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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Mestrado em Medicina Tropical
APLICABILIDADE CLÍNICA DE UM TESTE
IMUNOCROMATOGRÁFICO PARA O DIAGNÓSTICO
RÁPIDO DA HEPATITE A
THELMA FLOSI GOLA
Rio de Janeiro
Março de 2015
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Teste Rápido para Detecção de Anticorpos Anti-HAV em Pacientes Suspeitos de Hepatite A, Notas de aula de Diagnóstico
Um estudo sobre a aplicabilidade do teste rápido para detecção de anticorpos anti-hav em pacientes suspeitos de hepatite a. O estudo analisou resultados de testes rápidos e imunoensaios de micropartículas por quimioluminescência (cmia) em amostras de pacientes confirmados de hepatite a, além de casos suspeitos de hepatites agudas virais, contactantes intradomiciliares e indivíduos que realizaram os testes como triagem durante surtos. O documento também discute as características dos testes rápidos, incluindo sua aplicabilidade como triagem, inquérito epidemiológico e auxílio no diagnóstico diferencial de pacientes com quadro ictérico agudo.
Tipologia: Notas de aula
2022
1 / 88
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Mestrado em Medicina Tropical
APLICABILIDADE CLÍNICA DE UM TESTE
IMUNOCROMATOGRÁFICO PARA O DIAGNÓSTICO
RÁPIDO DA HEPATITE A
THELMA FLOSI GOLA
Rio de Janeiro
Março de 2015
ii!
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
THELMA FLOSI GOLA
APLICABILIDADE CLÍNICA DE UM TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO PARA O
DIAGNÓSTICO RÁPIDO DA HEPATITE A
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Doença Infecto Parasitária
Orientadores: Drª. Lia Laura Lewis Ximenez de Souza Rodrigues
Dr. Adilson José de Almeida
RIO DE JANEIRO Março de 2015
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ
G61 7 Gola, Thelma Flosi
Aplicabilidade clínica de um teste imunocromatográfico para o diagnóstico rápido da Hepatite A / Thelma Flosi Gola. – Rio de Janeiro,
xiv, 87 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em Medicina Tropical, 201 5. Bibliografia: f. 71 - 83
- Hepatitis A. 2. Rapid test. 3. Diagnoses. 4. Immunocromatography test. I. Título.
CDD 616 .3 623
iv!
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
APLICABILIDADE CLÍNICA DE UM TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO PARA O
DIAGNÓSTICO RÁPIDO DA HEPATITE A
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM MEDICINA TROPICAL
Thelma Flosi Gola
A hepatite A é a causa mais comum de hepatite viral no mundo. A sua transmissão é fecal-oral e está associada com saneamento precário, sendo comum a ocorrência de surtos intradomiciliares. O diagnóstico laboratorial é realizado principalmente por meio da detecção de anticorpos anti-HAV por métodos sorológicos. Apesar de existirem testes rápidos simples e de baixo custo para detecção destes anticorpos, os mesmos não fazem parte da rotina diagnóstica da hepatite A. Estes testes rápidos poderão ser utilizados em inquéritos epidemiológicos, na identificação de pacientes assintomáticos, como instrumento em interrupção de surtos para identificar casos que necessitem de vacinação e no auxílio ao diagnóstico diferencial de quadro ictérico agudo. Neste estudo, foi avaliada a aplicabilidade clínica de um ensaio imunocromatográfico (teste rápido) para o diagnóstico da hepatite A em 238 pacientes com quadro agudo de hepatite e seus contactantes durante o acompanhamento no ambulatório de hepatites virais do IOC/FIOCRUZ. Este estudo foi realizado com dados secundários dos pacientes com diagnóstico confirmado de hepatite A atendidos no Ambulatório de Hepatites Virais do IOC/FIOCRUZ. As informações foram coletadas de prontuários médicos no período de janeiro de 2012 a dezembro de 2012. Os dados analisados são relacionados aos aspectos demográficos, epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. O teste rápido apresentou sensibilidade de 90,4% e especificidade de 96,8% para a detecção do anti-HAV IgM e sensibilidade de 79,2% e especificidade de 94,2% para a detecção do anti-HAV IgG. Após a análise dos resultados, concluímos que, no grupo estudado, a colúria foi a principal manifestação clínica observada, seguida de icterícia e hipocolia fecal; a acurácia do teste rápido mostrou que o método tem elevada sensibilidade e especificidade para detecção de anti-HAV IgM podendo ser utilizado com teste inicial de triagem e que o melhor período para a utilização do teste rápido como triagem de quadro suspeito de hepatite A é entre o 8a^ e o 15o^ dia após o início da icterícia. !
!
vi!
“O!correr!da!vida!embrulha!tudo.! A!vida!é!assim:!esquenta!e!esfria,!aperta!e!daí!afrouxa,!sossega!e!depois!desinquieta.! O!que!ela!quer!da!gente!é!sempre!coragem.”! !
Guimarães!Rosa!
vii!
Dedico!esse!estudo!à!minha!família:!! meus!pais,!minha!irmã!e!minha!sobrinha,!que!sempre!estiveram!ao!meu!lado!me!
incentivando!e!me!apoiando.!
ix!
Aos meus amigos infectologistas Andrea Maria de Assis Cabral e Jadir
Rodrigues Fagundes Neto, que sempre estiveram ao meu lado na incansável busca
pelo conhecimento.
Aos amigos da turma de mestrado de DIP, pela cumplicidade, amizade e pela
troca de experiências.
Ao meu amigo Luã Cardoso, que auxiliou na formatação desse trabalho. Aos meus tios Jorge Cardoso e Ivonete Cardoso, que mesmo distantes
sempre estiveram ao meu lado, torcendo pelo meu crescimento profissional.
Ao meu tio Edson ( in memorian ) e toda família Flosi por serem os meus
grandes exemplos não só de conhecimento e cultura, como de generosidade. E em
especial, minha prima Sandra Flosi pelo carinho e auxílio durante a elaboração do
texto.
À minha irmã Carina Flosi Gola e minha sobrinha Luana Gola Alves, minhas
loirinhas, que sempre estiveram ao meu lado nessa caminhada e torceram tanto
pela conclusão dessa dissertação.
Ao meu pai Waldir Lucio Gola, que com a sua alegria e suas preces iluminou
os momentos mais difíceis.
A minha mãe Maria de Lourdes Flosi Gola, que nunca poupou esforços para
auxiliar na elaboração desse estudo. Sempre ao meu lado, me apoiando e
incentivando em todas as fases de minha vida pessoal e acadêmica.
A todos, o meu muito obrigada!
x! !!
Lista de Figuras
Figura 1.
Representação esquemática do genoma do HAV. Fonte: Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais, Ministério da Saúde, Brasil
2
Figura 1.2.1 Representação^ esquemática^ do^ genoma do vírus da hepatite A 4
Figura 1.3.1a
Representação da taxa de imunidade em crianças: quanto mais intensa a cor, maior a taxa de exposição ao HAV
8
Figura 1.3.1b
Representação da taxa de suscetibilidade em adultos: quanto mais escura a cor, maior a proporção de adultos em risco de adquirir hepatite A
9
Incidência de hepatite A por grupo etário e ano e a evolução dos indicadores de vacinação nos Estados Unidos da América entre 1990 e 2006
Figura 1.3.1c 10
Figura 1.3.2a
Distribuição percentual de casos confirmados de hepatite A por região brasileira em 2010
11
Figura 1.3.2b
Taxa de incidência de hepatite A (por 100.000 habitantes) segundo Unidades Federativas de residência, no Brasil, em 2010
12
Figura 1.3.2c
Distribuição percentual de casos confirmados de hepatite A na região Sudeste do Brasil, em 2010
13
Figura 1.6.
Sumário dos eventos sorológicos, bioquímicos e virológicos na hepatite A não complicada 17
Figura 1. Representação esquemática da vacina contra a hepatite A utilizada no Brasil 20
Figura 4.3.1 Testes^ individuais^ para^ a^ detecção^ de anticorpos anti-HAV IgM e anti-AV IgG 27
Figura 4.3.2 Interpretação do resultado do teste rápido para hepatite A 27
xii!
Tabela 5.
Parâmetros laboratoriais inespecíficos disponíveis de indivíduos com hepatite A à primeira consulta no Ambulatório de Hepatites Virais – IOC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, no período de janeiro de 2012 a dezembro de 2012
55
Tabela 5.
Resultados das sensibilidades dos testes rápidos para detecção de anti-HAV IgM em relação ao número de dias do início da icterícia nas amostras dos indivíduos com hepatite A atendidos no Ambulatório de Hepatites Virais – IOC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, no período de janeiro de 2012 a dezembro de 2012
56
Tabela 5.4.
Médias dos valores de DO/CO do IgM pelo métodos CMIA para as diferentes fases do curso clínico da hepatite A.
58
Tabela 5.4.
Médias dos valores de DO/CO do IgG pelo métodos CMIA para as diferentes fases do curso clínico da hepatite A.
58
Tabela 5.5.
Médias de valores de DO/CO para anticorpos anti-HAV IgM para as diferentes leituras de testes rápidos anti-HAV IgM realizados no Ambulatório de Hepatites Virais de janeiro de 2012 a dezembro de 2012
61
Tabela 5.5.
Médias de valores de DO/CO para anticorpos anti-HAV IgG para as diferentes leituras de testes rápidos anti-HAV IgG realizados no Ambulatório de Hepatites Virais de janeiro de 2012 a dezembro de 2012
61
Tabela 5.6.
Acurácia entre os resultados do teste rápido com um ensaio imunoenzimático (CMIA) para detecção de anticorpos anti- HAV IgM em amostras de soro coletadas nos diferentes períodos de acompanhamento de indivíduos com hepatite A atendidos no Ambulatório de Hepatites Virais – IOC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, no período de janeiro de 2012 a dezembro de 2012
63
xiii!
Tabela 5.6.
Acurácia entre os resultados do teste rápido com um ensaio imunoenzimático (CMIA) para detecção de anticorpos anti- HAV IgM em amostras de soro coletadas nos diferentes períodos de acompanhamento de indivíduos com hepatite A atendidos no Ambulatório de Hepatites Virais – IOC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, no período de janeiro de 2012 a dezembro de 2012
64
xv!
LAHEP – Laboratório de Hepatites Virais
mg – miligrama
ml – mililitro
MS – Ministério da Saúde
NC – Não Codificante
nm – nanômetro
OMS – Organização Mundial da Saúde
PCR – Polymerase Chain Reaction
RJ – Rio de Janeiro
RNA – Ribonucleic Acid
S – Sedimental Rate
S/CO – Relação entre Sinal e Valor de Corte
SINAN – Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SUS – Sistema Único de Saúde
TAP – Tempo e Atividade da Protrombina
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Tregs – Linfócitos T regulatórios
U – Unidade
URL – Unidade Relativa da Luz
VAg – Viral Protein Genome Like
VPn – Viral Protein number
μl – Microlitro
χ 2 – Teste Qui-quadrado
!!!!!!!!!!!!!!!
xvi!
Sumário 1.!INTRODUÇÃO!................................................................................................................................................! 17! 1.1!Histórico!da!hepatite!A!......................................................................................................................! 17! 1.2!Vírus!da!hepatite!A!..............................................................................................................................! 18! 1.2.1!Genoma!viral!.................................................................................................................................! 19! 1.2.2!Patogênese!viral!...........................................................................................................................! 21! 1.2.3.!Características!físico:químicas!das!partículas!do!HAV!..............................................! 22! 1.3!Epidemiologia!.......................................................................................................................................! 23! 1.3.1!Aspectos!epidemiológicos!no!mundo!.................................................................................! 23! 1.3.2!Aspectos!epidemiológicos!da!hepatite!A!no!Brasil!.......................................................! 26! 1.4!Transmissão!do!HAV!..........................................................................................................................! 29! 1.5!Manifestações!clínicas!.......................................................................................................................! 30! 1.6!Diagnóstico!laboratorial!...................................................................................................................! 32! 1.6.1!Diagnóstico!laboratorial!inespecífico!.................................................................................! 32! 1.6.2!Métodos!sorológicos!..................................................................................................................! 32! 1.6.3!Técnicas!moleculares!................................................................................................................! 34! 1.6.4!Ensaios!imunocromatográficos!............................................................................................! 34! 1.7!Medidas!de!prevenção!e!controle!.................................................................................................! 35! 2.!JUSTIFICATIVA!.............................................................................................................................................! 39! 3.!OBJETIVOS!......................................................................................................................................................! 40! 3.1.!Objetivo!Geral!.......................................................................................................................................! 40! 3.2.Objetivos!Específicos!..........................................................................................................................! 40! 4.!MATERIAIS!E!MÉTODOS!..........................................................................................................................! 41! 4.1.!Desenho!do!estudo!e!seleção!dos!pacientes!............................................................................! 41! 4.2.!Método!de!criação!do!banco!de!dados!para!armazenamento!de!informações:!.......! 41! 4.3.!Teste!rápido!..........................................................................................................................................! 43! 4.4.!!Teste!sorológico!.................................................................................................................................! 45! 4.5.!Considerações!éticas!.........................................................................................................................! 47! 4.6.!Análise!estatística!.............................................................................................................................!!! 48! 5.!RESULTADOS!................................................................................................................................................! 49! 5.1.!Características!demográficas!e!epidemiológicas!da!população!do!estudo!................! 49! 5.2.!Avaliação!das!manifestações!clínicas!e!das!características!laboratoriais! inespecíficas!dos!pacientes!com!hepatite!A!.....................................................................................! 52! 5.3!Avaliação!da!sensibilidade!do!teste!rápido!para!a!detecção!do!anti:HAV!IgM!em! diferentes!períodos!da!infecção!pelo!HAV.!......................................................................................! 55! 5.4!Avaliação!dos!valores!de!DO/CO!para!a!detecção!do!anti:HAV!IgM!e!do!anti:HAV! IgG!em!diferentes!períodos!da!infecção!pelo!HAV!pelo!método!CMIA.!...............................! 57! 5.5!Comparação!entre!a!intensidade!da!leitura!da!escala!colorimétrica!dos!testes! rápidos!com!os!valores!de!DO/CO!para!anticorpos!anti:HAV!IgM!!e!IgG!pelo!método! CMIA!..................................................................................................................................................................! 60! 5.6!Avaliação!da!acurácia!do!teste!rápido!para!a!hepatite!A!para!a!detecção!de! anticorpos!das!classes!IgM!e!IgG!..........................................................................................................! 62! 5.!DISCUSSÃO!.....................................................................................................................................................! 64! 6.!CONCLUSÕES!................................................................................................................................................! 70! 7.!REFERÊNCIAS!BIBLIOGRÁFICAS!.........................................................................................................! 71! 8.!ANEXO!..............................................................................................................................................................! 84! !
18!
Ainda em 1975, Krugman e colaboradores pesquisaram, pela primeira vez,
anticorpos contra o HAV em amostras de soro pertencentes a 20 pacientes com
diagnóstico de hepatite A (Krugman et al. 1975).
O sequenciamento do genoma do HAV foi realizado apenas 10 anos após a
descoberta deste agente viral (Ticehurst et al. 1983). O conhecimento do genoma
viral foi o primeiro passo para o desenvolvimento da vacina inativada contra a
hepatite A, o que possibilitou a obtenção de imunização ativa, segura e duradoura
contra a doença (Santos & Lopes 1997).
1.2 Vírus da hepatite A
O HAV é um vírus essencialmente hepatotrópico e constitui a causa mais
comum de doença hepática aguda (Vaughan et al. 2014). O agente etiológico da
hepatite A é um vírus não envelopado, da família Picornaviridae (Melnick 1982),
pertencente ao gênero hepatovírus (Minor et al. 1991) (Figura 1 .2). É representante
único do gênero hepatovirus (Hollinger & Emerson 2007).
Figura 1 .2 : Representação esquemática da partícula do HAV (fonte: Ministério da Saúde,
- Disponível em http://www.aids.gov.br/pagina/hepatite-a).
19!
1.2.1 Genoma viral
O genoma do HAV é constituído de uma fita simples de RNA, de polaridade
positiva, semelhante ao dos demais membros da família Picornaviridae (Minor
1991 ).
O RNA genômico está associado covalentemente à proteína VPg na
extremidade 5’ não-codificante, tendo esta proteína papel importante na iniciação da
transcrição devido sua participação na formação do sítio interno de entrada do
ribossoma. O RNA genômico e algumas proteínas não-estruturais associadas são
envoltos por um capsídeo de simetria icosaédrica, tendo a partícula viral de 27 a 32
nm de diâmetro (Feinstone et al. 197 3).
A cadeia de RNA tem cerca de 7,5 Kb e consiste de três regiões: uma região
não-codificante na extremidade 5 (5’NC), de 732 a 740 nucleotídeos; uma região
intermediária, codificante, com 2.225 a 2.227 nucleotídeos; e uma região não-
codificante na extremidade 3 (3’NC) com 40 a 80 nucleotídeos. A Figura 1. 2.
mostra as diferentes regiões e proteínas codificadas a partir da fase de leitura aberta
do genoma viral. A região 5’NC é a porção mais conservada do genoma, com cerca
de 89% de identidade dos nucleotídeos entre as cepas de HAV e forma o sítio
interno para entrada no ribossomo, o qual direciona a tradução (Cohen et al. 1987).
Uma única poliproteína, de aproximadamente 2.200 aminoácidos, é clivada
por ação das proteases virais e gera três precursores P1, P2 e P3, os quais são
novamente clivados dando origem às proteínas virais. As principais proteínas
estruturais codificadas a partir do genoma do HAV são: VP1, VP2, VP3 e VP4, que
formam o capsídeo viral. Essas proteínas são originadas da região P1 (Figura 1.2.1).
As proteínas VP2 e VP4 têm função estrutural na montagem do vírion no citoplasma
da célula. Já as proteínas VP1 e VP3 formam um complexo iniciador da síntese da
fita positiva de RNA com coeficiente de sedimentação 5S. Cinco dessas estruturas
se associam e formam um pentâmero de 14S, e 12 desses pentâmeros formam o
capsídeo completo com 70S que, ao envolver o RNA genômico, formará a partícula
viral de 140S (Hollinger & Emerson 2007).