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UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA
AAna Paula Dias Ribeiro
Efeito da terapia fotodinâmica antimicrobiana sobre
culturas planctônicas e biofilmes de bactérias e
fungos utilizando curcumina e cloro-alumínio
ftalocianina veiculada por nanoemulsões
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reabilitação Oral
- Área de Prótese, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para obtenção do título de Doutor em Reabilitação Oral (Área de Concentração: Prótese).
Orientadora: Prof a^. Dr a^. Ana Cláudia Pavarina
Araraquara 2012
Ribeiro, Ana Paula Dias Efeito da terapia fotodinâmica antimicrobiana sobre culturas planctônicas e biofilmes de bactérias e fungos utilizando curcumina e cloro-alumínio ftalocianina veiculada por nanoemulsões / Ana Paula Dias Ribeiro.-- Araraquara: [s.n.], 2012. 162 f. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Ana Claudia Pavarina
- Fotoquimioterapia 2. Veículo farmacêutico 3. Cândida albicans
- Staphylococcus aureus 5. Staphylococcus aureus resistente à meticilina 6. Curcumina I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/ Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
Dados Curriculares
Ana Paula Dias Ribeiro
NASCIMENTO 5.7.1983 – Patos de Minas, Minas Gerais
FILIAÇÃO Paulo Cesar Ribeiro Márcia Helena Caixeta Dias Ribeiro
2001/2005 Graduação em Odontologia pela Universidade de Brasília-UnB 2006 Estágio de Atualização na disciplina de Prótese Parcial Fixa da Faculdade de Odontologia de Araraquara-UNESP 2007/2009 Curso de Pós-Graduação em Reabilitação Oral, Área de concentração em Prótese, nível de Mestrado, pela Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP 2008/2011 Estágio de Docência na disciplina de Prótese Parcial Removível da Faculdade de Odontologia de Araraquara-UNESP 2009/2012 Curso de Pós-Graduação em Reabilitação Oral, Área de concentração em Prótese, nível de Doutorado, pela Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP
DDedicatória
Dedico este trabalho...
À Deus,
Senhor, obrigada por todas as vitórias conquistadas, por todos os sonhos realizados, por todas as provações vencidas, por ser a razão do meu viver e o Deus da minha vida.
Hoje sei que fui capaz de chegar até aqui porque o Senhor esteve comigo sempre, pois tudo posso naquele que me fortalece...
“…Mas os que esperam no Senhor renovam as
suas forças, sobem com asas como águias, correm
e não se cansam, caminham e não se fatigam.”
Isaías 40.
DDedico este trabalho...
Às minhas irmãs Ana Cecília e Ana Luisa ,
Por serem meus presentes de Deus, meu dividir, meu compartilhar, meu compreender e meu respeitar as diferenças...
Ter vocês na minha vida fez toda diferença e se hoje sou o que sou é porque pude aprender com vocês. Obrigada por todas as alegrias e tristezas compartilhadas, pela amizade e amor e por sempre estarem ao meu lado. Amo vocês.
“Eu agora sei bem que os melhores brinquedos são os irmãos.
Brinquedos vivos, que dão e recebem, que nos fazem crescer e
crescem também pelas nossas mãos. Que se transformam depois em
grandes amigos para toda a vida, em companhia sempre presente de
uma maneira ou de outra, em refúgio e estímulo.”
Paulo Geraldo
DDedico este trabalho...
Ao meu amor Domingos,
Obrigada por todos esses anos que você compartilhou ao meu lado durante o curso de Mestrado e Doutorado. Obrigada pela paciência, companheirismo, lealdade e incentivo. Tenha certeza de que você e os nossos sonhos foram minha motivação maior e meu presente que hoje levo para viver ao meu lado. Amo você, meu amor, meu companheiro, meu amigo e meu futuro marido...
“O que há dentro do meu coração, eu tenho guardado pra te dar
E todas as horas que o tempo tem pra me conceder,
são tuas até morrer...
Te adoro em tudo, tudo, tudo, quero mais que tudo, tudo, tudo
Te amar sem limites, viver uma grande história
Aqui ou noutro lugar que pode ser feio ou bonito
Se nós estivermos juntos, haverá um céu azul
Um amor puro não sabe a força que tem
Meu amor eu juro ser teu e de mais ninguém ”
Djavan
Giampolo. Obrigada por me incentivarem a buscar sempre mais e pelo apoio durante
todo a pós-graduação.
Á Mariana Carvalho Andrade , minha amiga e companheira de todos os momentos
felizes e tristes. Você foi essencial para o desenvolvimento dessa tese. Obrigada por
dividir comigo todas as lutas e vitórias, por estar ao meu lado e por me incentivar
sempre! Ainda que a distância nos separe, você estará sempre no meu coração. Muito
obrigada!
À Julhiany , pela ajuda nas metodologias com citômetro de fluxo, pelas horas de
conversa no laboratório, pelos momentos de reflexão e discussão dos resultados.
Obrigada!
À Lívia , por todos os ensinamentos passados ao longo da pós-graduação, pelas
reflexões sobre o caminho acadêmico, pelo incentivo em buscar novos caminhos.
Muito obrigada pela disposição em ajudar!
Ao Fernando Primo , pela ajuda na formulação da ftalocianina e com todos os dados
referentes aos veículos farmacêuticos, as nanoemulsões. Muito obrigada!
Mais uma vez a minha querida família e ao meu amor. Com a ajuda de vocês e o
suporte emocional tudo ficou bem mais fácil. Amo vocês mais que tudo!
AAgradecimentos
À Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho” – UNESP , na pessoa de seu Diretor Prof. Dr. José
Claudio Martins Segalla e sua Vice-Diretora, Profa. Dra. Andréia Affonso Barreto
Montandon.
Ao Departamento de Materiais Odontológicos e Prótese da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP , representados pela Chefe de Departamento
Profa. Dra. Regina Helena Barbosa Tavares da Silva e pelo Vice-Chefe Prof. Dr.
Francisco de Assis Mollo Jr.
À Coordenação do Pós-Graduação em Reabilitação Oral da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP , representada pelo coordenador Prof. Dr.
Carlos Eduardo Vergani e pela Vice-coordenadora Profa. Dra. Ana Cláudia
Pavarina.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP , pela
concessão da bolsa de estudos de doutorado, pelo auxílio para realização do meu
estágio no exterior e pelo auxílio financeiro concedido para o desenvolvimento deste
projeto.
Aos docentes do curso de Pós-Graduação em Reabilitação Oral da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP, pela contribuição na minha formação
profissional.
Aos colegas da minha turma de Doutorado em Reabilitação Oral da Faculdade de
Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, Ana Lúcia, André,
Antônio, Cadu, Camilinha, Carol, Cris, Flávia Medeiros, Fe, Juliano, Paty e
Rodrigo , por todos os momentos divididos durante esses anos, pelo companheirismo,
pela amizade e pelo carinho.
À Profa. Dra. Silvana e ao Prof. Dr. Luiz André , pela recepção, carinho, confiança e
compreensão durante meu estágio na Carolina do Norte. Muito obrigada pela
oportunidade de realizar um sonho!
Ao Prof. Dr. Steven Offenbacher e toda sua equipe do laboratório, incluindo Russ,
Nicole, Joyce, David, Alan, Prof. Dr. Jim Back e Prof. Dr. Salvador Nares , pelo
carinho e por me receberem de portas abertas em seu laboratório.
Aos amigos Daniela Vivaldi, Daniela Mendonça e Gustavo. Muito obrigada pela
ajuda e por compartilhar a casa de vocês comigo durante os 3 meses longe da minha
família.
À toda minha família que acompanhou de pertinho todos esses anos.
À minha nova família de Taquaritinga. Obrigada por me fazerem me sentir em casa
e cuidarem tanto de mim.
A todas as pessoas que participaram direta ou indiretamente na realização desse
trabalho, e que não estão citadas nominalmente, meu sincero agradecimento.
“Não basta ter belos sonhos para realizá-los. Mas ninguém realiza grandes obras se não for capaz de sonhar grande. Podemos mudar o nosso destino, se nos dedicarmos à luta pela realização de nossos ideais. É preciso sonhar, mas com a condição de crer em nosso sonho; de examinar com atenção a vida real; de confrontar nossa observação com nosso sonho; de realizar escrupulosamente nossa fantasia. Sonhos, acredite neles."
Vladimir Ulianov Lênin
RResumo
Ribeiro APD. Efeito da terapia fotodinâmica antimicrobiana sobre culturas
planctônicas e biofilmes de bactérias e fungos utilizando curcumina e cloro-alumínio
ftalocianina veiculada por nanoemulsões [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade
de Odontologia da UNESP; 2012.
RResumo
Esta investigação teve os seguintes objetivos: 1. avaliar in vitro o efeito
da Terapia Fotodinâmica (PDT) utilizando diferentes concentrações de curcumina e
doses de luz LED na inativação de suspensões planctônicas de S. aureus resistente
(MRSA) e susceptível à meticilina (MSSA) e a citotoxicidade dos parâmetros
antimicrobianos dessa terapia em cultura celular de fibroblastos; 2. o efeito
fotodinâmico da cloro-alumínio ftalocianina (ClAlFt) veiculada em nano-emulsão
catiônica e aniônica e comparar com ClAlFt diluída em solvente orgânico na
inativação da C. albicans quando em suspensão planctônica e organizados em
biofilmes; 3. o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica utilizando a cloro-
alumínio ftalocianina em sistema de nanoemulsão em culturas planctônicas e
biofilmes de bactérias gram-positivas (MSSA e MRSA). No primeiro estudo,
suspensões de MSSA e MRSA foram tratadas com diferentes concentrações de
curcumina (entre 0,1 a 20,0 μM) e expostas a diferentes fluências de LED azul (18; 25
e 37,5 J/cm^2 ). Em seguida, diluições seriadas foram obtidas e alíquotas de 25 μl de
cada diluição foram plaqueadas em meio de cultura Mannitol Salt Agar. Após o
período de incubação de 48 horas a 37°C, as unidades formadoras de colônias foram
determinadas (UFC/mL). Para as células L929, essas foram incubadas por 20 minutos
com curcumina e irradiadas em seguida com LED (37,5 J/cm^2 ). A viabilidade celular
após a PDT foi avaliada utilizando o teste de MTT e as alterações morfológicas foram
avaliadas pela microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados foram
submetidos à análise descritiva, Análise de Variância (ANOVA) e post hoc de Tukey
(α= 5%). As concentrações de 5, 10 e 20 μM resultaram em completa inativação do
MSSA quando associadas a qualquer fluência de energia avaliada. Entretanto,
somente a concentração de 20 μM associadas a dose de luz de 37,5 J/cm^2 resultou em
completa inativação do MRSA. Essa associação resultou em 80% de redução dos
fibroblastos. Além disso, alterações na morfologia celular foram observadas,
foi dependente do veículo, carga superficial e dose de luz. A NE catiônica e a ClAlFt
livre causaram completa inativação de ambas as cepas de S. aureus. Para os biofilmes,
a NE catiônica reduziu em cerca de 80 e 73% o metabolismo celular da cepa
susceptível e da resistente, respectivamente. A NE aniônica, apesar de reduzir em
cerca de 4 log e 1 log o número de UFC/mL para o MSSA e MRSA, respectivamente,
não causou redução do metabolismo dos biofilmes do MRSA mesmo quando
associada a maior dose de luz avaliada. Esses resultados sugerem que a NE catiônica
representa uma veiculação viável para inativação de fungos e bactérias, incluindo
cepas resistentes aos tratamentos convencionais.
Palavras chave: Fotoquimioterapia, Veículo Farmacêutico, Candida albicans ,
Staphylococcus aureus , Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina , Curcumina.
Abstract
