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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
ASSOCIAÇÃO DE BACTÉRIAS DA FAMÍLIA
Enterobacteriaceae E Clostridium estertheticum COM A
DETERIORAÇÃO “BLOWN PACK” EM CORTES
CÁRNEOS EMBALADOS A VÁCUO
Lívia Mara Felipe
Orientador: Prof. Dr. Oswaldo Durival Rossi Júnior
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária (Medicina Veterinária Preventiva).
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Junho de 2008
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
Felipe, Lívia Mara F315a Associação de bactérias da família Enterobacteriaceae e Clostridium estertheticum com a deterioração “blown pack” em cortes cárneos embalados a vácuo / Lívia Mara Felipe – – Jaboticabal, 2008 xii, 86f. : il. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008 Orientador: Oswaldo Durival Rossi Júnior Banca examinadora: Luiz Augusto do Amaral, Ana Maria Centola Vidal Martins Bibliografia
- carne embalada vácuo 2. clostrídios psicrofílicos 3. deterioração “blown pack” 4. enterobactérias. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:614.31:637.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho primeiramente aos meus pais Marinez José Vitório Felipe e José Olavo Felipe que sempre apoiaram meus estudos e abdicaram dos caprichos da vida para formar suas três filhas com muito esforço, amor e dedicação. Ao meu orientador Prof.Dr.Oswaldo Durival Rossi pela orientação, por depositar sua confiança em mim, por sua compreensão e paciência em ensinar Às minhas irmãs Ludimila Felipe e Letícia Felipe por existirem e por compartilharem comigo os melhores e piores momentos sempre me fortalecendo. A minha avó e segunda mãe Herta José Vitório por ser um exemplo de fortaleza e amor e por transmitir sempre a esperança de que tudo dará certo. Aos meus cunhados Eduardo e Erick pela força e positivismo. À Profª.Drª. Iolanda Nunes, da Universidade Federal de Goiás, por compartilhar seu conhecimento e sabedoria com os alunos da pós-graduação. Ao Prof.Dr. Albenones José de Mesquita por ter me recebido com muito carinho no Centro de Pesquisa em Alimentos da Universidade Federal de Goiás, cedendo seus laboratórios e toda a abertura para a realização deste experimento. Á Ms.Ursula Rauecker Nunes, Ms.Flávia Isabel, Alessandra César, Thiago, Leonardo,Thaís, Giselle, Marcele pelas pessoas maravilhosas que são, pela amizade, bom humor sempre, força e conhecimento me ajudando em tudo o que precisei para realizar este experimento com tranqüilidade. Aos amigos e funcionários do CPA que sempre me apoiaram e me ajudaram de forma direta ou indireta para a realização deste trabalho, Wilson Ricardo, Euzinha, Neuza, Rosângela, Sandra, Profa.Cíntia. Às minhas companheiras de república e amigas Letycia Goulart, Luciana Pacheco, Denyse Goulart, Iana Marinho, Tana Rosa, Daniela Guerra, Maria, Carol, Dani e Ryla pelo espírito da amizade, por substituírem minha família nas horas de saudade, de alegria, de tristeza, agradeço-as pela companhia, pela atenção, paciência, por serem
tantas vezes minha família, por serem tantas vezes irmãs e amigas, pelos banquetes servidos na Casa Verde e por existirem, Graças a Deus! Aos meus amigos Renato Maluta e Najara Silva pela sinceridade e por serem além de amigos, cúmplices de um tempo muito bom. Agradeço a minha amiga Cárita pela amizade fiel e pelo apoio que nunca deixou faltar durante toda a caminhada. Ao Prof.Dr. João Ademir pelo auxílio estatístico. Ao CNPq pela bolsa. A todos aqueles que me ajudaram de alguma forma para a concretização deste trabalho e a Deus que nunca me abandonou em nenhum momento.
i
SUMÁRIO
Assunto (^) Página
Lista de Figuras................................................................................... iii
Lista de Tabelas.................................................................................. iv
Lista de Quadros................................................................................. v
Resumo............................................................................................... vi
Abstract............................................................................................... vii
1.INTRODUÇÃO................................................................................. 1
- REVISÃO DE LITERATURA........................................................... 2
2.1 Deterioração da carne bovina fresca embalada a vácuo.............. 2
2.1.1 Deterioração “blown pack”..................................................... 7
2.2 Enterobactérias.......................................................................... 10
2.2.1 Principais gêneros da família Enterobacteriaceae ..................... 12
2.3 Bactérias ácido-láticas................................................................... 16
2.4 Clostrídios psicrofílicos.................................................................. 20
3.OBJETIVOS..................................................................................... 23
3.1 Objetivo geral................................................................................ 23
3.2 Objetivos específicos.................................................................. 23
- MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 24
4.1 Amostragem............................................................................... 24
4.1.1 Colheita das amostras............................................................. 25
4.2 Preparo das diluições das amostras para as contagens de enterobactérias e bactérias ácido-láticas............................................
ii
5.2 Caracterização dos microrganismos da família Enterobacteriaceae.............................................................................
- 4.3 Contagem e caracterização da família Enterobacteriaceae
- 4.3.1 Provas confirmatórias.................................................................
- 4.3.2 Identificação dos membros da família Enterobacteriaceae........
- 4.4 Contagem de bactérias ácido-láticas............................................
- 4.5 Pesquisa de Clostridium estertheticum e Clostridium gasigenes..
- 4.5.1 Preparo das amostras e extração do DNA genômico................
- 4.5.2 Avaliação da qualidade e quantificação do DNA extraído..........
- 4.5.3 Primers, mistura da reação e condições de amplificação..........
- 4.5.4 Confirmação da identidade molecular dos produtos de PCR.....
- 4.6 Análise estatística dos resultados..............................................
- RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................
- 5.1 Contagem de enterobactérias
- 5.3 Contagem de bactérias ácido-láticas........................................
- 5.4 Detecção de Clostridium estertheticum e Clostridium gasigenes.
- 5.5. Confirmação da identidade dos produtos da amplificação........
- CONCLUSÕES...............................................................................
- CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................
- REFERÊNCIAS..............................................................................
- Anexos.................................................................................................
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1. Populações de enterobactérias (UFC/mL do exsudato cárneo) em amostras de carne sem a deterioração “blown pack” (não deterioradas) e carnes com a deterioração “blown pack” (carnes deterioradas) e sua distribuição em populações de até 10 5 UFC/mL do exsudato, populações entre 10^5 e 10^7 UFC/mL e populações maiores que 10^7 UFC/mL.................................................................... 36 2. Resultado da identificação de 270 colônias de enterobactérias isoladas de carne bovina embaladas a vácuo e mantidas sob refrigeração que apresentavam a deterioração “blown pack..................................................................................................... 39 3. Resultado da identificação de 270 colônias de enterobactérias isoladas de carne bovina embaladas a vácuo e mantidas sob refrigeração sem a deterioração “blown pack”.................................................................................................... 40 4. Populações de bactérias ácido-láticas (UFC/mL do exsudato cárneo) em amostras de carne sem a deterioração “blown pack” (não deterioradas) e carnes com a deterioração “blown pack” (carnes deterioradas) e sua distribuição em populações de até 10 5 UFC/mL do exsudato, populações entre 10 5 e 107 UFC/mL e populações maiores que 10^7 UFC/mL................................................. 41 5. Número de amostras de carne refrigeradas embaladas a vácuo positivas e negativas para a presença de Clostridium estertheticum a partir do exsudato cárneo de amostras de carne sem a deterioração “blown pack” (não deterioradas) e carnes com a deterioração “blown pack” (carnes deterioradas)................................ 46 6. Número de amostras de carne refrigeradas embaladas a vácuo positivas e negativas para a presença de Clostridium gasigenes a partir do exsudato cárneo de amostras de carne sem a deterioração “blown pack” (não deterioradas) e carnes com a deterioração “blown pack” (carnes deterioradas)................................................................. 46
v
LISTA DE QUADROS
Quadro Página
1. Perfil bioquímico das espécies e gêneros de enterobactérias pesquisados segundo estabelecido no “Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology” .................................................................... 29 2. Composição das reações de PCR e concentrações finais dos reagentes, segundo os pares de primers utilizados, para detecção do Clostridium estertheticum e Clostridium gasigenes....... ................. 33 3. Características dos programas de amplificação para o Clostridium estertheticum (RFP/RRP) e para o Clostridium gasigenes (16DBF/16DBR)................................................................. 33
vii
ASSOCIATION OF BACTERIA OF THE FAMILY Enterobacteriaceae AND Clostridium estertheticum WITH " BLOWN PACK " SPOILAGE IN VACUUM- PACKED CUTS OF MEATS.
ABSTRACT- The "blown pack" spoilage is characterised by abundant gas production, leading to complete gross distention pack during refrigerated storage. When the packaging is opened, there is an unpleasant smell, lightly fecal. The gas present in the package is composed of carbon dioxide and hydrogen and also of several butyric types of metabolism fermentation. The purpose of this experiment was to determine possible causes of this spoilage type, quantifying the populations of bacteria of the family Enterobacteriaceae , and characterizing them in the major genera and species found, the number of lactic acid bacteria, the frequency of Clostridium estertheticum and Clostridium gasigenes in meat proper for consumption and meat which showed the "blown pack" spoilage. In order to enumerate and identify the members of the Enterobacteriaceae family , and to enumerate the lactic acid bacteria the procedure was classical microbiological techniques. However to search the C. estertheticum and C. gasigenes the procedure was molecular biology techniques. The microorganisms of the family Enterobacteriaceae and lactic acid bacteria were present in large populations and in greater numbers in meat with "blown pack" spoilage. The species which were found more often was the Hafnia alvei. Samples of "blown pack“ spoilage had greater positive features for C. estertethicum than samples not damaged. There was no statistical difference of positive features for the presence of C. gasigenes between samples of "blown pack" spoilage and not damaged meat. The main way to control this spoilage is the prevention of contamination of meat by fecal material.
Key words: vacuum packed meat, psychrophilic clostridial, "blown pack" spoilage, enteric bacteria.
1. INTRODUÇÃO
A bovinocultura brasileira conta com um rebanho aproximado de 170,2 milhões de cabeças de gado e destes, 46,9 milhões (27,6% do rebanho) são abatidos anualmente, só perdendo para a China com 49,9 milhões (35,9% do rebanho) abatidos/ano (ANUALPEC, 2005). Em 2004 o Brasil exportou 1.202.170 toneladas equivalente-carcaça* de carne bovina “in natura” resfriada para países como o Chile, Alemanha, Itália, Suécia, países do Reino Unido e Países Baixos, Rússia, Egito, Espanha, Arábia Saudita e outros, o equivalente a 1.963,0 milhões de dólares. As expectativas são que as exportações aumentem para os próximos anos. Também em 2004, o Brasil não somente se tornou o maior exportador mundial de carnes (aves, suínos e bovinos) como abriu uma vantagem de mais de um milhão de toneladas sobre os Estados Unidos, historicamente o líder nesse comércio. A competitividade do segmento de carnes no Brasil está solidamente estabelecida no tripé disponibilidade de matérias-primas (competitividade em custos) X estrutura produtiva X ambiente (ANUALPEC, 2005). O Brasil de fato conquista com méritos o destaque no mercado de proteínas animais do mundo, mas manter-se na posição não é tarefa fácil, uma maior expansão neste segmento de mercado tem sido dificultada pela redução da vida útil decorrente de alterações fisiológicas, bioquímicas e microbiológicas dos produtos de origem animal (BORGES & FREITAS, 2002). Muitos são os problemas enfrentados pelas indústrias frigoríficas para manter estes mercados, logo as perdas devido à deterioração microbiana dos alimentos devem ser consideradas. A exata configuração das perdas econômicas totais com a deterioração dos alimentos é desconhecida, mas as raras figurações avaliadas indicam que constitui em uma enorme perda financeira. Estima-se que um quarto da oferta de alimento do mundo é perdido somente por atividade microbiana (ANONYMOUS, 1985). A deterioração dos alimentos é um problema econômico em todo o mundo, e ainda não está controlada a despeito das modernas tecnologias e amplas técnicas de preservação disponíveis, como as embalagens a vácuo. *Equivalente carcaça= Carne sem osso x 1,3 + Carne com osso Fonte : Instituto FNP/SECEX/DECEX
foram desenvolvidos para a detecção de microrganismos patogênicos (van der VOSSEN & HOFSTRA, 1996; HUIS IN’T VELD et al., 1994; FUNG, 1994). Essas técnicas também podem ser aplicadas para a fácil detecção de organismos deteriorantes específicos. Entretanto, devem-se conhecer a fundo as populações predominantes e sua atuação em cada tipo específico de deterioração antes que estas técnicas possam ser usadas (HUIS IN’T VELD et al., 1996). A microbiota que coloniza cada alimento em particular depende das características do produto e de como este é processado e estocado. Os parâmetros que afetam a proliferação dos microrganismos nos alimentos podem ser categorizados em quatro grupos: (1) parâmetros intrínsecos; (2) parâmetros extrínsecos; (3) modo de processamento e preservação, e (4) parâmetros implícitos. A combinação de todos os efeitos dos parâmetros geralmente é maior que o efeito percebido de cada parâmetro individual (MOSSEL et al.,1995). Os parâmetros intrínsecos são físicos, químicos e propriedades estruturais inerentes ao próprio alimento. Os mais importantes são atividade de água, acidez, potencial de oxi-redução, disponibilidade de nutrientes e a presença de substâncias antimicrobianas naturais. Já os parâmetros extrínsecos são fatores ambientais inerentes aos locais onde os alimentos são estocados, notavelmente temperatura, umidade e composição atmosférica. Quanto ao modo de processamento e estocagem consideram-se o uso de tratamentos químicos e físicos que geralmente resultam em mudanças nas características dos produtos, além de determinar a microbiota associada a ele (HUIS IN’T VELD et al., 1996). Já os parâmetros implícitos são resultantes do desenvolvimento de microrganismos, que podem ter efeito sinérgico, por exemplo, produção ou disponibilidade de nutrientes essenciais para o desenvolvimento de certos grupos de microrganismos, ou antagônico, como mudanças de pH, potencial de oxi-redução e atividade de água que podem inabilitar o desenvolvimento de organismos menos tolerantes a esses fatores inibitórios (STILES & HASTINGS, 1991; KIM, 1993; MOSSEL et al., 1995; HUIS IN’T VELD, 1996; ABEE et al., 1996).
A deterioração é mais rápida e evidente em alimentos proteináceos como a carne bovina, de frango, peixe, frutos do mar, leite e alguns produtos de laticínio. Estes alimentos são altamente nutritivos, possuem pH neutro ou levemente ácido e uma elevada umidade que permite o desenvolvimento de uma ampla gama de microrganismos (HUIS IN’T VELD,1996; CARVALHO, 2001; BORGES & FREITAS, 2002). Após o abate e evisceração, muitas carcaças continuam com suas características microbiológicas inalteradas (ANDERSEN, 1995). É esperado que um animal saudável tenha a parte interna do músculo livre de contaminação. Para, NOTTINGHAM, 1982, bem como, DICKSON & ANDERSON (1992), o tecido muscular bovino, logo depois do abate, é praticamente estéril. Entretanto os microrganismos podem migrar da superfície da carcaça para os músculos internos como o perimísio (GUERRERO & TAYLOR, 1994). GILL & NEWTON (1978), verificaram que a maior parte da microbiota da carne in natura encontra-se na superfície da carcaça. Muitos autores afirmam que a contaminação da carne ocorre, inevitavelmente, durante os processos que conduzem á sua obtenção e este é o principal determinante da deterioração (DAINTY & MACKEY, 1992; HOLLEY & GILL, 2005; ERCOLINE et al., 2006). TOMPKIN et al. (2001), relatam que a microbiota superficial de carcaças recém abatidas encontra-se entre 10 2 a 10^3 bactéria/cm 2 , sendo encontrada preferencialmente, bactérias mesófilas, originárias do trato gastrointestinal e da superfície externa (pele) dos animais. Segundo FLISS et al. (1991), muitas enfermidades de origem alimentar são atribuídas ao consumo de carne contaminada por microrganismos patogênicos. A microbiota da carne crua é muito heterogênea, originária do próprio animal, solo, água, manipuladores e equipamentos durante o processamento. Muitos são os microrganismos que podem ser encontrados na carne bovina como a Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli , Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Achoromobacter spp., entre outros (NORTJÉ & NAUDÉ, 1981; PARDI et al., 2001).
Atualmente na América do Norte cerca de 85% de carnes frescas e a maioria das carnes processadas são embaladas sob vácuo ou distribuídas embaladas utilizando embalagens de atmosfera modificada contendo um ou mais gases (JAY et al_._ , 2005). A embalagem a vácuo é o método de escolha para estocar e distribuir grandes pedaços de carne resfriada ou cortes comerciais. Nas embalagens a vácuo, o oxigênio residual é rapidamente consumido (a níveis abaixo de 1%) pelo tecido ou respiração microbiana, e aumenta a taxa de CO 2 para até 20%. Condições completamente anaeróbicas são raras de se conseguir, todos os filmes comercialmente utilizados apresentam uma taxa de permeabilidade. A proporção relativa de dióxido de carbono e hidrogênio varia de acordo com sua produção ou como resultado da difusão do hidrogênio através do filme da embalagem e absorção de dióxido de carbono da carne. Durante a estocagem, bactérias aeróbicas Gram negativas são substituídas por bactérias Gram positivas de multiplicação lenta (DAINTY et al., 1983; DAINTY & MACKEY, 1992). O exemplo disto são as bactérias ácido-láticas, que têm sido identificadas como microrganismos deteriorantes de carne bovina e de frango embalados a vácuo, tendo sido frequentemente isoladas destes tipos de produto por serem tolerantes ao CO 2 e a baixas temperaturas (DAINTY et al., 1983; BORCH et al., 1996). A microbiota típica da carne bovina embalada a vácuo consiste em bactérias ácido-láticas e enterobactérias em níveis de 10 8 e 10^6 UFC/g, respectivamente (BEEBE et al., 1976; NEWTON et al., 1978; SCHILLINGER et al.,1987; SUTHERLAND et al., 1975; YOST & NATTRESS, 2002). Segundo NOTTINGHAM (1982) nos Estados Unidos da América os supermercados têm particular importância na deterioração da carne por ação microbiana, devido à aplicação adequada da cadeia do frio. A deterioração caracterizada por formação de gás no interior da embalagem e alteração no odor que se torna azedo e levemente pútrido, normalmente é detectada quando estão presentes microrganismos deteriorantes em níveis de 10 8 UFC a 109 UFC/g do alimento (BORCH et al., 1996).
Várias espécies de enterobactérias, lactobacilos e estreptococos demonstraram capacidade em descarboxilar aminoácidos produzindo aminas biogênicas como, histamina, tyramina, putrescina e cadaverina (STRATTON et al., 1991). Durante o tempo de vida de prateleira dos produtos cárneos embalados a vácuo pode ocorrer o acúmulo de aminas biogênicas produzidas tanto por microrganismos patogênicos como por deteriorantes (SMITH et al., 1993). MCCABE (1986), SULLIVAN & SHULMAN (1984) verificaram que a excessiva ingestão de histamina e tyramina são responsáveis por causar distúrbios fisiológicos em humanos, mais notadamente dores de cabeça, vermelhidão e hipertensão aguda. Indivíduos com problemas respiratórios, coronarianos e estomacais, hipertensos ou com deficiência de vitamina B12 são particularmente pessoas de risco, por serem sensíveis a doses bem menores de aminas biogênicas (BARDÓCZ, 1995). SMITH et al. (1993) e DAINTY et al. (1986) mostraram que a produção das aminas biogênicas inicia-se quando a população bacteriana atinge níveis de 6 Log (^10) UFC/cm 2 e que enterobactérias e principalmente Hafnia alvei e Serratia liquefaciens são as bactérias que mais acumulam diaminas em carne embalada a vácuo refrigeradas.
2.1.1 Deterioração “blown pack”
A deterioração por tufamento da embalagem de carnes refrigeradas embaladas a vácuo, mais conhecida como deterioração “blown pack”, é caracterizada por abundante produção de gás, induzindo a completa distensão da embalagem durante o processo de estocagem sob refrigeração como mostra a figura 1. Quando a embalagem é aberta, há um odor desagradável de queijo/queijaria com ou sem coloração sulfurosa aparente. O gás presente na embalagem é composto por dióxido de carbono e hidrogênio e por vários tipos butíricos do metabolismo fermentativo (JONES & WOODS, 1986). A presença de ésteres butíricos, ácido butírico e butanol na composição gasosa de todas as amostras é o que caracteriza o odor de queijo neste tipo de deterioração (DAINTY et al., 1989). Entretanto, um outro odor encontrado em embalagens tufadas examinadas por DAINTY et al. (1989) foi um odor “levemente fecal”.
