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1. Quais saó as caracterí sticas essen-
ciais da glicólise?
Na via da glicólise (Figura 1), uma molécula de glicose é con- vertida, através de 10 passos catalisados por enzimas, em duas moléculas de piruvato de 3 átomos de carbono. A maioria dos detalhes desta via (a primeira via metabólica a ser elucidada) foram trabalhados na primeira metade do século XX pelos bioquímicos alemães Otto Warburg, G. Embden e O. Meyerhof. Na verdade, a sequência de reações na Figura 1 é frequentemente chamada de via de Embden-Meyerhof. Por que a glicólise é tão importante para os organismos? Há várias razões. Para alguns tecidos (como cérebro, medula re- nal e músculos esqueléticos rapidamente contraídos) e para algumas células (como eritrócitos e células espermatozoides), a glicose é a única fonte de energia metabólica. Além disso, o produto da glicólise— piruvato—é um metabólito versátil que pode ser usado de várias maneiras. Na maioria dos tecidos, quando o oxigênio é abundante (condições aeróbicas), o piru- vato é oxidado (com perda do grupo carboxil como CO 2 ) e a unidade de dois carbonos restante se torna o grupo acetil do acetil-CoA (Figura 2). Este grupo acetil é metabolizado no ciclo do ácido tricarboxílico (CAT) (e totalmente oxidado) para pro- duzir CO 2. Alternativamente, na ausência de oxigênio (condições anaeró- bicas), o piruvato pode ser reduzido a lactato através da oxida- ção de NADH para NAD+^ — um processo denominado fermen- tação láctica. Em microrganismos como a levedura da cerveja e em certos tecidos vegetais, o piruvato pode ser reduzido a etanol, novamente com oxidação de NADH para NAD+. A maio- ria dos alunos reconhecerá esse processo como fermentação alcoólica. A glicólise consiste em duas fases. Na primeira fase, uma série de cinco reações, a glicose é dividida em duas moléculas de gliceraldeído- 3 - fosfato. Na segunda fase, cinco reações subse- quentes convertem essas duas moléculas de gliceraldeído- 3 - fosfato em duas moléculas de piruvato. A fase 1 consome duas moléculas de ATP (Figura 1). Os estágios posteriores da glicóli- se resultam na produção de quatro moléculas de ATP. O rendi- mento é 4 - 2 = 2 moléculas de ATP produzidas por molécula de glicose. Microrganismos, plantas e animais (incluindo hu- manos) realizam as 10 reações da glicólise de forma mais ou menos semelhante, embora a velocidade das reações individu- ais e os meios pelos quais são reguladas diferem de espécies para espécies.
Glicólise
Quase todas as células vivas realizam um processo catabólico conhecido como glicólise — a degradação em etapas da glicose (e outros açúcares simples). A glicólise é um paradigma das vias metabólicas. Realizado no citosol das células, é basicamente um processo anaeróbico; seus principais passos ocorrem sem necessidade de oxigênio. Os seres vivos apareceram pela primeira vez em um ambiente sem O2, e a glicólise era um caminho inicial e importante para extrair energia de moléculas de nutrientes. Desempenhou papel central nos processos metabólicos anaeróbicos durante os primeiros 2 bilhões de anos de evolução biológica na Terra. Organismos contemporâneos ainda empregam a glicólise para fornecer moléculas precursoras para vias catabólicas aeróbicas (como o ciclo do ácido tricarboxílico) e como fonte de energia de curto prazo quando o oxigênio é limitador. Quais são as bases químicas e a lógica para esta via central do metabolismo; ou seja, como funciona a glicólise? PERGUNTA ESSENCIAL
FIGURA 1 A via glicolítica.
2. Pór que ó acóplamentó de reaçóes
e impórtante na glicólise?
O processo de glicólise converte alguma, mas não toda, ener- gia metabólica da molécula de glicose em ATP. A variação de energia livre para a conversão de glicose para duas moléculas de lactato (a rota anaeróbica na contração muscular) é de ΔG° = - 183,6 kJ/mol: Este processo ocorre sem oxidação líquida ou redução. Embo- ra várias etapas individuais na via envolvam oxidação ou redu- ção, essas etapas compensam exatamente entre si. Assim, a conversão de uma molécula de glicose em duas moléculas de lactato envolve simplesmente um rearranjo de ligações, sem perda ou ganho líquido de elétrons. A energia disponibilizada através deste rearranjo é uma parte relativamente pequena da energia total obtida da glicose. A produção de duas moléculas de ATP na glicólise é um pro-
A hidrólise do ATP disponibiliza 30,5 kJ/mol nesta reação, e a fosforilação da glicose "custa" 13,8 kJ/mol (Tabela 1). Assim, a reação libera 16,7 kJ/mol em condições padrão (1 M de con- centração) e o equilíbrio da reação está muito deslocado à
direita ( K eq = 850 a 25°C; ver Tabela 1). Em condições celula-
res (Tabela 2), esta primeira reação da glicólise é ainda mais favorável do que no estado padrão, com a ΔG de - 33,9 kJ/mol (ver Tabela 1).
As vantagens celulares da fósfórilaçaó pela
glicóse
A incorporação de um fosfato em glicose nesta reação energe- ticamente favorável é importante por várias razões. Primeiro, a fosforilação mantém o substrato na célula. A glicose é uma molécula neutra e pode difundir através da membrana celular, mas a fosforilação confere uma carga negativa para a glicose e a membrana plasmática é essencialmente impermeável à gli- Reação Enzima ΔG^0 ’ (kJ /mol) K eq ΔG (kJ/ mol) Hexoquinase Glicoquinase
- 16,7 850 - 33,9* Fosfoglicoisomera- se
- 1,67 0,51 - 2, Fosfofrutoquinase - 14,2 310 - 18, Frutose bifosfato aldolase
- 23,9 6,43 x 10- 5
- 0, Triose fosfato iso- merase
- 7,56 0,0472 + 2, Gliceraldeído- 3 - P desidrogenase
- 6,30 0,0786 - 1, Fosfoglicerato quinase
- 18,9 2060 + 0, Fosfoglicerato mutase
- 4,4 0,169 + 0, Piruvato quinase - 31,7 3,63 x 105
- 23, Lactato desidroge- nase
- 25,2 2,63 x 104
- 14, *** Valores de ΔG calculados para 310 K (37°C) usando os dados da Tabela 2 para valores de concentração de metabólitos nos eritrócitos. Valores de ΔG**^0 ’ foram definidos como sendo os mesmos a 25° e a 37°C. Tabela 1 – Reações e termodinâmica da Glicólise FIGURA 4 A fosforilação de glicose à glicose- 6 - fosfato pelo ATP cria uma molécula carregada que não pode facil- mente atravessar a membrana plasmática. Metabólito mM Glicose 5, Glicose- 6 - fosfato 0, Frutose- 6 - fosfato 0, Frutose-1,6-bifosfato 0, Diidroxiacetona fosfato 0, Gliceraldeído- 3 - fosfato 0, 1,3-Bifosfoglicerato 0, 2,3-Bifosfoglicerato 4, 3 - Fosfoglicerato 0, 2 - Fosfoglicerato 0, Fosfoenolpiruvato 0, Piruvato 0, Lactato 2, ATP 1, ADP 0, Pi 1, Adaptado de Minakami, S., and Yoshika- wa, H., 1965. Thermodynamic considera- tions on erythrocyte glycolysis. Biochem- ical and Biophysical Research Communi- cations 18: 345. Tabela 2 – Concentrações padrão de meta- bólitos glicolíticos nos eritrócitos.
cose- 6 - fosfato (Figura 4). Além disso, a rápida conversão da glicose em glicose- 6 - fosfato mantém a concentração intracelu- lar de glicose baixa, favorecendo a difusão facilitada glicose para a célula. Além disso, como o controle regulatório só pode ser imposto em reações que não se encontram em equilíbrio, a termodinâmica favorável dessa primeira reação a torna um ponto importante para a regulação. As isóenzimas da Hexóquinase Na maioria das células animais, vegetais e microbianas, a enzi- ma que fosforila a glicose é a hexoquinase. Íon de magnésio (Mg2+) é necessário para esta reação, como para as outras enzimas quinase na via glicolítica. O verdadeiro substrato para a reação de hexoquinase é MgATP^2 -. Há quatro isoenzimas de hexoquinase na maioria dos tecidos animais. Hexoquinase I é a forma principal no cérebro. Hexoquinase no músculo esquelé- tico é uma mistura dos tipos I (70% a 75%) e II (25% a 30%). O Km para glicose é de 0,03 m M para o tipo I e 0,3 m M para o tipo II; assim, a hexoquinase opera eficientemente em níveis normais de glicose no sangue de 4 m M ou mais. As isozimas animais são alostéricamente inibidas pelo produto, glicose- 6 - fosfato. Altos níveis de glicose- 6 - fosfato inibem a atividade de hexoquinase até que seu consumo pela glicólise reduza sua concentração. A reação de hexoquinase é um dos três pontos na via da glicó- lise que são regulados. Como o nome genérico indica, a hexo- quinase pode fosforilar uma variedade de açúcares, de hexo- ses, incluindo glicose, manose e frutose. A isoenzima tipo IV de hexoquinase, chamada glicoquinase, é encontrada predominantemente no fígado e pâncreas. O tipo
IV é altamente específico para D-glicose, tem Km muito maior
para glicose (aproximadamente 10 m M ), e não é inibido pelo produto. Com um Km tão alto para glicose, a glicoquinase torna
- se importante metabolicamente apenas quando os níveis de glicose hepática são altos (por exemplo, quando o indivíduo consume grandes quantidades de carboidratos). Quando os níveis de glicose são baixos, a hexoquinase é a principal res- ponsável pela fosforilação da glicose. No entanto, quando os níveis de glicose são altos, a glicose é convertida pela glicoqui- nase em glicose- 6 - fosfato e é, eventualmente, armazenada no fígado como glicogênio. A glico- quinase é uma enzima induzível —a quantidade presente no fíga- do é controlada pela insulina (secretada pelo pâncreas). (Pacientes com diabetes mellitus produzem insulina insuficiente. Eles têm baixos níveis de glico- quinase, não podem tolerar altos níveis de glicose no sangue e produzem pouco glicogênio he- pático.) Como a glicose- 6 - fosfato é comum a várias vias metabóli- cas (Figura 5), ocupa um ponto de ramificação no metabolismo da glicose. Hexóquinase se liga a gli- cóse e ATP pór meió de Ajuste Induzidó Na maioria dos organismos a hexoquinase ocorre em uma única forma: um monômero de 50 kD de dois lobos e se asseme- lha a um grampo, com uma gran- de ranhura em um lado (Figura 6). Daniel Koshland previu, anos FIGURA 5 Glicose- 6 - fosfato é o ponto de ramificação para várias vias metabólicas. FIGURA 6 (a) Estado aberto e (b) fechado de hexoquinase de levedura. A ligação da glicose (verde) induz uma alteração de conformação que fecha o sítio ativo, como previsto por Koshland (a: pdb id = 1IG8; b: pdb id = 1BDG).
fosfato. O ΔG °’ é de 1,67 kJ/mol, e o valor de ΔG em condições celulares (Tabela 1) é - 2,92 kJ/mol. Este valor pequeno signifi- ca que a reação opera perto do equilíbrio na célula e é facil- mente reversível. A fosfoglicoisomerase prossegue através de um i ntermediário enediol, como mostra a Figura 8. Embora as formas predominantes de glicose- 6 - fosfato e frutose- 6 - fosfato em solução sejam as formas cíclicas, a isomerase interconver- te a forma de cadeia aberta de G- 6 - P na forma de cadeia aber- ta de F- 6 - P.
Reaçaó 3: ATP impulsióna uma se-
gunda fósfórilaçaó pela fósfófrutó-
quinase — A Segunda Reaçaó de Ati-
vaçaó
A ação da fosfoglicoisomerase, "movendo" o grupo carbonila de C-1 para C-2, cria uma nova função de álcool primário em C
- 1 (ver Figura 8). O próximo passo na via glicóltica é a fosforila- ção deste grupo pela fosfofrutoquinase. Mais uma vez o substrato que fornece o grupo fosforila é o ATP. Como a reação da hexoquinase/glicoquinase, a fosforila- ção da frutose- 6 - fosfato é uma reação de ativação e é en- dergônica: Quando acoplado (pela fosfofrutoquinase) com a hidrólise de ATP, a reação total torna-se exergônica: Em pH 7 e 37°C, o equilíbrio da reação da fosfofrutoquinase fica muito deslocado à direita. Assim como a reação da hexo- quinase compromete a célula a captar glicose, a reação da fosfofrutoquinase compromete a célula a metabolizar a glicose em vez de convertê-la em outro açúcar ou armazená-la. Da mesma forma, assim como a grande variação de energia livre da reação da hexoquinase faz dela uma provável candidata à regulação, a reação da fosfofrutoquinase é um importante ponto de regulação — na verdade, o local mais importante na via glicolítica.
Regulaçaó da Fósfófrutóquinase
A fosfofrutoquinase é a "válvula" que controla a taxa de glicóli- se. Além de seu papel como substrato, o ATP também é um inibidor alotérico desta enzima. Assim, a fosfofrutoquinase possui dois sítios distintos de ligação para o ATP; um sítio de substrato de alta afinidade e um sítio regulatório de baixa afi- nidade. Na presença de altas concentrações de ATP, a fosfo- frutoquinase se comporta cooperativamente, os gráficos de Em países de língua inglesa, quando alguém tem um trabalho diurno, mas também trabalha à noite (isto é, sob a lua) em um segundo trabalho, dizem que são "Moonlighting". Da mesma forma, várias proteínas têm duas ou mais funções diferentes e Constance Jeffery, da Universidade Br andeis, chamou essas proteínas de "proteínas Moonlighting". A fosfoglicoisomerase catalisa o segundo passo da glicólise, mas também tem um segundo emprego com o fator de crescimento de tecido nervoso fora das células animais. De fato, extracelularmente, essa proteína é conhecida como neuroleucina (NL), fator de motilidade autócrina (AMF) e mediador de diferenciação e maturação (DMM). A neuroleucina é secretada pelas células T (do sistema imunológico) e promove a sobrevivência de certos neurônios espinhais e nervos sensoriais. A AMF é secretada por células tumorais e estimula a migração de células cancerosas. DMM faz com que certas células de leucemia se diferenciem. Como a fosfoglicosomerase é secretada pela célula para suas funções Moonlighting é um processo ainda desconhecido, mas há evidências de que o próprio organismo pode ser prejudicado por essa secreção. Diane Mathis e Christophe Benoist, da Universidade de Estrasburgo, mostraram que, em camundongos com distúrbios semelhantes à artrite reumatoide, o sistema imunológico reconhece a fosfoglicosomerase extracelular como um antígeno — ou seja, uma proteína que é "não-eu. " O fato de uma proteína poder ser vital para o metabolismo dentro da célula e também funcionar como um fator de crescimento e ocasionalmente agir como um antígeno fora da célula é realmente notável. Fósfóglicóisómerase — Uma próteí na “Móónlighting” Fosfofrutoqui- nase com ADP (em laranja) e frutose- 6 - fosfato (em vermelho) (PDB id = 4PFK).
atividade enzimática versus [frutose- 6 - fosfato] são sigmoides, e o K0,5 para a frutose- 6 - fosfato aumenta (Figura 9). Assim, quando os níveis de ATP são suficientemente altos no citosol, a glicólise "desliga". Na maioria das condições celulares, no entanto, a concentração de ATP não tem variação tão ampla. A concentração de ATP no músculo durante o exercício vigoro- so, por exemplo, é apenas cerca de 10% menor do que duran- te o estado de repouso. A taxa de glicólise, no entanto, varia muito mais. A grande faixa de variação da velocidade da via glicolítica não pode ser explicada apenas pela mudança de 10% nos níveis de ATP. O AMP reverte a inibição promovida pelo ATP e os níveis de AMP nas células podem aumentar drasticamente quando os níveis de ATP diminuem, devido à ação da enzima adenilato quinase, que catalisa a reação com a constante de equilíbrio: A adenilato quinase rapidamente interconverte ADP, ATP e AMP para manter esse equilíbrio. Os níveis de ADP nas células são tipicamente 10% dos níveis de ATP e os níveis de AMP são muitas vezes menos de 1% da concentração de ATP. Sob tais condições, uma pequena mudança líquida na concentração de ATP devido à hidrólise ATP resulta em um aumento relativo muito maior nos níveis de AMP devido à atividade de quinase adenilato. Claramente a atividade de fosfofrutoquinase depende tanto dos níveis ATP quanto de AMP e é uma função do estado ener- gético celular. A atividade da fosfofrutoquinase é aumentada quando o estado energético cai e é diminuída quando ele é alto. A taxa de atividade da glicólise diminui quando o ATP é abun- dante e aumenta quando mais ATP é necessário. A glicólise e o ciclo do ácido cítrico são acoplados via fosfofru- toquinase, porque o citrato, um intermediário no ciclo do áci- do cítrico, é um inibidor alostérico da fosfofrutoquinase. Quando o ciclo do ácido cítrico atinge a saturação, a glicólise (que "alimenta" o ciclo do ácido cítrico em condições aeróbi- cas) diminui a velocidade. O ciclo do ácido cítrico direciona os elétrons para a cadeia transportadora de elétrons (para fins de síntese de ATP na fosforilação oxidativa) e também fornece moléculas precursoras para vias biossintéticas. A inibição da glicólise pelo citrato garante que a glicose não será compro- metida com essas atividades se o ciclo do ácido cítrico já esti- ver saturado.
A fosfofrutoquinase também é regulada por -D-frutose-2,6-
bifosfato, um potente ativador alotérico que aumenta a afini- dade de fosfofrutoquinase para o substrato frutose- 6 - fosfato (Figura 10). A estimulação da fos- fofrutoquinase também é alcan- çada pela diminuição dos efeitos inibitórios da ATP (Figura 11). Frutose-2,6-bifosfato aumenta o fluxo líquido de glicose atra- vés da glicólise estimulando a fosfofrutoquinase e, como vere- mos mais tarde, inibindo a frutose-1,6-bifosfatase, a enzima que catalisa essa reação na direção oposta.
Reaçaó 4: Clivagem pela Frutóse Bi-
fósfató Aldólase cria dóis intermedia-
FIGURA 9 Em alta [ATP] a fosfofrutoquinase (PFK) se comporta cooperativamente e o gráfico da atividade enzimática versus [frutose- 6 - fosfato] é sigmoide. Alta [ATP] inibe a PFK, diminuindo a afinidade da enzima com a frutose- 6 - fosfato. FIGURA 10 A frutose-2,6-bifosfato ativa a fosfofrutoquinase aumentando a afinidade da enzima para frutose- 6 - fosfato e restaurando a dependência hiperbólica da ativida- de enzimática pela concentração de substrato.
se. A outra fosfato triose, diidroxiacetona fosfato, deve ser convertida em gliceraldeído- 3 - fosfato pela enzima triose fos- fato isomerase. Essa reação permite, assim, que ambos os produtos da reação da aldolase continuem na via glicóltica e, em essência, faz com que os carbonos C-1, C-2 e C-3 da molé- cula de glicose inicial equivalham aos carbonos C-6, C-5 e C-4, respectivamente. O mecanismo de reação envolve um inter- mediário enediol que pode doar qualquer um de seus prótons hidroxila para um resíduo básico na enzima e, assim, tornar-se diidroxiacetona fosfato ou gliceraldeído- 3 - fosfato (Figura 13). A triose fosfato isomerase é uma das enzimas que evoluíram para um estado de "perfeição catalítica", com número de re- novação perto do limite de difusão. A reação da fosfato triose isomerase completa a primeira fase da glicólise, cada glicose que passa sendo convertida em duas moléculas de gliceraldeído- 3 - fosfato. Embora os dois últimos passos da via sejam energeticamente desfavoráveis, a sequên- cia geral de reação de cinco passos tem Δ G °’ total de - 2,2 kJ/
mol ( K eq ≈ 0,43). É a energia livre da hidrólise das duas molé-
culas de ATP de ativação que aproxima a constante de equilí- brio global de 1 sob condições padrão. O ΔG em condições celulares é bastante negativo (- 53,4 kJ/mol nos eritrócitos). 4 Quais sa ó ós princí piós e carac- terí sticas quí micas da segunda fase da glicólise? A segunda metade da via glicolítica envolve as reações que convertem a energia metabólica da molécula de glicose em ATP. Ao todo são produzidas quatro novas moléculas de ATP. Se dias forem consideradas para compensar os dois ATPs con- sumidos na fase 1, há o rendimento líquido de dois ATPs por molécula de glicose. A fase 2 começa com a oxidação do glice- FIGURA 12 (a) Um mecanismo para a reação de frutose-1,6-bifosfato aldolase. A base de Schiff formada entre a carbonila do substrato e uma lisina de sítio ativo age como um dissipador de elétrons, aumentando a acidez do grupo - hidroxila e facili- tando a clivagem como mostrado. Os resíduos catalíticos na enzima muscular do coelho são Lys 229 e Asp 33. (b) Em aldolases classe II, um Zn2+^ do sítio ativo estabiliza o intermediário enolato, levando à polarização do grupo carbonila do substrato. Triose fosfato isomera- se com substrato análo- go ao 2 - fosfoglicerato mostrado em ciano (pdb id = 1YPI). FIGURA 13 Mecanismo de reação para a triose fosfato isomerase. Na enzima da levedura o resíduo catalítico é Glu 165.
raldeído- 3 - fosfato, uma reação com um grande "chute" de energia para produzir um fosfato de alta energia, ou seja, 1,3- bifosfoglicerato (ver Figura 1). A transferência de fosforila do 1,3-BPG para o ADP para produzir ATP é altamente favorável. O produto, 3-fosfoglicerato, é convertido, através de várias etapas, a fosfoenolpiruvato (PEP), outro fosfato de alta ener- gia. PEP prontamente transfere seu grupo fosforila para o ADP na reação da piruvato quinase para produzir outro ATP.
Reaçaó 6: Gliceraldeídó- 3 - Fósfató De-
sidrógenase cria um intermediarió
de alta energia
Na primeira reação glicolítica a envolver oxidação–redução, o gliceraldeído- 3 - fosfato é oxidado a 1,3-bisfosfoglicerato pela gliceraldeído- 3 - fosfato desidrogenase. Embora a oxidação de um aldeído a um ácido carboxílico seja uma reação altamente exergônica, a reação geral envolve a formação de um anidrido carboxílico-fosfórico e a redução de
NAD+^ para NADH e, portanto, é ligeiramente endergônica em
condições padrão, com ΔG °’ de - 6,30 kJ/mol. A energia livre, que poderia ser liberada como calor nesta reação, é direciona- da para a formação de um composto fosfato de alta energia, 1,3-bisfosfoglicerato, e a redução de NAD+. O mecanismo de reação envolve o ataque nucleofílico por um grupo - SH de cisteína sobre o carbono carbonila do gliceraldeído- 3 - fosfato para formar um hemitioacetal (Figura 14). O intermediário hemitioacetal se decompõe em hidreto (H:-), transferido para o NAD+, para formar um tioéster de alta energia. Um ataque nucleofílico do fosfato desloca o produto, 1,3- bisfosfoglicerato, da enzima. A enzima pode ser inativada pela reação com iodoacetato, que reage e bloqueia o grupo sulfi- drila essencial da cisteína. A reação da gliceraldeído- 3 - fosfato desidrogenase é o local de ação do arsenato (AsO 43 - ), um ânion análogo ao fosfato. O arsenato é um substrato eficaz nesta reação, formando 1 - arseno- 3 - fosfoglicerato, mas acil-arsenatos são bastante ins- táveis e são rapidamente hidrolisados. 1-Arseno- 3 - fosfoglicerato se parte para produzir 3 - fosfoglicerato, o produ- to da sétima reação da glicólise. O resultado é que a glicólise continua na presença de arsênico, mas a molécula de ATP formada na reação 7 (fosfoglicerato quinase) não é produzida porque este passo foi contornado. A labilidade do 1-arseno- 3 - fosfoglicerato efetivamente desaco- pla os eventos de oxidação e fosforilação, que normalmente são firmemente acoplados na reação da desidrogenase glice- raldeído- 3 - fosfato.
Reaçaó 7: A Fósfóglicerató Quinase e
a reaçaó de desempate
A via glicolítica desempata a quantidade de ATPs consumidos e produzidos com essa reação. A enzima fosfoglicerato quina- se transfere um grupo fosforila do 1,3 bifosfoglicerato para o ADP para formar um ATP. Como cada molécula de glicose en- via duas moléculas de gliceraldeído- 3 - fosfato para a segunda fase da glicólise e porque dois ATPs foram consumidos por glicose nas reações da primeira fase, a reação da fosfoglicera- to quinase "compensa" a dívida de ATP criada pelas reações FIGURA 14 Mecanismo da reação da gliceraldeído- 3 - fosfato desidrogenase. A reação da sulfidrila da enzima com o carbono carbonila de gliceraldeído- 3 - P forma um tiohemiacetal, que perde um hidreto para NAD+^ para se tornar um tioéster. A fosforólise deste tioéster libera 1,3-bisfosfoglicerato. Na enzima do músculo coelho, o resíduo catalítico é Cys 149.
fosfoglicerato mutase é uma fosfoenzima, com um grupo fosforila covalentemente ligado a um resíduo de histidina no local ativo. Este grupo fosforila é transferido para a posição C- 2 do substrato para formar um transitório 2,3-bisfosfoglicerato ligado à enzima, que então se decompõe por uma segunda transferência de fosforila da posição C-3 do intermediário para o resíduo de histidina na enzima. Cerca de uma vez em cada 100 reações enzimáticas, o intermediário 2,3-bisfosfoglicerato, se dissocia do sítio ativo, deixando uma enzima inativa e não fosforilada. A enzima não fosforilada pode ser reativada por ligação com 2,3 BPG. Por essa razão, a atividade máxima da fosfoglicerato mutase requer a presença de pequenas quanti- dades de 2,3-BPG.
Reaçaó 9: Desidrataçaó pór Enólase
cria PEP
Lembre-se que, antes de sintetizar ATP na reação da fosfogli- cerato quinase, era necessário fazer um substrato com um fosfato de alta energia. A reação 9 da glicólise também faz um fosfato de alta energia como preparação para a síntese de ATP. A enolase catalisa a formação de fosfoenolpiruvato a partir de 2 - fosfoglicerato. A reação envolve a remoção de uma molécu- la de água para formar a estrutura enol do PEP. O ΔG °’ para
esta reação é relativamente pequeno, 1,8 kJ/mol ( K eq = 0,5); e,
sob condições celulares, o ΔG é muito próximo de zero. À luz
dessa condição, pode ser difícil, a princípio, entender como a reação da enolase transforma um substrato com uma energia livre de hidrólise relativamente baixa, em um produto (PEP) com uma energia livre de hidrólise muito alta. Este quebra- cabeça é esclarecido ao se perceber que a 2-fosfoglicerato e o PEP contêm cerca da mesma quantidade de energia metabóli-
ca potencial, no que diz respeito à decomposição de Pi, CO 2 e
H 2 O. O que a reação da enolase faz é reorganizar o substrato
em uma forma a partir da qual mais dessa energia potencial pode ser liberada sob hidrólise. A enzima é fortemente inibida pelo íon flúor na presença de fosfato. Thomas Nowak mostrou que flúor, fosfato e um cátion divalente formam um complexo parecido com o estado de transição no sítio ativo da enzima, com flúor aparentemente imitando o nucleófilo de íons de hidróxido na reação de enolase. A histidina catalítica (His^183 ) no sítio ativo da fosfoglicerato mutase de Escherichia coli (pdb id = 1E58). Note que His^10 está fosforilada. FIGURA 17 Mecanismo para a reação da fosfoglicerato mutase do músculo de coelho e da levedura. Zelda Rose, do Instituto de Pesquisa do Câncer na Filadélfia, mostrou que a enzi- ma requer uma pequena quantidade de 2,3 BPG para fosforilar um resíduo histidina antes que o mecanismo possa prosseguir. Antes de seu trabalho, o papel da fosfohistidina neste mecanismo não era compreendido.
A enolase de levedura é um dímero de subunidades idênticas. No entanto, se a enzima é cristalizada na presença de uma mistura do substrato (2-fosfoglicerato) e do produto (fosfoenolpiruvato), o dímero cristalizado é assimétrico! Um sítio ativo da subunidade contém 2-fosfoglicerato, e o outro contém PEP (Figura 18), fornecendo assim uma imagem "antes e depois" desta enzima glicolítica.
Reaçaó 10: A Piruvató Quinase rende
mais ATP
A segunda reação produtora de ATP da glicólise é catalisada pela piruvato quinase, que leva a via finalmente ao piruvato. A piruvato quinase media a transferência de um grupo fosforila do fosfoenolpiruvato para o ADP, para produzir ATP e piruva-
to. A reação requer íon Mg2+^ e é estimulada por K+^ e alguns
outros cátions monovalentes. O Keq correspondente a 25°C é 3,63 x 10^5 , e é claro que o equi- líbrio de reação da piruvato quinase está muito deslocado para a direita. Os efeitos de concentração reduzem um pouco a magnitude da variação de energia livre no ambiente celular, mas o ΔG nos eritrócitos ainda é bastante favorável, - 23,0 kJ/ mol. A grande variação de energia livre para a conversão de PEP em piruvato deve-se, em grande parte, à conversão alta- mente favorável e espontânea do tautômero enol de piruvato para a forma de ceto mais estável (Figura 19) após a etapa de transferência do grupo fosforila. O grande ΔG negativo desta reação faz da piruvato quinase um ponto adequado para a regulação da glicólise. Para cada molécula de glicose na via da glicólise, dois ATPs são produzi- dos no estágio da piruvato quinase (porque duas moléculas de triose foram produzidas a partir da glicose na reação da aldo- lase). Como a via se pagou em termos de ATP na reação da fosfoglicerato quinase (dois ATPs consumidos e dois ATPs pro- duzidos), os dois ATPs produzidos pela piruvato quinase repre- sentam o “rendimento” da glicólise — um ganho líquido de duas moléculas de ATP. A piruvato quinase possui sítios alostéricos com inúmeros efei- tos. É ativada por AMP e frutose-1,6-bifosfato e inibida por ATP, acetil-CoA e alanina. (Note que alanina é a contrapartida
-aminoácido do -ceto ácido, piruvato.)
FIGURA 18 O dímero da levedura é assimétrico. O sítio ativo de uma subunidade (a) contém 2-fosfoglicerato, o substrato da enolase. Também são mostrados um íon Mg2+^ (azul), um íon Li+^ (roxo) e His^159 , que participa da catálise. A outra subunidade (b) liga fosfoenolpiruvato, o produto da reação da enolase. Uma molécula de água do sítio ativo (amarelo), Mg+^ (azul) e His^159 também são mostrados (PDB id = 2ONE). A estrutura do tetrâmero da piruvato quinase é sensível aos ligantes. A enzima E. coli está inativa na ausência de ligantes (esquerda, PDB id = 1E0U). A forma ativa do dímero da levedura, com frutose-1,6-bisfosfato (um regulador alostérico, azul), um análogo ao substrato (vermelho) e K+^ (ouro) (PDB id = 1A3W).
sável pelo sabor do leite azedo e pelo sabor e fragrância carac- terísticos do chucrute, que na realidade é o repolho fermenta- do.
Lactató se acumula em tecidós animais sób
cóndiçóes anaeróbicas
Em tecidos animais que experimentam condições anaeróbicas, o piruvato é reduzido a lactato. A redução do piruvato ocorre em tecidos que normalmente experimentam acesso mínimo ao fluxo sanguíneo (por exemplo, a córnea do olho) e também em músculo esquelético vigorosamente contraído. Quando os músculos esqueléticos são exercitados vigorosamente, o oxi- gênio disponível no tecido é consumido e o piruvato gerado pela glicólise não pode mais ser oxidado no CAT. Em vez disso, o excesso de piruvato é reduzido ao lactato pela lactato desi- drogenase (Figura 21). A taxa de glicólise anaeróbica no mús- culo esquelético pode aumentar até 2000 vezes quase instan- taneamente, por exemplo, para suportar as intensas deman- das de um animal correndo. Grandes quantidades de ATP são geradas rapidamente, com acúmulo de lactato. No tecido muscular anaeróbico, o lactato representa o fim da glicólise. Qualquer um que se exercite a ponto de esgotar os estoques de oxigênio muscular disponíveis conhece as cãibras e a fadiga muscular associadas ao acúmulo de ácido láctico no músculo. A maior parte deste lactato deve ser liberada do músculo para o sangue e transportada para o fígado, onde pode ser recicla- da em glicose pela gliconeogênese. Além disso, como a glicóli- se gera apenas uma fração da energia total disponível a partir da quebra da glicose (o resto é gerado pelo CAT e pela fosfori- lação oxidativa), o aparecimento de condições anaeróbicas no músculo esquelético também significa uma redução da ener- gia disponível a partir da quebra da glicose. 6 Cómó as celulas regulam a gli- cólise? A elegância do design da natureza para a via glicolítica pode ser apreciada através de um exame da Figura 22. As variações de energia livre nas condições padrão para as 10 reações da glicólise e da reação de lactato desidrogenase (Figura 22a) são alternadamente positivas e negativas e, juntas, oferecem pou- ca visão sobre o acoplamento que ocorre no meio celular. Por outro lado, os valores de ΔG em condições celulares (Figura 22b) caem em duas classes distintas. Para as reações 2 e 4 a 9, ΔG é muito próximo de zero, o que significa que essas reações operam essencialmente em equilíbrio. Pequenas mudanças nas concentrações de reagentes e produtos poderiam "empurrar" qualquer uma dessas reações para frente ou para trás. Em contraste, as reações da hexoquinase, fosfofrutoqui- nase e piruvato quinase apresentam grandes valores negativos de ΔG em condições celulares. Essas reações são, portanto, os locais de regulação da via glicolítica. Quando essas três enzi- mas estão ativas, a glicólise prossegue e a glicose é pronta- mente metabolizada para piruvato ou lactato. A inibição das três enzimas-chave por efeitos alostéricos faz com que a glicó- lise pare. Quando considerarmos a gliconeogênese —a biossín- tese da glicose—, veremos que diferentes enzimas são usadas para catalisar as reações 1, 3 e 10 no sentido inverso, efetuan- do a síntese líquida da glicose. A manutenção das reações 2 e 4 a 9 em ou perto do equilíbrio permite que essas reações (e suas respectivas enzimas) operem efetivamente na direção direta ou inversa. FIGURA 21 (a) A redução do piruvato ao etanol na levedura fornece um meio para regenerar NAD+^ consumido na reação de glice- aldeídeo- 3 - P desidrogenase. (b) No músculo com o oxigênio esgotado, o NAD+^ é regenerado na reação da lactato desidrogenase.
7 Outrós substratós alem da gli- cóse sa ó usadós na glicólise? A via glicolítica começa com a quebra da glicose, mas outros açúcares, simples e complexos, podem entrar no ciclo se pu- derem ser convertidos por enzimas apropriadas a um dos in- termediários da glicólise. A Figura 23 mostra as rotas pelas quais vários metabólitos simples podem entrar na via glicolíti- ca. A frutose, por exemplo, que é produzida hidrólise da saca- rose, pode participar da glicólise por, pelo menos, duas rotas diferentes. No fígado, a frutose é fosforilada em C-1 pela enzi- ma frutoquinase : A ação subsequente da frutose- 1 - fosfato aldolase quebra a frutose- 1 - P, como a reação da frutose bifosfato aldolase, para produzir diidroxiacetona fosfato e D-gliceraldeído: Diidroxiacetona fosfato é, naturalmente, um intermediário em
glicólise. D-Gliceraldeído pode ser fosforilado pela triose qui-
nase na presença de ATP para formar D-gliceraldeído- 3 -
fosfato, outro intermediário glicolítico. No rim e nos tecidos musculares, a frutose é prontamente fosforilada pela hexoqui- nase, que, como apontado anteriormente, pode utilizar vários substratos hexose diferentes. A energia livre da hidrólise da ATP impulsiona a reação para a diante: A frutose- 6 - fosfato gerada desta forma entra na via glicóltica diretamente na etapa 3, a segunda reação de ativação. Este é o principal meio para canalizar frutose para a glicólise no teci- do adiposo, que contém altos níveis de frutose.
Manóse entra na Glicólise em dóis passós
Outro açúcar simples que entra na glicólise no mesmo ponto que a frutose é a manose, que ocorre em muitas glicoproteí- nas, glicolipídios e polissacarídeos. Manose também é fosfori- lada por ATP pela hexoquinase, e a manose- 6 - fosfato assim produzida é convertida em frutose- 6 - fosfato pela fosfomanoi- somerase.
Galactóse entra na Glicólise atraves dó ca-
minhó de Lelóir
Uma rota um pouco mais complicada para a glicólise é seguida pela galactose, outra hexose simples. O processo, chamado de via Leloir em homenagem a Luis Leloir, seu descobridor, e co- meça com a fosforilação com ATP na posição C-1 pela galacto- quinase: FIGURA 22 Uma comparação da variação de energia livre para as reações da glicó- lise (passo 1 = hexoquinase) sob (a) condições de estado padrão e (b) condições intracelulares reais em eritrócitos. Os valores de ΔG°’ fornecem pouca informação sobre as variações reais de energia livre que ocorrem na glicólise. Por outro lado, em condições intracelulares, sete das reações glicolíticas operam quase equilíbrio (com ΔG perto de zero). A força motriz para a glicólise está nas reações da hexoqui- nase (1), fosfofrutoquinase (3) e piruvato quinase (10). A reação da lactato desidro- genase (passo 11) também exibe um grande ΔG negativo em condições celulares.
em indivíduos afetados, causando catarata e distúrbios neuro- lógicos permanentes. Esses problemas podem ser evitados removendo galactose e lactose da dieta. Em adultos, a toxici- dade da galactose parece ser menos grave, devido em parte ao metabolismo de galactose- 1 - P pela glicose UDP pirofosfori- lase que, aparentemente, pode aceitar galactose- 1 - P no lugar de glicose- 1 - P (Figura 26). Os níveis desta enzima podem au- mentar em indivíduos galactosêmicos, a fim de acomodar o metabolismo da galactose.
Uma deficiencia enzimatica causa intóle-
rancia a lactóse
Uma desordem metabólica muito mais comum, a intolerância à lactose, ocorre comumente na maioria das partes do mundo (exceções notáveis são algumas partes da África e do norte da Europa). A intolerância à lactose é uma incapacidade de dige- rir lactose devido à ausência da enzima lactase nos intestinos dos adultos. Os sintomas desse transtorno, que incluem diar- reia e desconforto geral, podem ser aliviados eliminando o leite da dieta.
Gliceról tambem póde entrar na glicólise
Glicerol é a última substância simples importante cuja capaci- dade de entrar na via glicolítica deve ser considerada. Este metabólito, que é produzido em quantidades substanciais pela decomposição dos triacilgliceróis, pode ser convertido em glicerol- 3 - fosfato pela ação da glicerol quinase e, em seguida, oxidado a diidroxiacetona fosfato pela ação da glicerol fosfato desidrogenase, com NAD+^ como a coenzima necessária. A dii- droxiacetona fosfato, assim produzida, entra na via glicolítica como substrato para a fosfato triose isomerase. 8 Cómó as celulas respóndem aó estresse hipóxicó? A glicólise é um caminho anaeróbico —não requer oxigênio. Mas, como observado na Figura 1, a operação do CAT depen- de do oxigênio, por isso é aeróbico. Quando o oxigênio é abundante, as células preferem o metabolismo aeróbico, que produz mais energia por glicose consumida. No entanto, como Louis Pasteur mostrou, quando o oxigênio é limitado, as célu- las se adaptam para aproveitar ao máximo a glicólise, a alter- nativa menos energética e anaeróbica. Nos tecidos de mamífe- ros, a hipóxia (limitação de oxigênio) pode causar alterações na expressão genética que resultam em aumento da angiogê- FIGURA 25 A reação da galactose- 1 - fosfato uridilil transferase envolve um mecanismo cinético de "ping-pong". FIGURA 24 Metabo- lismo da galactose através da via Leloir. FIGURA 26 A reação UDP-glicose pirofosforilase também funciona com galactose- 1 - P.
nese (o crescimento de novos vasos sanguíneos), aumento da síntese de glóbulos vermelhos e aumento dos níveis de algu- mas enzimas glicolíticas (e, portanto, uma maior taxa de glicó- lise). Qual é a base molecular para o aumento da expressão das enzimas glicolíticas? Um dos gatilhos para essa expressão é uma proteína de ligação de DNA chamada fator induzível por hipóxia (HIF). HIF é um heterodímero de uma subunidade nuclear constitutiva (HIF- 1 ) e uma subunidade induzível . Ambas as subunidades são fatores básicos de transcrição héli- ce-loop-hélice que se ligam a genes induzíveis por hipóxia e Lactose é um açúcar interessante em muitos aspectos. Em mamíferos placentários é sintetizado apenas na glândula mamária e apenas durante o final da gravidez e a lactação. A síntese é realizada pela lactose sintase, um complexo dimérico de duas proteínas: galactosil transferase e - lactalbumina. Galactosil transferase está presente em todas as células humanas e normalmente está envolvida na incorporação de galactose em glicoproteínas. No final da gravidez, a glândula pituitária no cérebro libera um hormônio proteico, a prolactina, que desencadeia a produção de -lactalbumina por certas células da mama. - Lactalbumina é uma proteína de 123 resíduos, associa-se com a galactosil transferase para formar lactose sintase, que catalisa a reação: A quebra pela lactase no intestino delgado fornece aos mamíferos recém-nascidos uma galactose essencial para muitos propósitos, incluindo a síntese de gangliosídeos no cérebro em desenvolvimento. A lactase é uma - galactosidase que quebra a lactose para produzir galactose e glicose - na verdade, a única enzima humana que pode cortar uma ligação - glicosídica: A lactase é uma enzima induzível em mamíferos e aparece no feto apenas durante os estágios finais da gestação. A atividade de lactase atinge o pico logo após o nascimento, mas dos 3 a 5 anos, ela diminui para um nível baixo em quase todas as crianças humanas. Baixos níveis de lactase tornam muitos adultos intolerantes à lactose. A intolerância à lactose ocorre comumente na maioria das partes do mundo (com a notável exceção de algumas partes da África e do norte da Europa; ver tabela). Os sintomas da intolerância à lactose, incluindo diarreia e desconforto geral, podem ser aliviados eliminando o leite da dieta. Alternativamente, os produtos que contêm -galactosidase estão disponíveis comercialmente. Certas bactérias, incluindo várias espécies de Lactobacillus, vivem da lactose no leite e realizam fermentação do ácido láctico, convertendo lactose em lactato via glicólise. Esta é a base da produção de iogurte que agora é popular no mundo ocidental, mas de origem turca. Outr as culturas também produzem iogurtes como alimentos. Tártaros nômades na Sibéria e na Mongólia usam leite de camelo para fazer koumiss, que era usado para fins medicinais. No Cáucaso, o kefir é feito de maneira muito parecida com o iogurte, exceto que a cultura inicial contém (além de Lactobacillus ) Streptococcus lactis e levedura, que convertem parte da glicose em etanol e CO 2 , produzindo uma bebida efervescente e ligeiramente intoxicante. Adaptado de Hill, R., and Brew, K., 1975. Lactose synthetase. Advances in Enzymology 43:411–485; and Bloch, K., 1994. Blondes in Venetian Paintings, the Nine-Banded Armadillo, and Other Essays in Biochemistry. New Haven, CT: Yale University Press. Lactóse — dó leite maternó aó iógurte — e intólera ncia a lactóse País Persistência da Lactase (5) Suécia 99 Dinamarca 97 Reino Unido (Escócia) 95 Alemanha 88 Austrália 82 Estados Unidos (Iowa) 81 Espanha 72 França 58 Índia 36 Japão 10 China (Singapura) 0 Adaptado de Bloch, K., 1994. Blondes in Venetian Paintings, the Nine-Banded Armadillo, and Other Essays in Biochemistry. New Haven, CT: Yale University Press.
