retirar o gel da cuba e colocar sob o transiluminador de luz UV para a visualização dos fragmentos de DNA (bandas).
10 11 12 13 Nos dois alelos (a) e (b) representados abaixo, indique o local de anelamento dos primers 5’-GCCTCT-3’ e 3’-GGATCC-5’ e os tamanhos dos fragmentos amplificados por PCR, em pares de base (pb). Resposta: Local de anelamento marcados: (a) ....5’- AGGCCTCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTCCTAGGTTCGAT -3’.......... ....3’- TCCGGAGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGAGGATCCAAGCTA -5’.......... Tamanho dos fragmentos: 44 pb (b) ....5’- AGGCCTCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTCCTAGGTTCGAT -3’.... ....3’- TCCGGAGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGAGGATCCAAGC- TA -5’.... Tamanho dos fragmentos: 56 pb AGORA É A SUA VEZ Leia sobre sequenciamento de DNA no artigo “Sequenciamento de DNA: decifrando o manual de instruções dos seres vivos” de André Luis Fachini de Souza1, Liziane Cristina Campos Brusamarello acessandohttp://media.wix.com/ugd b703be_836b6eacd07540a2b8ed918cf7d64d2a.pdf Para obter mais informações sobre o Projeto Genoma Humano leia os dois artigos disponíveis em:
8 BIOTECNOLOGIA II
As variações genéticas podem ter impactos diretos na vida das pessoas. Pelo estudo dos genes que afetam a saúde dos indivíduos é possível buscar o diagnóstico precoce de doenças, tratamentos adequados e a melhoria da qualidade de vida da população. Além disso, estes podem ser utilizados na avaliação pré-natal, no aconselhamento genético de casais, e no teste do pezinho. Um exemplo interessante está descrito no artigo “O gene da intolerância à lactose” de Renata Palacios e Marcos Edgar Herkenhoff, disponível em: http://media.wix.com/ugd/ b703be_4cfdcc3e914e427c918ff768bdf3ac1a.pdf O desenvolvimento de testes de diagnóstico genético-molecular tem tido impacto direto na medicina, possibilitando a identificação dos genótipos dos indivíduos para diversas mutações. Enquanto a detecção de algumas alterações permite o diagnóstico correto de doenças genéticas, outras são caracterizadas apenas como fatores de risco para doenças complexas. O artigo abaixo discute as consequências destes testes sobre os pacientes e na sociedade: http://blog.newtonpaiva.br/pos/wp-content/uploads/2013/04/PDF-E6-FARM21.pdf
10 BIOTECNOLOGIA II
1.1. Link para texto sobre células-tronco 1.2. Link para mais informações sobre oncogenes 1.1. Link para texto sobre cultivo celular Acesse o site http://www.ghente.org/ para encontrar informações atuais e contextualizadas sobre assuntos como células-tronco, terapia gênica, farmacogenética, nanobiotecnologia e patentes biotecnológicas http://www.infoescola.com/genetica/oncogenes/ http://www.laben.ufscar.br/metodos-utilizados/cultura-celular (disponível em 16/09/2013) É possível observar rapidamente se uma cultura está confluente pela cor do meio no interior da garrafa de cultivo? Resposta: Sim. Com o crescimento das células, os nutrientes do meio de cultura vão sendo consumidos e os produtos do metabolismo dessas células são liberados no meio, reduzindo o seu pH. Como o meio de cultura contém o indica- dor de pH vermelho de fenol, a coloração mais alaranjada indica que houve redução do pH desse meio e, portanto, a cultura está com uma alta confluência. AGORA É A SUA VEZ
11 ALESSANDRA NEJAR BRUNO
Protocolo para o repique de células aderentes
13 ALESSANDRA NEJAR BRUNO
Para essa prática você precisará de centrífuga, estufa de CO2, fluxo laminar, álcool 70%, luvas, meio de cultura acrescido de soro, pipetas, tubos de centrífuga e garrafas estéreis. 1.4. Link para texto “avaliação do processo de esterilização por autoclavagem utilizando indicadores biológico e químico, da unesp http://www.unesp.br/pgr/pdf/autoclave.pdf
14 BIOTECNOLOGIA II
1.5. Link para capítulo sobre cultivo celular da escola politécnica de saúde joaquim venâncio http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/d/capitulo_5_vol2.pdf 1.1. Procedimento para a limpeza dos materiais
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1.1. Alguns dos bancos de cultura existentes no brasil:
17 ALESSANDRA NEJAR BRUNO
Link para o NEBcutter: http://tools.neb.com/NEBcutter2/ Identifique variações entre sequências nos sítios de corte para enzimas de restrição utilizando a ferramenta NEBcutter. Qual é o padrão de fragmentos formado pelo corte das enzimas nas sequências 1 e 2? De que maneira é possível diferenciar as duas sequências utilizando as enzimas? Resposta: Sequência 1 CTGGCTGCCCTGTACTGCCTACTGTGGAGTTTCCGAACCTCCGCTGGCCACTTCCCTCGAGCCTGTGCCTCCTCCAAGAGCC- TGACGGAGAAGGAGTGCTGCCCGCCCTGGGCGGGCGATGGGAGCCCCTGTGGCCGGCTCTCAGGCAGGGGCTCCTGCCA- GGACGTCATTCTGTCCAGGGCACCACTCGGACCTCAGTTCCCCTTCACGGGGGTGGACGACCGCGAGTCTTGGCCCTCCA- TCTTTTATAACAGAACCTGCCAGTGCTTTAGCAACTTCATGGGATTCAATTGCGGAAGTTGTAAGTTTGGATTTAGGGGACCCC- GCTGCACAGAAAGGCGACTTTTGGTGAGAAGAAACATCTTTGATTTGAGTGTCCCAGAGAAGAACAAGTTTCTTGCCTATCT- CACTTTGGCAAAACATACCACCAGCCCAGACTACGTCATCCCCACGGGCACCTATGGCCAAATGAATCATGGAACAACACCCC- TGTTTAATGACGTCAGTGCTTACGACCTCTTTGTCTGG AGORA É A SUA VEZ
19 ALESSANDRA NEJAR BRUNO
Sobre o programa Medusa e outros programas desenvolvidos para lidar com redes biológicas O Medusa é o programa desenvolvido para a visualização de redes IPP de mais simples utilização e está disponível gratuitamente no endereço https://sites.google.com/site/medusa3visualization. Apresenta uma interface amigável e é bastante intuitivo, tornando a sua utilização facilmente executável até mesmo para o usuário sem qualquer experiência. Este software trabalha no ambiente Java e foi desenvolvido especialmente para lidar com dados do STRING. Você pode utilizar o Medusa para abrir diretamente o arquivo salvo no STRING. Isso permite a visualização da rede, bem como sua manipulação, usando os diferentes algoritmos presentes no programa. Um software bastante completo para lidar com redes biológicas é o Cytoscape. Ele é um programa mais completo, porém mais complexo que o Medusa. É disponibilizado gratuitamente no endereço http://www.cytoscape.org/. Muitas vezes as redes de interação são utilizadas para se obter respostas funcionais acerca do sistema que estamos estudando. Entretanto, devemos ser cuidadosos com as conclusões que tiramos a partir de medidas topológicas da rede, como conectividade, clusterização e centralidade. Principalmente quando trabalhamos com redes pequenas. Uma estratégia interessante é utilizar a estrutura topológica da rede IPP para projetar dados funcionais sobre o sistema em estudo como, por exemplo, se os genes que você está estudando estão mais ou menos expressos em uma determinada condição biológica. A partir da visualização da topologia da rede IPP podemos projetar sobre a rede dados referentes ao comportamento biológico daquele processo bioquímico. O programa ViaComplex foi desenvolvido exatamente para este fim. O ViaComplex é um software livre que está disponível gratuitamente no endereço http://lief.if.ufrgs. br/pub/biosoftwares/viacomplex/, onde constam também os manuais e alguns exemplos. Da mesma forma que o Medusa, o ViaComplex trabalha no ambiente Java, apresenta uma interface amigável e é bastante intuitivo. O programa apresenta, dentre as suas funcionalidades, análises de topologia customizadas (Landscape analysis – custon model). Nele, você pode carregar os dados de expressão gênica sobre a topologia da rede IPP e gerar um gráfico de cores mostrando quais porções da rede encontram-se os genes mais ou menos expressos. Além de dados de expressão gênica, é possível utilizar o programa projetar virtualmente qualquer tipo de informação funcional sobre redes biológicas. As técnicas apresentadas neste capítulo podem ser executadas em um computador pessoal comum e são de fácil execução mesmo para quem nunca teve contato com ferramentas de bioinformática.
20 BIOTECNOLOGIA II
Entretanto, caso você queira se especializar no tema, é conveniente desenvolver algum conhecimento em programação, principalmente na linguagem R. O R é considerado um ambiente de programação, o qual é cada vez mais utilizado em diversas áreas do conhecimento. Possui um funcionamento que envolve tanto funções básicas, quanto pacotes compactados para a execução de tarefas complexas. A partir do download do ambiente, o usuário tem acesso a pacotes básicos, os quais vêm instalados no programa e são capazes de executar funções que vão desde matemática básica a análises mais complexas. A partir daí, o usuário pode efetuar o download de pacotes específicos para os mais diversos fins. O número de usuários do R é crescente e envolve principalmente as comunidades acadêmicas de diversas áreas. Como se trata de um ambiente aberto e gratuito, diversos usuários disponibilizam seus próprios pacotes, os quais podem ser utilizados por qualquer indivíduo. Dentre os diversos repositórios responsáveis por organizar e distribuir os pacotes de R estão o Cran (do inglês, the Comprehensive R Archive Network - http://cran.r-project.org/) e o Bioconductor (http://www.bioconductor.org/). O Cran é o repositório oficial do R, onde é possível efetuar o download do ambiente. Já o Bioconductor é um repositório voltado especialmente para pacotes utilizados em ciências biológicas. Dentre as incontáveis vantagens do R, encontram-se a vasta documentação bem como a grande quantidade de funcionalidades alcançada pela disseminação de pacotes gerados por usuários em todo o mundo. De fato, é possível encontrar pacotes em R para a execução de virtualmente todas as análises estatísticas conhecidas. Ademais, além das análises estatísticas, diversos pacotes lidam com informações gráficas, de modo que é possível organizar um fluxo de trabalho que vai desde a tabulação dos dados, passando pelas mais variadas análises, até a geração dos gráficos finais. Tudo dentro do mesmo ambiente de trabalho. Outra grande vantagem do R é o fato de ser de livre acesso para qualquer pessoa. Talvez a maior desvantagem esteja na necessidade de uma razoável familiarização com linguagem de programação, não sendo o R tão intuitivo como softwares de linguagem mais alta. Entretanto, a já citada documentação disponível ajuda o usuário a avançar na utilização deste ambiente. O R está disponível para todos os principais sistemas operacionais.
