Baixe Técnicas de Coloração em Microbiologia: Preparo de Esfregaços e Análise Microscópica e outras Esquemas em PDF para Ciências da Saúde, somente na Docsity!
Coloração e Bacterioscopia
Apresentação
A coloração e a bacterioscopia são técnicas essenciais no campo da microbiologia, permitindo a
visualização e identificação de microrganismos por microscopia óptica. Essas técnicas são
fundamentais na caracterização de bactérias e outros microrganismos presentes em amostras
clínicas e ambientais, auxiliando no diagnóstico de infecções e na monitorização de processos
microbiológicos.
A coloração bacteriana envolve a aplicação de corantes específicos em preparações de amostras
microbianas, destacando estruturas celulares e facilitando sua observação ao microscópio. Já a
bacterioscopia refere-se à análise direta de material microbiano por meio de microscopia,
permitindo a identificação de características morfológicas, como forma, arranjo e estruturas
celulares.
Além de fornecer informações valiosas sobre a morfologia e a estrutura das bactérias, as técnicas
ajudam na identificação rápida e precisa de patógenos em amostras clínicas. Elas são
frequentemente utilizadas para auxiliar no diagnóstico de doenças infecciosas, orientar o
tratamento antimicrobiano e monitorar a eficácia terapêutica. Ao permitir a visualização direta de
microrganismos, fornecem informações complementares a outros métodos diagnósticos,
contribuindo para uma abordagem integrada e abrangente no cuidado ao paciente.
Nesta Unidade de Aprendizagem, você vai explorar técnicas fundamentais no campo da
microbiologia, focando especificamente no preparo de esfregaços para coloração e na análise
microscópica de microrganismos. Ao longo do estudo, vai reconhecer e dominar as técnicas de
preparo de esfregaços, aprendendo a realizar procedimentos adequados para garantir uma amostra
de qualidade para a análise microscópica. Além disso, vai listar e compreender as diferentes
técnicas de coloração utilizadas em microbiologia, assim como suas etapas e aplicações clínicas. Ao
dominar essas técnicas, você vai estar preparado para identificar as principais morfologias e
estruturas bacterianas observadas na microscopia, desenvolvendo habilidades essenciais para a
interpretação de resultados laboratoriais e para o diagnóstico de doenças infecciosas.
Bons estudos.
Ao final desta Unidade de Aprendizagem, você deve apresentar os seguintes aprendizados:
- Reconhecer as técnicas de preparo de esfregaços para coloração.
- Listar as técnicas de coloração e suas etapas.
- Avaliar as principais morfologias e estruturas bacterianas observadas na microscopia.
c) Escolha e aplique a técnica de coloração mais apropriada para a análise das amostras. Justifique
sua escolha com base nas características esperadas do microrganismo causador da infecção.
d) Na sequência explique como iria analisar as amostras após coradas, descreva e interprete os
resultados hipotéticos obtidos, identificando o microrganismo causador da infecção com base em
suas características morfológicas e estruturais.
e) Elabore um relatório detalhado dos procedimentos realizados, dos resultados obtidos e da
identificação do microrganismo.
f) Com base na identificação do agente infeccioso, forneça recomendações para o tratamento
adequado do paciente, incluindo informações sobre a sensibilidade a antibióticos, se aplicável.
Infográfico
As bactérias gram-positivas e gram-negativas são dois grupos distintos de microrganismos que
podem ser diferenciados com base na estrutura de suas paredes celulares. As bactérias gram-
positivas têm uma parede celular composta principalmente de uma espessa camada de
peptidoglicano, que retém o corante violeta-iodo durante a coloração de Gram, resultando em uma
coloração roxa ao microscópio. Exemplos de bactérias gram-positivas incluem Staphylococcus
aureus , Streptococcus pyogenes e Bacillus subtilis.
Por sua vez, as bactérias gram-negativas têm uma parede celular mais complexa, composta de uma
fina camada de peptidoglicano e uma membrana externa composta de lipopolissacarídeos. Durante
a coloração de Gram, a parede celular fina das bactérias gram-negativas é incapaz de reter o
corante violeta-iodo, sendo descoradas pelo álcool e, posteriormente, coradas pela safranina,
resultando em uma coloração rosa ou vermelha. Exemplos de bactérias gram-negativas incluem
Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa e Salmonella spp.
Neste Infográfico, você vai ver todas as etapas da técnica de coloração de Gram, uma das mais
importantes na microbiologia clínica, detalhando como essa técnica age nas diferentes estruturas
bacterianas, permitindo a diferenciação entre bactérias gram-positivas e gram-negativas com base
em suas características de parede celular.
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Catalogação na publicação: Poliana Sanchez de Araujo – CRB 10/
T712m Tortora, Gerard J. Microbiologia / Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case ; tradução: Danielle Soares de Oliveira Daian, Luis Fernando Marques Dorvillé ; revisão técnica: Flávio Guimarães da Fonseca, Ana Paula Guedes Frazzon, Jeverson Frazzon. – 12. ed. – Porto Alegre : Artmed, 2017. xxi, 935 p. : il. color. ; 28 cm.
ISBN 978-85-8271-353-
- Microbiologia. I. Funke, Berdell R. II. Case, Christine L. III. Título.
CDU 579
52 PARTE I Fundamentos de microbiologia
Unidades de medida
OBJETIVO DO APRENDIZADO 3-1 Listar as unidades utilizadas na mensuração de mi- crorganismos.
Quando medimos os microrganismos, utilizamos o sistema mé- trico. A principal vantagem do sistema métrico consiste no fato de as unidades relacionarem-se umas com as outras por fatores de 10. Assim, 1 metro (m) é igual a 10 decímetros (dm) ou a 100 centímetros (cm) ou a 1.000 milímetros (mm). As unidades do sistema de medida dos Estados Unidos não possuem a vanta- gem da fácil conversão por um único fator de 10. Por exemplo, 3 pés, ou 36 polegadas, são iguais a 1 jarda. Os microrganismos são medidos em unidades ainda me- nores, como micrômetros e nanômetros. Um micrômetro ( m) é igual a 0,000001 m (10^6 m). O prefixo micro indica que a uni- dade seguinte a ele deve ser dividida por 1 milhão, ou 10^6 (ver seção “Notação exponencial”, no Apêndice B). Um nanômetro (nm) é igual a 0,000000001 m (10^9 m). Angstrom (Å) era utili- zado anteriormente para indicar 10^10 m, ou 0,1 nm. A Tabela 3.1 apresenta as unidades métricas básicas de comprimento e alguns equivalentes dos Estados Unidos.
TESTE SEU CONHECIMENTO
✓ Quantos nanômetros são 10 ? 3-
Microscopia: os instrumentos
OBJETIVO DO APRENDIZADO 3-2 Ilustrar o caminho da luz através de um microscópio composto. 3-3 Definir ampliação total e resolução. 3-4 Identificar um uso para as microscopias de campo escuro, de contraste de fase, de contraste por interfe- rência diferencial, de fluorescência, confocal, de dois fótons e de varredura acústica, e compará-las com a iluminação de campo claro. 3-5 Explicar qual a diferença entre a microscopia eletrôni- ca e a microscopia óptica.
3-6 Identificar aplicações para o microscópio eletrônico de transmissão (MET), para o microscópio eletrônico de varredura (MEV) e para o microscópio de varredu- ra por sonda.
Caso clínico: caos microscópico
Maryanne, uma executiva de marketing de 42 anos e mãe de três filhos, tem sofrido de uma dor de estômago recorrente, que parece estar piorando. Ela brinca que seu marido deveria comprar um estoque de Pepto-Bismol, já que ela compra muito deste medicamento. Por insistência do marido, ela marca uma consulta com o médico da família. Após ouvir de Maryanne que ela se sente melhor imedia- tamente após a administração de Pepto-Bismol, o doutor sus- peita que Maryanne possa apre- sentar uma úlcera péptica asso- ciada à Helicobacter pylori. O que é Helicobacter pylori? Leia mais para descobrir.
52 61 66 67
5 m
O microscópio simples utilizado por van Leeuwenhoek no século XVII possuía somente uma lente e era similar a uma lupa. Entretanto, van Leeuwenhoek foi o melhor polidor de lentes no mundo em sua época. Suas lentes eram polidas com tanta pre- cisão que uma única lente podia ampliar um micróbio cerca de 300 . Seus microscópios simples permitiram que ele fosse a pri- meira pessoa a ver as bactérias (ver Figura 1.2, p. 7). Os contemporâneos de van Leeuwenhoek, como Robert Hooke, construíram microscópios compostos, que possuem múl- tiplas lentes. Na verdade, é creditada a um fabricante holandês de binóculos, Zaccharias Janssen, a produção do primeiro micros- cópio composto, por volta de 1600. Entretanto, esses microscó- pios compostos iniciais eram de pouca qualidade e não podiam ser usados para se observar bactérias. Foi somente em 1830 que um microscópio significativamente melhor foi desenvolvido por
Tabela 3.1 Unidades métricas de comprimento e equivalentes dos Estados Unidos
Unidade métrica Significado do prefixo Equivalente métrico Equivalente dos Estados Unidos 1 quilômetro (km) quilo 1.000 1.000 m 103 m 3280,84 pés ou 0,62 milhas; 1 milha 1,61 km 1 metro (m) Unidade-padrão de medida 39,37 polegadas ou 3,28 pés ou 1,09 jardas 1 decímetro (dm) deci 1/10 0,1 m 10 ^1 m 3,94 polegadas 1 centímetro (cm) centi 1/100 0,01 m 10 ^2 m 0,394 polegadas; 1 polegada 2,54 cm 1 milímetro (mm) milli 1/1.000 0,001 m 10 ^3 m 1 micrômetro ( m) micro 1/1.000.000 0,000001 m 10 ^6 m 1 nanômetro (nm) nano 1/1.000.000.000 0,000000001 m 10 ^9 m 1 picômetro (pm) pico 1/1.000.000.000.000 0,000000000001 m 10 ^12 m
CAPÍTULO 3 Observando microrganismos no microscópio 53
Joseph Jackson Lister (o pai de Joseph Lister). Várias melhorias no microscópio de Lister resultaram no desenvolvimento do mi- croscópio composto moderno, do tipo utilizado em laboratórios de microbiologia atualmente. Os estudos microscópicos de espé- cimes vivos revelaram interações dramáticas entre os micróbios (ver quadro Aplicações da microbiologia, p. 54).
Microscopia óptica
Microscopia óptica se refere ao uso de qualquer tipo de micros- cópio que utilize luz visível para observar amostras. Neste capítu- lo, examinaremos vários tipos de microscopia óptica.
Microscopia óptica composta
O microscópio óptico composto ( MO ) moderno possui uma série de lentes e utiliza luz visível como fonte de iluminação ( Figura 3.1a ). Com um microscópio óptico composto, podemos examinar amostras muito pequenas, bem como parte de seus de- talhes. Uma série de lentes finamente polidas (Figura 3.1b) for- ma uma imagem claramente focada, muitas vezes maior que a amostra em si. Essa ampliação é obtida quando os raios de luz de um iluminador , a fonte de luz, passam através de um condensa- dor , que possui lentes que direcionam os raios de luz através da
amostra. A seguir, os raios de luz passam para as lentes objetivas , as lentes mais pró- ximas da amostra. A imagem da amostra é ampliada novamente pelas lentes ocula- res , ou simplesmente objetivas. Podemos calcular a ampliação total de uma amostra multiplicando a ampliação da lente objetiva (aumento) pela ampliação da lente ocular (aumento). A maioria dos microscó- pios utilizados em microbiologia possui várias lentes objetivas, incluindo 10 (pequeno aumento), 40 (grande aumento) e 100 (imersão em óleo). A maioria das lentes oculares amplia as amostras por um fator de 10. Multiplicando-se a ampliação de uma lente objetiva específica pela ampliação da ocular, veremos que a ampliação total seria de 100 para as lentes de peque- no aumento, 400 para as lentes de grande aumento, e 1.000 para imersão em óleo. Alguns microscópios ópticos compostos podem alcançar uma ampliação total de 2.000 com as lentes de imersão em óleo. A resolução (também chamada de potência de resolução) consiste na capacidade das lentes de diferenciar detalhes sutis e
(b) O caminho da luz (de baixo para cima)
Linha de visão
Lente ocular
Caminho da luz Prisma
Corpo
Lentes objetivas
Amostra Lentes do condensador
Iluminador
Base com fonte de iluminação
Braço
Botão de ajuste amplo (macrométrico) do foco
Botão de ajuste fino (micrométrico) do foco
Lente ocular Reamplia a imagem formada pela lente objetiva
Corpo Transmite a imagem da lente objetiva para a ocular
Lentes objetivas Lentes primárias que ampliam a amostra Platina Mantém a lâmina de microscópio em posição
Diafragma Controla a quantidade de luz que entra no condensador Iluminador Fonte de luz
Base
Condensador Focaliza a luz através da amostra
(a) Principais componentes e funções
Figura 3.1 O microscópio óptico composto.
Qual é a ampliação total de um microscópio óptico composto com lente objetiva de ampliação de 40 e lente ocular de amplia- ção de 10?
ASM: a estrutura e função dos microrganismos têm sido reveladas pelo uso do microscópio (incluindo os de campo claro, contraste de fase, de fluorescência e eletrônicos).
CAPÍTULO 3 Observando microrganismos no microscópio 55
O índice de refração é uma medida da capacidade de curvatura da luz em um meio. Alteramos o índice de refração das amos- tras por coloração, um procedimento que discutiremos em breve. Os raios de luz se movem em uma linha reta através de um meio único. Após a coloração, a amostra e seu meio apresentam dife- rentes índices de refração. Quando os raios de luz passam através dos dois materiais (a amostra e seu meio), os raios mudam de direção (sofrem refração) a partir de uma linha reta, curvando-se ou mudando o ângulo no limite entre os materiais. Isso aumenta o contraste da imagem entre a amostra e o meio. À medida que os raios de luz seguem para longe das amostras, eles se espalham e entram na lente objetiva, e a imagem é, assim, ampliada. Para alcançar uma alta ampliação (1.000) com boa reso- lução, a lente objetiva deve ser pequena. Embora necessitemos que
a luz percorra a amostra e o meio para ser refratada de modo di- ferente, não desejamos perder os raios de luz após a sua passagem através da amostra corada. Para preservar a direção dos raios de luz na maior ampliação, óleo de imersão é colocado entre a lâmina de vidro e a lente objetiva de imersão ( Figura 3.3 ). O óleo de imer- são possui o mesmo índice de refração que o vidro, e, dessa forma, torna-se parte da óptica do vidro do microscópio. A menos que o óleo de imersão seja utilizado, os raios de luz são refratados à medida que penetram no ar sobre a lâmina, e a lente objetiva pre- cisaria ter um diâmetro maior para capturar a maior parte deles. O óleo possui o mesmo efeito que o aumento do diâmetro da lente objetiva; portanto, ele melhora a potência de resolução das lentes. Se o óleo não for utilizado com uma lente objetiva de imersão, a imagem apresentará uma baixa resolução e se tornará borrada.
F I G U R A D E B A S E
Microscópios e ampliação
Microscópio óptico 200 nm–10 mm
Microscópio eletrônico de varredura 10 nm–1 mm
Se uma bactéria apresenta 1 micrômetro de comprimento e o seu dedo indicador possui 6,5 cm de comprimento, quantas dessas bactérias você consegue colocar de uma extremidade a outra do seu dedo? Resposta: 32.500. •
1 m 0,1 m 1 cm 1 mm 100 nm 10 nm 1 nm 0,1 nm
Faixa dos organismos mostrados neste livro 100 m 10 m 1 m 10 pm
Bactéria E. coli Dupla-hélice do DNA
Hemácias
Carrapato
Tamanho real
Bacteriófagos T (vírus)
Microscópio de força atômica 0,1 nm–10 nm
CONCEITOS-CHAVE
- Os microscópios são utilizados para ampliar objetos pequenos.
- Uma vez que diferentes microscópios possuem diferentes faixas de resolução, o tamanho de uma amostra determina quais microscópios podem ser utilizados para a observação efetiva deste espécime.
- A maioria das microfotografias apresentadas neste livro-texto (como as acima) possuem barras de tamanho e símbolos para auxiliá-lo na identificação do tamanho real da amostra e do tipo de microscópio utilizado para a produção daquela imagem.
- O^ ícone vermelho^ indica que a microfotografia foi colorida artificialmente.
- A resolução aumenta com a diminuição do comprimento de onda.
escalas microscópicas
Microscópio eletrônico de transmissão 10 pm–100 m
LM 5 m
LM
SEM 1 m
SEM
TEM 60 nm
TEM
AFM 20 nm
AFM
Olho nu ≥ 200 m
Micro- dica
56 PARTE I Fundamentos de microbiologia
Sob condições normais de funcionamento, o campo de visão em um microscópio óptico composto é claramente ilumi- nado. Ao focalizar a luz, o condensador produz uma iluminação de campo claro ( Figura 3.4a ). Nem sempre é desejável corar uma amostra, porém uma célula não corada apresenta pouco contraste em relação ao seu meio circundante e, dessa forma, é mais difícil de ser visualizada. Células não coradas são mais facilmente observa- das com os microscópios compostos modificados, descritos na próxima seção.
TESTE SEU CONHECIMENTO
✓ A luz atravessa quais lentes em um microscópio composto? 3-
✓ O que significa dizer que um microscópio possui uma resolu- ção de 0,2 nm? 3-
Microscopia de campo escuro
Um microscópio de campo escuro é utilizado para a análise de microrganismos vivos que são invisíveis ao microscópio óptico comum, que não podem ser corados pelos métodos tradicionais, ou que são tão distorcidos pela coloração que suas características não podem ser identificadas. Um microscópio de campo escuro utiliza um condensador de campo escuro que contém um disco
opaco. O disco bloqueia a luz que poderia entrar na lente objeti- va diretamente. Somente a luz que é refletida para fora (devolvi- da) da amostra entra na lente objetiva. Uma vez que não há luz de fundo direta, a amostra aparece iluminada contra um fundo preto – o campo escuro (Figura 3.4b). Essa técnica é frequen- temente utilizada para examinar microrganismos não corados suspensos em líquido. Uma aplicação da microscopia de campo escuro é a análise de espiroquetas muito finas, como Treponema pallidum, o agente causador da sífilis.
Microscopia de contraste de fase
Outra forma de se observar os microrganismos é por meio do microscópio de contraste de fase. A microscopia de contraste de fase é especialmente útil, uma vez que por meio desta técnica as estruturas internas de uma célula se tornam mais nitidamente definidas, permitindo um exame detalhado dos microrganismos vivos. Além disso, não é necessária fixação (fixar os micróbios à lâmina microscópica) ou coloração da amostra – procedimentos que poderiam distorcer ou destruir os microrganismos. Em um microscópio de contraste de fase, um conjunto de raios luminosos sai diretamente da fonte de luz. O outro conjunto é derivado da luz que é refletida ou difratada de uma estrutura particular na amostra. (Difração é a dispersão dos raios luminosos à medida que eles “tocam” a borda de uma amostra. Os raios difratados são curvados para longe dos raios de luz paralelos, que passam mais distante da amostra.) Quando os dois conjuntos de raios luminosos – raios diretos e refletidos ou difratados – são reunidos, eles formam uma ima- gem da amostra na lente ocular, contendo áreas relativamente claras (em fase), que variam de tons de cinza ao preto (fora de fase; Figura 3.4c).
Microscopia de contraste com interferência
diferencial
A microscopia de contraste com interferência diferencial ( CID ) é similar à microscopia de contraste de fase, pois utiliza as diferenças nos índices de refração. Entretanto, um microscópio CID utiliza dois feixes de luz, em vez de um. Além disso, pris- mas separam cada feixe de luz, adicionando cores contrastantes à amostra. Assim, a resolução de um microscópio CID é maior que a de um microscópio de contraste de fase padrão. A imagem também apresenta cores brilhantes, e parece quase tridimensio- nal ( Figura 3.5 ).
Microscopia de fluorescência
A microscopia de fluorescência tira vantagem da fluores- cência , a capacidade das substâncias de absorverem curtos comprimentos de onda (ultravioleta) e produzirem luz em um comprimento de onda maior (visível). Alguns organismos fluorescem naturalmente sob iluminação ultravioleta; se a amostra que será visualizada não fluorescer naturalmente, ela pode ser corada com um grupo de corantes fluorescentes, de- nominados fluorocromos. Quando os microrganismos corados com um fluorocromo são examinados sob um microscópio de fluorescência, com uma fonte de luz ultravioleta ou próxima da
Lentes objetivas em óleo de imersão
Óleo de imersão
Luz não refratada
Sem o óleo de imersão, a maior parte da luz é refratada e perdida
Lâmina de vidro
Lentes do condensador
Diafragma da íris Fonte de luz
Condensador
Ar
Figura 3.3 Refração no microscópio composto, utilizando uma lente objetiva em óleo de imersão. Como os índices de refração da lâmina de vidro e do óleo de imersão são os mesmos, os raios de luz não são refratados quando passam de um meio para o outro, quando uma lente objetiva em óleo de imersão é utilizada. A utilização do óleo de imersão é necessária em ampliações maiores do que 900.
Por que o óleo de imersão é necessário em ampliações de 1.000, mas não em lentes objetivas de baixo alcance?
58 PARTE I Fundamentos de microbiologia
corpos fluorescentes são então adicionados a uma lâmina de mi- croscópio contendo uma bactéria desconhecida. Se essa bactéria desconhecida for a mesma bactéria que foi injetada no animal, os anticorpos fluorescentes se ligarão aos antígenos na superfície da bactéria, fazendo ela fluorescer. Essa técnica pode detectar bactérias e outros microrga- nismos patogênicos, mesmo dentro de células, tecidos ou ou- tras amostras clínicas (Figura 3.6b). Além disso, de extrema importância, ela pode ser utilizada para identificar um micró- bio em minutos. A imunofluorescência é especialmente útil no diagnóstico da sífilis e da raiva. Discutiremos mais sobre as reações antígeno-anticorpo e sobre imunofluorescência no Capítulo 18.
Microscopia confocal
Microscopia confocal é uma técnica na microscopia óptica uti- lizada para reconstruir imagens tridimensionais. Assim como na microscopia de fluorescência, as amostras são coradas com fluorocromos para que emitam, ou devolvam, a luz. Contudo, em vez da iluminação do campo todo, na microscopia confocal, um plano de uma pequena região da amostra é iluminado com uma luz de pequeno comprimento de onda (azul), que passa a luz devolvida através de uma abertura alinhada com a região iluminada. Cada plano corresponde a uma imagem de um corte fino, fisicamente seccionado a partir de uma amostra. Os pla- nos e as regiões sucessivos são iluminados até que toda a amos- tra tenha sido examinada. Uma vez que a microscopia confocal utiliza um orifício pequeno de abertura (pinhole), ela elimina o desfoque que ocorre com outros microscópios. Por isso, imagens bidimensionais excepcionalmente claras podem ser obtidas, com uma resolução até 40% melhor que a de outros microscópios. A maioria dos microscópios confocais é utilizada em conjunto com computadores para construir imagens tridimen- sionais. Os planos examinados de uma amostra, que lembram um arquivo de imagens, são convertidos a um formato digital, que pode ser utilizado por um computador para construir uma representação tridimensional. As imagens reconstruídas podem ser movidas e visualizadas em qualquer orientação. Essa técnica tem sido utilizada para obter imagens tridimensionais de células inteiras e de componentes celulares ( Figura 3.7 ). Além disso, a microscopia confocal pode ser utilizada para avaliar a fisiologia celular, monitorando as distribuições e as concentrações de subs- tâncias, como o ATP e os íons cálcio.
Microscopia de dois fótons
Assim como na microscopia confocal, na microscopia de dois fótons ( MDF ) as amostras são coradas com um fluorocromo.
LM (^25) m
Figura 3.5 Microscopia de contraste com interferência diferencial (CID). Como a microscopia de contraste de fase, a CID utiliza diferen- ças nos índices de refração para produzir uma imagem, neste caso de um Paramecium. As cores na imagem são produzidas por prismas que dividem os dois feixes de luz usados neste processo.
Por que uma microfotografia feita por CID apresenta colora- ção brilhante?
(b)
Fluorocromo
Anticorpos
Anticorpos combinados ao fluorocromo
Bactéria desconhecida
(a)
Moléculas de antígeno da superfície da célula
Célula bacteriana com anticorpos ligados combinados ao fluorocromo LM 4 m
Figura 3.6 O princípio da imunofluorescência. (a) Um tipo de fluorocromo é combinado a anticorpos contra um tipo específico de bactéria. Quando a preparação é adicionada às células bacterianas em uma lâmina de microscópio, os anticorpos se fixam às células bacterianas, e as cé- lulas fluorescem quando iluminadas com luz ultravioleta. (b) No teste de absorção de anticorpo treponêmico fluorescente (FTA-ABS) para a sífilis mostrado aqui, o Treponema pallidum é evidenciado como células verdes contra um fundo escuro.
Por que as outras bactérias não fluorescem no teste FTA-ABS?
CAPÍTULO 3 Observando microrganismos no microscópio 59
A microscopia de dois fótons utiliza uma luz de comprimento de onda longo (vermelha) e, dessa forma, dois fótons, em vez de um, são necessários para excitar o fluorocromo para emitir luz. O comprimento de onda mais longo permite a geração de imagens de células vivas em tecidos de até 1 mm (1.000 m) de espessura ( Figura 3.8 ). A microscopia confocal pode formar imagens de células em detalhes somente a uma espessura menor que 100 μm. Além disso, o comprimento de onda mais longo tem menor probabilidade de formar o oxigênio singleto, que da- nifica as células (ver p. 155). Outra vantagem da MDF é que ela pode rastrear a atividade das células em tempo real. Por exem- plo, células do sistema imune foram observadas respondendo a um antígeno.
Microscopia acústica de varredura
A microscopia acústica de varredura ( MAV ) basicamente con- siste em interpretar a ação de uma onda sonora enviada através de uma amostra. Uma onda sonora de uma frequência específica se propaga através da amostra, e uma parte dessa onda é refletida de volta toda vez que atinge uma interface dentro do material. A resolução é de cerca de 1 μm. A MAV é utilizada para o es- tudo de células vivas aderidas a outra superfície, como células cancerígenas, placas ateroscleróticas e biofilmes bacterianos que obstruem equipamentos ( Figura 3.9 ).
TESTE SEU CONHECIMENTO
✓ Em que as microscopias de campo claro, campo escuro, con- traste de fase e fluorescência são semelhantes? 3-
Microscopia eletrônica
Objetos menores do que 0,2 μm, como vírus ou estruturas inter- nas de células, devem ser analisados com um microscópio ele- trônico. Na microscopia eletrônica, um feixe de elétrons é utili-
zado, em vez de luz. Como a luz, os elétrons livres se deslocam em ondas. A potência de resolução do microscópio eletrônico é muito maior que a dos outros microscópios descritos até agora. A melhor resolução dos microscópios eletrônicos é devida aos comprimentos de onda mais curtos dos elétrons; os comprimen- tos de onda dos elétrons são cerca de 100 mil vezes menores que os comprimentos de onda da luz visível. Portanto, os micros- cópios eletrônicos são usados para examinar estruturas muito pequenas para serem determinadas com microscópios ópticos. As imagens produzidas por microscópios eletrônicos são sempre em preto e branco, mas podem ser coloridas artificialmente para acentuar certos detalhes. Em vez de usar lentes de vidro, um microscópio eletrôni- co utiliza lentes eletromagnéticas para focalizar um feixe de elé- trons na amostra. Existem dois tipos: o microscópio eletrônico de transmissão e o microscópio eletrônico de varredura.
Microscopia eletrônica de transmissão
No microscópio eletrônico de transmissão ( MET ), um feixe de elétrons precisamente focalizado, oriundo de um canhão de elé- trons, passa através de um corte ultrafino da amostra, especial- mente preparado ( Figura 3.10a ). O feixe é focalizado em uma pequena área da amostra por uma lente condensadora eletro- magnética, que realiza uma função aproximadamente igual à do condensador de um microscópio óptico – direcionar o feixe de elétrons em uma linha reta para iluminar a amostra. Em vez de ser colocada em uma lâmina de vidro, como nos microscópios ópticos, a amostra normalmente é colocada sobre uma tela de cobre. O feixe de elétrons passa através da amostra e, então, através de uma lente objetiva eletromagnética, que amplia a imagem. Por fim, os elétrons são focalizados por uma lente projetora eletromagnética (em vez de uma lente ocu- lar, como no microscópio óptico) sobre uma tela fluorescente ou
CF 30 m
Núcleo
Figura 3.7 Microscopia confocal. A microscopia confocal produz imagens tridimensionais e pode ser usada para examinar o interior de células. Está apresentado aqui o núcleo de Paramecium tetraurelia.
Quais as vantagens da microscopia confocal?
TPM 25 m
Figura 3.8 Microscopia de dois fótons (MDF). Este procedimen- to torna possível a obtenção de imagens de células de até 1 mm de espessura em detalhes. Esta imagem mostra um Paramecium. A imu- nofluorescência é utilizada para mostrar os microtúbulos e o núcleo.
Quais as diferenças entre a MDF e a microscopia confocal?
CAPÍTULO 3 Observando microrganismos no microscópio 61
tra não tem aspecto tridimensional. Além disso, as amostras devem ser fixadas, desidratadas e visualizadas em alto vácuo para prevenir a dispersão dos elétrons. Esses tratamentos não somente destroem a amostra como também causam encolhi- mento e distorção, algumas vezes de forma que pode parecer que há estruturas adicionais em uma célula preparada. As es- truturas que aparecem em razão do método de preparação são chamadas de artefatos.
Microscopia eletrônica de varredura
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) supera as di- ficuldades de seccionamento associadas ao microscópio ele- trônico de transmissão. Ele fornece imagens tridimensionais notáveis das amostras (Figura 3.10b). Um canhão de elétrons produz um feixe de elétrons precisamente focado, chamado de feixe primário de elétrons. Esses elétrons passam através de lentes eletromagnéticas e são dirigidos à superfície da amostra. O feixe primário de elétrons arranca elétrons da superfície da amostra, e os elétrons secundários produzidos são transmitidos a um coletor de elétrons, amplificados e usados para produzir uma imagem em uma tela ou chapa fotográfica. Essa imagem é chamada de microfotografia eletrônica de varredura. Esse mi- croscópio é especialmente útil no estudo das estruturas de su- perfície de células intactas e vírus. Na prática, ele pode determi- nar objetos tão próximos quanto 10 nm, e estes são geralmente ampliados de 1.000 a 10.000.
TESTE SEU CONHECIMENTO
✓ Por que os microscópios eletrônicos possuem uma maior resolução do que os microscópios ópticos? 3-
Microscopia de varredura por sonda
Desde o início da década de 1980, vários novos tipos de micros- cópios, chamados de microscópios de varredura por sonda , têm sido desenvolvidos. Eles utilizam vários tipos de sonda para
examinar a superfície de uma amostra utilizando corrente elétri- ca, que não modifica a amostra ou a expõe à radiação nociva de alta energia. Esses microscópios podem ser usados para mapear formas atômicas e moleculares, caracterizar propriedades mag- néticas e químicas e determinar as variações de temperatura no interior das células. Entre os novos microscópios de varredura por sonda estão o microscópio de tunelamento e o microscópio de força atômica, discutidos a seguir.
Microscopia de tunelamento
A microscopia de tunelamento ( MT ) utiliza uma fina sonda de tungstênio, que varre a amostra e produz uma imagem que revela protuberâncias e depressões dos átomos na superfície da amos- tra ( Figura 3.11a ). A potência de resolução de uma MT é muito maior que a de um microscópio eletrônico, podendo determinar detalhes que são apenas 1/100 do tamanho de um átomo. Além disso, não é necessária uma preparação especial da amostra para a observação. As MTs são usadas para fornecer imagens incrivel- mente detalhadas de moléculas como o DNA.
Microscopia de força atômica
Na microscopia de força atômica ( MFA ), uma sonda de metal e diamante é levemente pressionada sobre a superfície de uma amostra. À medida que a sonda se move ao longo da superfície da amostra, seus movimentos são registrados, e uma imagem tri- dimensional é produzida (Figura 3.11b). Assim como na MT, a MFA não requer uma preparação especial da amostra. A MFA é usada para fornecer imagens tanto de substâncias biológicas (em detalhes a nível quase atômico) (ver também Figura 17.4c,
Caso clínico
TEM 5 m
O Helicobacter pylori é uma bac- téria espiralada, gram-negativa, que possui múltiplos flagelos. É a causa mais comum de úlceras pépticas em seres humanos e pode causar também câncer de estômago. A primeira microfoto- grafia eletrônica de H. pylori foi ti- rada na década de 1980, quando o médico australiano Robin Warren utilizou um microscópio eletrônico para visualizar H. pylori em um tecido estomacal. Por que foi necessária a utilização de um microscópio eletrônico para a visualização da bactéria H. pylori?
52 61 66 67
(a) (^) STM (^) 50 nm (b) AFM (^) 12 nm
Figura 3.11 Microscopia de varredura por sonda. (a) Imagem de microscopia de tunelamento (MT) da proteína RecA de E. coli. Essa proteína está envolvida no reparo do DNA. (b) Imagem de microsco- pia de força atômica (MFA) da toxina perfringolisina O de Clostridium perfringens. Essa proteína produz buracos nas membranas plasmáti- cas humanas.
Qual é o princípio empregado na microscopia de varredura por sonda?
62 PARTE I Fundamentos de microbiologia
p. 473) quanto de processos moleculares (como a montagem da fibrina, um componente do coágulo sanguíneo). Os vários tipos de microscopia que acabamos de descrever estão resumidos na Tabela 3..
TESTE SEU CONHECIMENTO
✓ Qual a aplicação da MET? E da MEV? E da Microscopia de var- redura por sonda? 3-
Preparação de amostras para
microscopia óptica
OBJETIVOS DO APRENDIZADO 3-7 Diferenciar um corante ácido de um corante básico. 3-8 Explicar a finalidade da coloração simples. 3-9 Listar as etapas da coloração de Gram, e descrever a aparência de células gram-positivas e gram-negativas após cada etapa. 3-10 Comparar e diferenciar a coloração de Gram e a colo- ração acidorresistente. 3-11 Explicar por que cada uma das seguintes colorações é utilizada: coloração da cápsula, do endósporo, dos flagelos.
Como a maioria dos microrganismos aparece quase incolor quando observada por meio da microscopia de campo claro, de- vemos prepará-los para a observação. Uma das formas de prepa- ração da amostra é a coloração (corar). A seguir, discutiremos vários procedimentos diferentes de coloração.
Preparando esfregaços para coloração
A maioria das observações iniciais dos microrganismos é feita por meio de preparações coradas. Coloração significa simples- mente corar os microrganismos com um corante que enfatize certas estruturas. Antes que os microrganismos possam ser co- rados, no entanto, eles precisam ser fixados (aderidos) à lâmina microscópica. A fixação simultaneamente destrói os microrga- nismos e os fixa na lâmina. Ela também preserva várias partes dos micróbios em seu estado natural com apenas um mínimo de distorção. Quando uma amostra precisa ser fixada, um filme delgado de material contendo os microrganismos é espalhado sobre a su- perfície da lâmina. Esse filme, denominado esfregaço , é deixado para secar ao ar. Na maioria dos procedimentos de coloração, a lâmina é, então, fixada pela passagem, várias vezes, sobre a cha- ma de um bico de Bunsen, com o lado do esfregaço para cima, ou recobrindo a lâmina com metanol por um minuto. A coloração é aplicada e, então, lavada com água; a seguir, a lâmina é seca com papel absorvente. Sem a fixação, a coloração poderia lavar os micróbios da lâmina. Agora, os microrganismos corados estão prontos para o exame microscópio. Os corantes são sais compostos por um íon positivo e um íon negativo, um dos quais é colorido e conhecido como cromóforo. A cor dos chamados corantes básicos está no cá- tion; a dos corantes ácidos , está no ânion. As bactérias são le- vemente carregadas negativamente em pH 7. Assim, o cátion colorido em um corante básico é atraído pela célula bacteriana carregada negativamente. Os corantes básicos, que incluem o cristal violeta, o azul de metileno, o verde de malaquita e a sa- franina, são mais comumente utilizados que os corantes áci- dos. Os corantes ácidos não são atraídos pela maioria dos tipos
Tabela 3.2 Resumo dos vários tipos de microscópios
Tipo de microscópio Características distintas Imagem característica Principais usos Luz Campo claro Utiliza luz visível como fonte de iluminação; não pode determinar estruturas menores que 0,2 μm; a amostra aparece contra um fundo claro. Econômico e fácil de usar.
Paramecium LM 25 m
Observar várias amostras coradas e contar micróbios; não define amostras muito pequenas, como os vírus.
Campo escuro Utiliza um condensador especial, com disco opaco, que impede a entrada de luz diretamente na len- te objetiva; a luz refletida por uma amostra entra na lente objetiva, e a amostra aparece clara contra um fundo escuro.
Paramecium LM 25 m
Examinar microrganismos vivos que são invisíveis na microscopia de campo claro, que não se coram facilmente, ou são distorcidos pela coloração; frequentemente utiliza- da para a detecção de Treponema pallidum no diagnóstico da sífilis.
(continua)
