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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITO DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-
ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Leishmania infantum chagasi EM
SANGUE DE CÃO
CRISTIANE BECK
Botucatu-SP
2016
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Efeitos da luz e ftalocianina na inativação da Leishmania em cães, Provas de Veterinária
Um estudo que avalia os efeitos da terapia fotodinâmica, utilizando luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio (alclpc), no sangue de cães infectados com leishmania infantum chagasi, após 180 dias de inoculação em hamsters. O objetivo do estudo é verificar se a terapia fotodinâmica pode inactivar a leishmania infantum chagasi no sangue canino.
Tipologia: Provas
2022
1 / 88
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITO DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-
ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Leishmania infantum chagasi EM SANGUE DE CÃO
CRISTIANE BECK
Botucatu-SP 2016
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITO DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-
ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Leishmania infantum chagasi EM SANGUE CANINO
CRISTIANE BECK
Tese apresentada junto ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. Raimundo Souza Lopes Co-orientador: Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco
Nome do Autor: Cristiane Beck
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Título: EFEITO DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Leishmania infantum chagasi NO SANGUE DE CÃES
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr Raimundo Souza Lopes Presidente e Orientador Departamento de Clínica Veterinária
Profa. Dra. Regina Kiomi Takahira Membro Departamento de Clínica Veterinária
Profa. Dra. Noeme Sousa Rocha Membro Departamento de Clínica Veterinária
Profa. Dra. Sônia Terezinha dos Anjos Lopes Membro Departamento de Clínica de Pequenos Animais- UFSM-Santa Maria - RS
Profa. Dra. Luciana Mori Viero Membro Departamento de Estudos Agrários- UNIJUÍ - Ijuí - RS
Data da Defesa: 03 de junho de 2016.
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“Se eu vi mais longe , foi por estar sobre ombros de gigantes”. Isaac Newton
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A profª Dra^ Mary Marcondes e seus orientados, em especial ao Acácio Duarte Teixeira, pela imensa colaboração no projeto, nos auxiliando na coleta de materiais em Araçatuba. A profª Drª Sônia pelos ensinamentos e incentivo desde a época de graduação, momento em que iniciei como estagiária do laboratório de patologia clínica da UFSM. Desde então, esta área segue comigo, fazendo parte da minha carreira docente. Obrigada por estar neste momento importante fazendo parte da minha banca avaliadora. A amiga Luciana pela amizade, transparência, sinceridade e ajuda que sempre me proporcionou. Obrigada por me incentivar a ser mais corajosa, encarar os inúmeros desafios e por estar presente nesta etapa única. As amigas e colegas de viagem a Santa Maria, companheiras de estrada, juntas encaramos as madrugadas de serração, para que pudéssemos realizar as disciplinas na UFSM. A Bruna, uma aluna que me incentivou na pesquisa, e hoje minha colega de projetos, artigos, me acalmando em momentos de angústia. Obrigada por atender meus pedidos de socorro. A Luana, amiga e companheira de viagem, que me acompanhou até São Paulo para a realização do experimento, com uma disposição incrível para encarar essa etapa. Ao Giovani, amigo que me apoiou muito nesta fase, e divide comigo diversos momentos da minha vida. Ao amigo Rogerião, pelas inúmeras informações que chegavam até a mim, pela preocupação da realização da minha matrícula, de créditos concluídos, e da cobrança da definição da data de defesa da minha tese, que foram essenciais nesse período. Aos colegas da Unijuí, pela colaboração e incentivo, em especial ao meu colega de chefia Roberto Carbonera, a Maria Andréia pelas análises histológicas e a Cleusa e José pela elaboração das análises estatísticas. A amiga Cláudia, pelas correções realizadas e sugestões oportunas na minha tese. Aos membros da minha banca examinadora, por aceitarem o convite para participarem da minha defesa contribuindo para meu aprendizado. A FAPESP pelo apoio financeiro do projeto.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores de tamanho, polidispersão e potencial eletrônico da nanoemulsão vazia....................................................................... 19
Tabela 2 - Valores de tamanho, polidispersão e potencial eletrônico da nanoemulsão com ftalocianina de cloro-alumínio........................ 19
Tabela 3 - Medidas obtidas da luz visível de acordo com a área a ser incidida na placa contendo sangue parasitado............................. 20
Tabela 4 - Grupos utilizados com o respectivo tratamento........................... 20
Tabela 5 - Resultados dos exames microscópicos do baço e fígado nos diferentes grupos após 90 dias de inoculação............................. 30
Tabela 6 - Resultados dos exames microscópicos do baço e fígado nos diferentes grupos após 180 dias de inoculação........................... 31
Tabela 7 - Resultados da PCR convencional, aos 180 dias, dos hamsters do grupo inoculado com sangue parasitado com Leishmania infantum chagasi , das amostras de baço, fígado e medula óssea............................................................................................ 35
Tabela 8 - Resultados da PCR convencional, aos 180 dias, dos hamsters do grupo inoculado com sangue tratado com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio, das amostras de baço, fígado e medula óssea........................................................ 35
Tabela 9 - Resultados da carga parasitária/mL, avaliados pela técnica da qPCR, no baço, fígado e medula óssea, de um hamster de cada grupo após 90 dias de inoculação....................................... 37
Tabela 10 - Resultados estatísticos da carga parasitária (/mL) obtida pela qPCR do baço, nos grupos doença (G 2 ) e tratado com AlClPc (G 3 ), irradiada com luz visível por 11 minutos, num comprimento de onda de 630 nm, após 180 dias de inoculação.................................................................................... 38
Tabela 11 - Resultados estatísticos da carga parasitária (/mL) obtida pela qPCR do fígado, nos grupos doença (G 2 ) e tratado com AlClPc (G3), irradiada com luz visível por 11 minutos, num comprimento de onda de 630 nm, após 180 dias de inoculação..................................................................................... 39
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Formas promastigotas (A), e amastigotas em macrófago de canino (B) de Leishmania infantum chagasi ................................ 03
Figura 2 - Ciclo evolutivo no hospedeiro invertebrado (A) e no hospedeiro vertebrado (B), demonstrando as formas amastigotas e promastigotas, no flebotomíneo e na corrente circulatória........... 04
Figura 3 - Espectro de absorção da nanoemulsão contendo ftalocianina de cloro-alumínio 45,89 μM. L-^1 ................................................... 19
Figura 4 - Aparelho Applied Biosystem®^ utilizado para a realização da qPCR............................................................................................ 26 23 Figura 5 - Apresentação do percentual de órgãos com alterações macroscópicas dos grupos........................................................... 29
Figura 6 - Médias da carga parasitária das amostras de órgãos analisadas, obtidas pela análise da qPCR, do grupo doença e tratado após 180 dias de inoculação............................................ 40
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
AlClPc (^) Ftalocianina de cloro-alumínio cm (^) Centímetro cm^2 Centímetro quadrado G Grama ºC Graus celsius IgG Imunoglobulina G IFN- Interferon gama IL Interleucina J/ cm^2 Joule por centímetro quadrado < Menor μL Microlitro μM.L (^) Micromol por litro Mg (^) Miligrama mg/mL Miligrama por mililitro mg.kg-^1 Miligrama por quilograma mL Mililitro mV (^) Milivolt mW Miliwat Min Minuto nm Nanômetro % Percentagem /mL (^) Por mililitro pH (^) Potencial hidrogeniônico Rpm Rotações por minuto TNF Fator de Necrose Tumoral
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SUMÁRIO
Página RESUMO..........................................................................................................xv
- INTRODUÇÃO.................................................................................................... ABSTRACT......................................................................................................xvi
- REVISÃO DE LITERATURA ..............................................................................
- 2.1 Leishmaniose Visceral Canina ..................................................................... - 2.1.1 Etiologia e Patogenia ............................................................................ - 2.1.2 Diagnóstico .............................................................................................
- 2.2 Transfusão sanguínea
- 2.3 Terapia fotodinâmica - 2.3.1 Inativação com ftalocianina associada à luz visível
- OBJETIVOS.....................................................................................................
- 3.1 Geral
- 3.2 Específico
- MATERIAL E MÉTODOS
- 4.1 Animais utilizados - 4.1.1 Caninos - 4.1.2 Hamsters
- 4.2 Coleta de sangue de animal hígido (grupo controle saúde)
- chagasi (grupo controle doença) 4.3 Coleta de sangue de animal infectado com Leishmania infantum
- 4.4 Terapia fotodinâmica - 4.4.1 Aplicação da ftalocianina e incidência da luz visível - 4.4.2 Preparação das amostras dos grupos para inoculação
- 4.5 Inoculação em hamster
- 4.6 Análises laboratoriais - 4.6.1 Diagnóstico parasitológico: citopatológico - 4.6.2 Diagnóstico histológico - 4.6.3 Diagnóstico sorológico - 4.6.4 Diagnóstico molecular - 4.6.4.2 PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR)
- 4.7 Análises estatísticas
- RESULTADOS E DISCUSSÃO
- 5.1 Avaliação clínica
- 5.2 Diagnóstico parasitológico: citopatológico
- 5.3 Diagnóstico patológico - 5.3.1 Análise macroscópica - 5.3.2 Análise histológica
- 5.4 Diagnóstico sorológico - 5.4.1 Teste de Aglutinação Direta xiv
- 5.5 Diagnóstico molecular - 5.5.1 PCR convencional - 5.5.2 PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR)
- 6 CONCLUSÃO
- 7 BIBLIOGRAFIA
- 8 TRABALHO CIENTÍFICO
- ANEXO A...........................................................................................................
- ANEXO B...........................................................................................................
- ANEXO C...........................................................................................................
xvi
BECK, C. Effects of visible light associated with chloro-aluminium phthalocyanine on the inactivation of Leishmania infantum chagasi in dog blood. Botucatu, 2016, 88p. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
Visceral Leishmaniasis is an emerging zoonotic infectious disease that requires mandatory reporting. In Brazil, it is caused by the protozoan Leishmania infantum chagasi , with dogs as main reservoir ( Canis familiaris ). Blood transfusion is frequently used in clinical routine, however it is associated with the transmission of infectious diseases. The aim of this study was to evaluate the effects of treatment with visible light associated with chloro-aluminium phthalocyanine on the inactivation of Leishmania infantum chagasi in canine blood, when inoculated in hamsters ( Mesocricetus auratus ). Three experimental groups consisted of six hamsters each. The control group received blood negative for L. infantum chagasi , the diseased group was inoculated with blood infected with L. infantum chagasi , and the treatment group received infected blood previously subjected to therapy with visible light associated with chloro- aluminium phthalocyanine. The animals were observed for 180 days and then subjected to clinical evaluation. Then the animals were anesthetized for blood collection through intracardiac puncture and were euthanized. The blood was placed into microtubes and the serum was separated by centrifugation and stored at -30 ° C until the direct agglutination test was performed. After, liver and spleen collection was performed to histopathological examination. Another part of these organs and bone marrow were placed in tubes DNase and RNase free, and frozen at -30°C until the PCR and qPCR were performed. Imprints of liver and spleen were performed on slides for microscopy to verify the presence of amastigotes of the parasites. After 180 days the animals showed no clinical signs and serologic and parasitological tests were negative. During pathological examination, some animals showed hepatomegaly and splenomegaly; under microscopic analysis, any tissue showed amastigote forms of the parasite. In the PCR evaluation of spleen and bone marrow, all hamsters from diseased and treated groups showed amplification of Leishmania infantum chagasi. Results from q-PCR revealed a significant decrease (P <0.01) in the number of parasites in the group inoculated with blood subjected to chloro-aluminium photodynamic therapy, compared to the group inoculated with parasitized blood that had not been subjected to photodynamic therapy. With these results it is possible to conclude that visible light associated with chlorine-aluminum phthalocyanine reduces parasitaemia of Leishmania infantum chagasi in canine blood.
Keywords: canine, visceral leishmaniasis, visible light, chloro-aluminum phthalocyanine.
1. INTRODUÇÃO
A leishmaniose é uma doença infecciosa, zoonótica e de caráter emergente, amplamente distribuída em todo o mundo. No Brasil, esta parasitose ocorre principalmente nas regiões norte, sudeste e nordeste (BRASIL, 2012), porém, atualmente está distribuída em todo o território brasileiro (MARCONDES; ROSSI, 2013). A leishmaniose visceral (LV), também conhecida como Calazar, é uma antropozoonose, causada no país, pela Leishmania chagasi , a qual já foi identificada no homem, cão, gato, canídeos silvestres, marsupiais e roedores (IKEDA et al., 2010). A transmissão ocorre entre os animais e o homem pela picada de flebotomíneos da espécia Lutzomya longipalpis. Já foi descrita a transmissão venérea, transplacentária e por transfusão sanguínea, sendo consideradas até o momento de pouca importância epidemiológica (MARCONDES; ROSSI, 2013). No entanto, Cardo et al. (2006), descreveram que a maioria das transmissões da LV ocorrem por transfusão sanguínea em áreas endêmicas. A leishmaniose é considerada um grave problema de saúde pública, visto que acometem seres humanos atingindo crianças, adultos jovens e pessoas imunossuprimidas e, quando não tratada, pode apresentar letalidade de 95% (ALVES; BEVILACQUA, 2004). O Ministério da Saúde relatou 3. casos confirmados de Leishmaniose Visceral no Brasil, em seres humanos, no ano de 2013 (BRASIL, 2014). A detecção de anticorpos anti-Leishmania utilizando técnicas sorodiagnósticas, constitui um instrumento essencial no diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) (CIARAMELLA; CORONA, 2003), pois os animais doentes desenvolvem principalmente uma resposta imune humoral e produzem altos títulos de IgG anti-Leishmania. As técnicas sorológicas recomendadas atualmente pelo Ministério da Saúde, para o inquérito canino, são a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o Teste Imunoenzimático (ELISA) (BRASIL, 2006). A utilização do teste de aglutinação direta (DAT) no diagnóstico da LVC, também demonstra boa
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Leishmaniose Visceral Canina
2.1.1 Etiologia e Patogenia
As leishmanioses são doenças causadas por protozoários da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania, que acometem o homem e diferentes espécies de mamíferos das regiões tropicais e subtropicais. O agente etiológico da Leishmaniose Visceral (LV) no Brasil é a espécie Lesihmania (L.) chagasi (TASCA et al., 2009). Estes parasitas são transmitidos aos animais e ao homem pela picada de insetos pertencentes a ordem Diptera e família Psychodidae, denominados flebótomos do gênero Lutzomyia longipalpis. Nas Américas Central e do Sul, esta espécie constitui o único vetor eficiente na transmissão da Leishmaniose Visceral Canina (SILVA, 2007). As leishmanias são organismos pleomórficos, ou seja, assumem duas formas evolutivas em seu ciclo de desenvolvimento. A forma promastigota, localizada no interior do intestino do hospedeiro invertebrado (intermediário), se caracteriza por ter um corpo alongado, com duas extremidades afiladas, um núcleo e um cinetoplasto anterior, do qual parte o axonema e então o flagelo. A forma amastigota, encontrada nas células do hospedeiro vertebrado (definitivo), tem aspecto ovalado ou esférico, com núcleo e cinetoplasto do qual parte o axonema, porém, sem flagelo (FORTES, 2004) (Figura 1).
Figura 1- Formas promastigotas (A), e amastigotas em macrófago de canino (B) de Leishmania infantum chagasi.
Fonte: Greene, 2006.
Para ocorrer a inoculação do parasita, as fêmeas infectadas do mosquito realizam o repasto sanguíneo em um hospedeiro vertebrado, liberando as formas promastigotas metacíclicas juntamente com a saliva do inseto (Figura 2A). Na epiderme do hospedeiro, estas formas são fagocitadas por células do sistema fagocítico mononuclear (Figura 2B). No interior dos macrófagos, no vacúolo parasitóforo, diferenciam-se em amastigotas e multiplicam-se intensamente até o rompimento deles, ocorrendo a liberação destas formas que serão fagocitadas por novos macrófagos num processo contínuo. Desta forma ocorre a disseminação via hematógena para outros tecidos ricos em células do sistema mononuclear fagocitário, como linfonodos, fígado, baço e medula óssea (BRASIL, 2006).
Figura 2- Ciclo evolutivo no hospedeiro invertebrado (A) e no hospedeiro vertebrado (B), demonstrando as formas amastigotas e promastigotas, no flebotomíneo e na corrente circulatória.
Fonte: Greene, 2006.
Nos países onde a LV é zoonótica, como é o caso do Brasil, os cães desempenham papel fundamental na epidemiologia do parasita em áreas urbanas, devido a sua relação e proximidade com o homem e ser o único reservatório doméstico (SILVA, 2007; QUEIRÓZ et al., 2010; FARIA; ANDRADE, 2012). Ciaramella et al. (1997) citam que a pele dos cães é a região do corpo que mais manifesta os sinais clínicos, sendo o local onde acontece a primeira interação entre o parasita e o sistema imune deste hospedeiro, além de ser o local onde se encontram grandes quantidades de formas amastigotas deste parasita. Por outro lado, Tafuri et al. (2001) descrevem que cães com sintomatologia típica de leishmaniose e com comprovada infecção por