ARÁDIA GONZALES DE OLIVEIRA FERNANDES
ATIVIDADE CICATRIZANTE DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS RICOS EM
PROLINA E ARGINA EM MODELO DE ESCISÃO CUTÂNEA DO DORSO DE Mus
musculus swiss
Ouro Preto – MG, maio de 2018
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arádia gonzales de oliveira fernandes atividade cicatrizante ..., Esquemas de Crescimento
Assim, a capacidade de aumento na velocidade de cicatrização da ferida assim ... duplamente fosforilado e degradado pelo proteassoma 26S, o que libera o ...
Tipologia: Esquemas
2022
1 / 73
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ARÁDIA GONZALES DE OLIVEIRA FERNANDES
ATIVIDADE CICATRIZANTE DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS RICOS EM
PROLINA E ARGINA EM MODELO DE ESCISÃO CUTÂNEA DO DORSO DE Mus musculus swiss
Ouro Preto – MG, maio de 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
ATIVIDADE CICATRIZANTE DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS RICOS EM
PROLINA E ARGINA EM MODELO DE ESCISÃO CUTÂNEA DO DORSO DE Mus musculus swiss
AUTOR: Arádia Gonzales de Oliveira Fernandes ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade
Ouro Preto – MG, maio de 2018
Dissertação submetida ao programa de Pós- Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia, área de concentração: Genômica e Proteômica.
Fernandes, A.G.O. Ata de Defesa
iii
Fernandes, A.G.O. Laboratório/Auxílio
iv
Esta pesquisa é resultado de um trabalho realizado no LABORATÓRIO DE ENZIMOLOGIA E PROTEÔMICA – ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
Fernandes, A.G.O. Índice
vi
4.4- Análise estatística..............................................................................................
5. Resultados e discussão ........................................................................................................
5.1 – Síntese, purificação e confirmação da estrutura dos peptídeos .......................... .. 5.2 - Análise da atividade cicatrizante dos análogos do PR-39 em modelo de excisão cutânea de Mus musculus ....................................................................................... 5.3 – Análise do mecanismo de internalização do PR-11............................................
6. Conclusões ............................................................................................................................ 7. Referências bibliográficas ..................................................................................................
Fernandes, A.G.O. Resumo
vii
RESUMO
A pele é o maior órgão do corpo humano e possui funções cruciais na manutenção da homeostase assim como na saúde geral. As feridas são o resultado de lesões na pele e podem ser causadas por queimaduras, insetos, agentes microbianos, diabetes, isquemia e trauma. A cura de feridas é um processo essencial para reestabelecer a barreira protetora que defende o corpo do ambiente. Tipicamente, a cicatrização aguda de feridas é um processo bem organizado que leva a um reparo tecidual previsível, com plaquetas, queratinócitos, células imunológicas, células microvasculares e fibroblastos desempenhando papéis importantes na restauração da integridade tecidual. A cicatrização é um processo evolutivo conservado entre as espécies e abrange processos distintos, entretanto sobrepostos espacialmente e temporalmente que incluem a hemostasia/coagulação, inflamação, proliferação celular/reepitelização e a remodelação da matriz extracelular. Proteínas possuem um papel fundamental em todos os processos biológicos, sendo o equilíbrio finamente regulado entre a síntese e degradação fator decisivo na homeostase celular. O peptídeo natural da família das cateciclinas PR- (RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP) é um peptídeo natural rico em prolina e arginina secretado por macrófagos que teve sua capacidade de inibir a atividade catalítica do proteassoma 20S demonstrada assim como capacidade anti-inflamatória, através da inibição da degradação de fatores IκB, e angiogênica pela inibição da degradação de HIF- 1α. Em estudos anteriores, foi demonstrado uma atividade inibitória sobre o proteassoma assim como uma atividade angiogênica de análogos ao PR-39. A análise do resultados da área da ferida, demonstra aumento da velocidade cicatrizante para o PR-11 e F-12 no décimo dia na concentração de 10-5^ M, e no sétimo e décimo dia nas concentrações de 10-4^ M e 10-3^ M. O Bephantol® a 10-4^ M, um cicatrizante clássico com dexpantenol (pré-vitamina B5), foi utilizado como controle positivo. Este apresenta aumento da velocidade de fechamento da ferida apenas no décimo dia de tratamento. Os análogos PR-11 e F12 apresentaram uma presença inferior de exudado indicativo de infecção na concentração avaliada de 10-4^ M a partir do sétimo dia e o controle positivo com Bephantol® 10-4^ M apresentou essa atividade apenas no décimo dia de tratamento. Esses resultados indicam a atividade antimicrobiana apresentada pelos análogos. Assim, a capacidade de aumento na velocidade de cicatrização da ferida assim como a diminuição da infecção das mesmas, torna os análogos PR-11 e F-12 ótimos candidatos a criação de formulação para utilização como cicatrizante.
Fernandes, A.G.O. Lista de Abreviaturas
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
α – alfa β – beta γ – gama κ – kappa μ – micro ºC – graus célsius C8C15 – RRRPRPPCLPRWRPCG C-terminal – carboxil terminal COX-2 – ciclooxigenase- DMF – Dimetilformamida DIPC – Diisopropilcabodiimida DMSO – dimetilsulfóxido F-12 - RRRPRPPYLPRF FGF – Fator de crescimento de fibroblastos FGFR-1 – Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos 1 FLT1 – gene que codifica o receptor do fator de crescimento endotelial vascular 1 g – grama HIF-1α – fator induzível por hipóxia 1 alfa hnRPN D – Ribonucleoproteína nuclear heterogênia D IκB – inibidor de kappa B IκBα – inibidor de kappa B alfa ICAM-1 – Molécula de Adesão Intercelular- IL-6 – interleucina seis iNOS – Óxido nítrico sintase indutível INTER – GCGKRK INTER-fluo – CGKRK-carboxifluoresceína KCl – cloreto de potássio kD – kilo daltons kV – kilo volts L – litro m – mili
Fernandes, A.G.O. Lista de Abreviaturas
x
M – molar min – minuto MgSO4 – sulfato de magnésio m/z – massa/carga M1 – classicamente ativados M2 – alternativamente ativados NaCl – cloreto de sódio Na2HPO4 – fosfato dissódico NFκB – Fator Nuclear kappa B N-terminal – amino terminal PC – computador PR-11 – RRRPRPPYLPR PR-11-fluo – RRRPRPPYLPR-carboxifluoresceína PR-39 – RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP ROS – espécies reativas de oxigênio TFA – Ácido Trifluoro Acético TNFα – Fator de Necrose Tumoral Alfa UTR – região não traduzida UV – ultra violeta VCAM-1 – Molécula de Adesão Vascular Celular- VEGF – fator de crescimento endotelial vascular VEGFR-1 – Receptor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular 1
Fernandes, A.G.O. Lista de Figuras
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: estrutura da pele (epiderme associada a derme e ao tecido subcutâneo) (adaptado de Kumar et al. , 2012)...................................................................................................................... Figura 02: Exemplificação das respostas a diferentes intensidades de dano (superficial e profundo) e a forma de cura da lesão (regeneração e cicatrização) (adaptado de Kumar et al. , 2012)........................................................................................................................................... Figura 03: Exemplificação entre as quatro fases da reparação tecidual, homeostasia, inflamação, proliferação e remodelamento (adaptado de Maynard, 2015).................................. Figura 04: Esquema de uma ferida perto do final do estágio inflamatório e o início do estágio proliferativo ilustrando a interação entre as diferentes células e promotores envolvidos (Singer & Clarck, 2005 )........................................................................................................................... Figura 05: Ilustração demonstrando as funções que possivelmente são exercidas através das integrinas dos queratinócitos. (1) indicando a reepitelização mediada pela proliferação de queratinócitos, remodelamento da matriz extracelular e migração. (2) sinalização parácrina da epiderme para células endoteliais vasculares promotoras da angiogênese. (3) sinalização parácrina da epiderme para outras células presentes na ferida, incluindo células inflamatórias (células azuis) e fibroblastos/miofibroblastos que promovem a contração da ferida (células verdes). A ferida está indicada pelo gradiente vermelho-rosa (Adaptado de DiPersio et al. , 2016)........................................................................................................................................... Figura 06: Estrutura do proteassoma 20S em eucariotos exemplificando a conformação heptamérica das subunidades α e β, destacando-se as subunidades catalíticas 1, 2 e 5, responsáveis pelas atividades proteolíticas semelhantes às de caspase, tripsina e quimotripsina, respectivamente (Jung et al. , 2009)........................................................................................... Figura 07 : Diferentes sítios de ligação de inibidores do proteassoma. O inibidor reversível bortezomib e os inibidores irreversíveis carfilzomib, ONX 0192 e NPI 0052 (salinosporide A) se ligam diretamente à subunidade proteolítica β5. A cloroquina interage com a interface entre as subunidades α e β. O peptídeo PR-39 liga-se às subunidades α, o que dificulta a interação de partículas regulatórias como o 19S (Ruschak et al. , 2011)......................................................... Figura 08 : Regulação do fator de transcrição NFκB pelo proteassoma. O inibidor IκB é duplamente fosforilado e degradado pelo proteassoma 26S, o que libera o fator NFκB, formado pelas subunidades p50 e p65, que dispara uma cascata de transcrição de diversos genes (VCAM:
Fernandes, A.G.O. Lista de Figuras
xiii
Vascular Cell Adhesion Molecule ; ICAM: Intercellular Adhesion Molecule ) (adaptado Jung et al. , 2009)................................................................................................................................... Figura 09: Estrutura 3D dos peptídeos sintetizados PR-11 (1), F-12 (2) e C8C15 nos formatos Ribbons (A) e Wireframe (B) (Modificado de Freitas, 2013)..................................................... Figura 10: Atividade de inibição do proteassoma 20S pelos peptídeos sintéticos PR-11, F-12 e C8C15 (Modificado de Freitas, 2013)....................................................................................... Figura 11: Atividade angiogênica dos peptídeos sintéticos PR-11, F-12, C8C15 e controle positivo com estradiol em relação ao controle negativo com salina. As estrelas destacem os grupos com atividade superior ao controle positivo com estradiol (Modificado de Freitas, 2013)......................................................................................................................................... Figura 12: Perfil cromatográfico em sistema HPLC dos peptídeos PR-11, F-12, C8C15 e INTER. Foi utilizado gradiente de acetonitrila com TFA 0,1% de 20 a 60% em 30 minutos com fluxo de 1mL/min (fase estacionária: coluna C18 - 250 mm x 4,6mm - Shim-pack CLD-ODS). A seta indica o componente principal da eluição que foi utilizado para a caracterização em espectrômetro de massas........................................................................................................... Figura 13: Espectro de massas obtido em espectrômetro Q-Exactive electrospray dos peptídeos PR-11, F-12, C8C15 e INTER. Os picos destacados apresentam a relação massa/carga ( m/z ) da massa molecular esperada. As massas teóricas foram indicadas abaixo dos espectros.............. Figura 14: Locais de excisão cutânea no dorso de Mus musculus swiss..................................... Figura 15: Análise da área da ferida do grupo controle negativo com salina e dos grupos tratados com os peptídeos sintéticos PR-11, F-12 e C8C15 nas concentrações de 10-5^ M, 10-4^ M e 10-3^ M. As imagens dos dias 0, 3, 7, 10 e 14 foram capturadas com microscópio digital e analisadas com o programa Image J®. Os grupos com diferença estatística em relação ao controle negativo foi destacado com um seta azul..................................................................... Figura 16: Análise da área da ferida do grupo controle negativo com salina e positivo com Bephantol® 10-4^ M assim como dos grupos tratados com os peptídeos sintéticos PR-11 e F- na concentração de 10-4^ M. As imagens dos dias 0, 3, 7, 10 e 14 foram capturadas com microscópio digital e analisadas com o programa Image J®. Os grupos com diferença estatística em relação ao controle negativo foi destacado com um seta...................................................... Figura 17: Análise semiquantitativa do fechamento relativo da ferida do grupo controle negativo com salina e positivo com Bephantol® 10-4^ M assim como dos grupos tratados com os peptídeos sintéticos PR-11 e F-12 na concentração de 10-4^ M. As imagens dos dias 0, 3, 7, 10 e 14 foram capturadas com microscópio digital e as análises realizadas por três pesquisadores
Fernandes, A.G.O. Lista de Tabelas
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 : Lista dos peptídeos utilizados no presente estudo e suas respectivas sequências de aminoácidos (a carboxifluoresceína foi abreviada como ‘‘fluo’’)............................................. Tabela 02: Peptídeos sintéticos PR-11, F-12, C8C15 e INTER e suas respectivas sequências e massas teóricas obtidas pela ferramenta ExPASy – Compute PI/Mw tool em unidades de massa atômica (u.m.a)..........................................................................................................................
Fernandes, A.G.O. Introdução
1. Introdução
Fernandes, A.G.O. Introdução
3
manifestando-se parcialmente através de cicatrizes fibróticas (Figura 02) (Gurtner et al. , 2008; Takeo, Lee & Ito, 2015; Erickson et al. , 2016; Qiang et al. , 2017).
Figura 02: Exemplificação das respostas a diferentes intensidades de dano (superficial e profundo) e a forma de cura da lesão (regeneração e cicatrização) (adaptado de Kumar et al. , 2012).
As feridas são o resultado de lesões na pele e podem ser causadas por queimaduras, insetos, agentes microbianos, diabetes, isquemia e trauma (Moghadam et al. , 2017). A cura de feridas é um processo essencial para reestabelecer a barreira protetora que defende o corpo do ambiente. Tipicamente, a cicatrização aguda de feridas é um processo bem organizado que leva a um reparo tecidual previsível, com plaquetas, queratinócitos, células imunológicas, células microvasculares e fibroblastos desempenhando papéis importantes na restauração da integridade tecidual, o que é essencial para a redução do risco de contaminação bacteriana, inibição da perda de água e supressão da formação de cicatrizes que possam afetar a função do tecido. Um balanço coordenado entre a resposta imune do organismo e a proliferação e diferenciação de células epiteliais é essencial para o funcionamento da pele como barreira assim como na sua reparação normal (McGee et al. , 2013; Zhou et al. , 2013; Nelson et al. , 2013; Celli et al. , 2016; Lanial et al. , 2017; Qiang et al. , 2017; Yang et al. , 2017).
Fernandes, A.G.O. Introdução
4
A cicatrização de feridas é um processo evolutivo conservado entre as espécies e abrange processos distintos, entretanto sobrepostos espacialmente e temporalmente que incluem a hemostasia/coagulação, inflamação, proliferação celular/reepitelização e a remodelação da matriz extracelular (Figura 03) (Martin, 1997; Gurtner et al. , 2008; Seifert et al. , 2012; Richardson et al. , 2013; Kitano et al. , 2017). Esse evento é controlado pela atividade cruzada de várias citocinas, fatores de crescimento e tipos celulares, incluindo queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais (Gurtner et al. , 2008; Wang et al. , 2012; Moghadam et al. , 2017).
Figura 03: Exemplificação entre as quatro fases da reparação tecidual, homeostasia, inflamação, proliferação e remodelamento (adaptado de Maynard, 2015).
Estudos demostram que, durante esse processo, vários fatores pró-inflamatórios e anti- inflamatórios são produzidos localmente ou sistemicamente, incluindo leptina (Nascimento & Costa, 2006), interleucina 2, interleucina 4, interleucina 6 e fator de crescimento relacionado à insulina 1 como substâncias pró-cicatrizantes, importantes durante os estágios iniciais de cicatrização. Por sua vez adiponectina, interleucina 12, interferon α e interferon γ (MacLeod & Mansbridge, 2016) são liberados como fatores anti-cicatrizantes, importantes durante os estágios mais tardios de cicatrização. Além desses, o fator de necrose tumoral α também é utilizado, entretanto ele possui efeito variado dependendo da sua concentração (Ashcroft et al. , 2012; Lanial et al. , 2017). Logo após uma lesão na pele, o estágio inicial de reparo ou estágio de homeostase é caracterizado pela prevenção da perda excessiva de sangue através da formação das redes de fibrina assim como por desencadear os eventos que culminam com a inflamação local, onde as células imunes residentes, neutrófilos e monócitos, são ativadas e iniciam a infiltração na ferida